本发明是基于对商品化多引物rca试剂盒的改良，涉及一种提高改良多引物rca特异性的方法。
背景技术：
滚环扩增(rollingcircleamplification，多引物rca)是1998年建立的一种体外等温核酸扩增方法。该方法借鉴了环状病原微生物dna分子的滚环复制方式，实现环状dna的高速循环复制。作为一种有效的dna扩增工具，rca具有很多的优势。如对设备要求低，操作简单，检测所有感染体中环型dna成分，不需要知道任何的基因序列信息等特点。目前rca技术已经被广泛的应用于dna测序，蛋白质表达，生物传感器，诊断，药物发现和纳米技术等。
滚环扩增主要利用了具有稳定性强和链置换活性的dna聚合酶，如phi29dna聚合酶、bstdna聚合酶等。根据寡核苷酸引物的数量和种类，滚环扩增又可分为线性扩增(linear多引物rca，l多引物rca)、指数扩增(hyperbranched多引物rca，h多引物rca)、多引物滚环扩增(multiply-primed多引物rca)和锁式探针扩增(ligation-多引物rca，l多引物rca)等。其中，多引物rca主要利用了phi29dna聚合酶和引物六聚体，实现对不同的核酸分子进行扩增，如质粒、人工细菌染色体(bacteriaartificialchromosome,bac)、粘粒等大的环状dna等，同时也可以扩增未知序列的环状dna和无法克隆的环状模板，产物为双链，可用于测序、酶切、克隆、标记和检测等方面，市售的templiphitmdna测序模板扩增试剂盒即应用了多引物rca技术。
多引物rca技术已得到广泛应用，但该技术仍存在一定的不足。尤其是当反应体系中的dna模板复杂或含量很低时，大量引物不能与模板有效配对，引物之间易形成二聚体结构，导致错配的产生，产生大量非特异性扩增产物，降低了目的dna的滚环扩增效率。这一点，即使我们使用优化过的反应条件(比如：使用修改过的随机引物)，非特异性扩增产物也不能被完全消除，特别是，当多引物rca体系中不含有或含有少量的dna，非特异性扩增现象依然存在。目前，据文献报道，有一种利用突变的单链dna结合蛋白tthssb来改善多引物rca扩增的方法。该方法是将突变tthssb蛋白加入到市售的多引物rca试剂盒体系中(templiphitmdna测序模板扩增试剂盒)，提高了多引物rca的扩增特异性同时消减了多引物rca非特异性扩增的现象。因tthssb蛋白具备单链结合蛋白(single-strandednucleicacidbindingprotein，ssb)的特性，在多引物rca反应过程中，通过与体系中的单链dna结合，不仅使得单链dna保持稳定，防止其重新配对成双链或被核酸酶降解，还能促进同源的核苷酸链互补配对，从而实现了对多引物rca技术的优化。但是，该文献中没有明确的指出蛋白的用量，同时该方法需要先纯化出有活性的tthssb蛋白，步骤繁琐、费时费力，价格昂贵，同时不利于运输和保存，在实际应用中相对困难。因此，本申请人对此进行深入研究，旨在开发一种容易应用，简单、廉价、快速、高效的提高多引物rca扩增特异性的方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种提高多引物rca特异性的方法，该方法可高效地扩增目标核酸序列。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种提高多引物rca特异性的方法，包括以下步骤：
(1)配置浓度为0.1mg/ml的peg8000溶液，备用；
(2)变性：以puc19-hupb重组质粒dna作为模板，在5ulddh2o中加入1ngpuc19-hupb重组质粒dna，混匀后，95℃加热3min，然后冷却至室温或4℃，获得变性样品液；
(3)培育：将2ul的2.5mmdntp，2ul的10×bsa，1ul的phi29dna聚合酶buffer，以及0.2ul的templiphitmdna测序模板扩增试剂盒中的phi29dna酶混合液，混匀，置于冰上，得到预混合酶液；将5ul预混合酶液加入所述变性样品液中，混匀，得到多引物rca反应液；在此多引物rca反应液中加入0～1.6ul的所述peg8000溶液，然后于30℃下水浴4-18h；65℃加热10min，冷却至4℃，得到改良的多引物rca扩增产物。
采用上述方案后，本发明的优点在于：其通过改良商品化多引物rca试剂盒templiphi(amershambiosciences)中的各成分含量，替换成市面上容易购买并且价格低廉的2.5mmdntp、10×bsa和phi29dna聚合酶buffer，得到改良的多引物rca反应液，然后在改良的多引物rca反应液中加入一定浓度的peg8000溶液，可以减少非特异性扩增，显著提高滚环扩增的特异性，填补了多引物rca反应中一直以来难以克服的非特异性扩增拖尾现象，实现了对市售多引物rca试剂盒(templiphitmdna测序模板扩增试剂盒)的进一步优化。
附图说明
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
图1是本发明在改良的多引物rca体系中分别加入0.5ul和1ul的peg8000溶液后与试剂盒多引物rca对比的电泳检测示意图；
图2是本发明中不同含量的peg8000溶液对改良的多引物rca扩增特异性影响情况的电泳示意图；
图3是本发明中单酶切鉴定改良的多引物rca产物质量情况的电泳示意图；
图4是本发明中pcr鉴定改良的多引物rca产物质量情况的电泳示意图；
图5是本发明中不同含量的peg8000溶液对改良的多引物rca扩增产物的数据统计图。
具体实施方式
实施例1：改良多引物rca体系
一种提高多引物rca特异性的方法，包括以下步骤：
(1)配置浓度为0.1mg/ml的peg8000(聚乙二醇8000)溶液，备用；
(2)变性：以puc19-hupb重组质粒dna作为模板，在5ulddh2o中加入1ngpuc19-hupb重组质粒dna，混匀后，95℃加热3min，然后冷却至室温或4℃，获得变性样品液；其中，重组质粒puc19-hupb的基因序列如序列表中seqidno：2所示。
(3)培育：将2ul的2.5mmdntp，2ul的10×bsa，1ul的phi29dna聚合酶buffer，以及0.2ul的templiphitmdna测序模板扩增试剂盒中的phi29dna酶混合液(该酶混合液包括phi29dna聚合酶和引物六聚体)，混匀，置于冰上，得到预混合酶液；将5ul预混合酶液加入所述变性样品液中，混匀，得到多引物rca反应液；在多引物rca反应液中加入0～1.6ul的所述peg8000溶液，然后于30℃下水浴4-18h；65℃加热10min，冷却至4℃；得到改良的多引物rca扩增产物。
本实施例中，使用amershambiosciences公司的templiphitmdna测序模板扩增试剂盒，按照试剂盒的说明进行操作作为对照组；并且在本发明方法的步骤(3)中，所述peg8000溶液的用量分别选取0.5ul和1ul，进行效果比较。
多引物rca扩增产物检测：取3ul所述改良的多引物rca扩增产物以1％(w/v)琼脂糖凝胶为电泳支持介质，在1×tae和90v电压下电泳40min，然后在0.5μg/ml溴化乙锭染色液中染色15min，用紫外透射仪观察，具体实验结果见图1。
上述各多引物rca扩增产物的电泳结果见图1，图1中各泳道表示：
m为1kbdnaladdermarker；
3为市售多引物rca试剂盒的滚环扩增情况；
2表示在改良的多引物rca反应体系中加入1ul的0.1mg/ml的peg8000溶液；
1表示在改良的多引物rca反应体系中加入0.5ul的0.1mg/ml的peg8000溶液。
由图1可以看出，市售的多引物rca试剂盒出现显著的非特异性拖尾现象，而改良的多引物rca中2泳道与1泳道，拖尾现象显著减弱。说明本发明方法可显著的减少多引物rca反应中出现的非特异性扩增现象。
实施例2：peg8000对改良多引物rca特异性的影响(以重组质粒puc19-hupb为模板)
一种提高多引物rca特异性的方法，包括以下步骤：
1、重组质粒puc19-hupb的构建：将来源于大肠杆菌的hupb基因插入puc19质粒中，并通过菌落pcr、酶切鉴定及测序验证，得到重组质粒puc19-hupb；其中，大肠杆菌的hupb的基因序列如序列表中seqidno：1所示。
2、变性：以puc19-hupb重组质粒dna作为模板，在5ulddh2o中加入1ngpuc19-hupb重组质粒dna，混匀后，95℃加热3min，然后冷却至室温或4℃，获得变性样品液；
3、培育：将2ul的2.5mmdntp，2ul的10×bsa，1ul的phi29dna聚合酶buffer，以及0.2ul的templiphitmdna测序模板扩增试剂盒中的phi29dna酶混合液(该酶混合液包括phi29dna聚合酶和引物六聚体)，混匀，置于冰上，得到预混合酶液；将5ul预混合酶液加入所述变性样品液中，混匀，得到多引物rca反应液；在多引物rca反应液中加入0.1mg/ml的peg8000溶液0～1.6ul，然后于30℃下水浴4-18h；65℃加热10min，冷却至4℃；得到改良的多引物rca扩增产物。
本实施例中，在步骤(3)中，所述peg8000溶液的用量分别选取0、0.1、0.2、0.4、0.8和1.6ul，进行效果比较。
多引物rca扩增产物检测：取3ul所述改良的多引物rca扩增产物以1％(w/v)琼脂糖凝胶为电泳支持介质，在1×tae和90v电压下电泳40min，然后在0.5μg/ml溴化乙锭染色液中染色15min，用紫外透射仪观察，具体实验结果见图2。
图2中各泳道表示：
m为1kbdnaladdermarker；
6，5，4，3，2，1分别表示在反应体系中加入0.1mg/ml的peg8000溶液0、0.1、0.2、0.4、0.8和1.6ul。
由图2可以看出：以重组质粒puc19-hupb为模板时，随着加入的peg8000的量的增加，dna条带逐渐变粗、变亮，dna滚环扩增的特异性提高，尤其是非特异性扩增的拖尾现象显著减少。
实施例3：单酶切鉴定改良多引物rca产物质量(以重组质粒puc19-hupb为模板)
一种提高多引物rca特异性的方法，包括以下步骤：
1、重组质粒puc19-hupb的构建：将来源于大肠杆菌的hupb基因插入puc19质粒中，并通过菌落pcr、酶切鉴定及测序验证，得到重组质粒puc19-hupb；
2、变性：以puc19-hupb重组质粒dna作为模板，在5ulddh2o中加入1ngpuc19-hupb重组质粒dna，混匀后，95℃加热3min，然后冷却至室温或4℃，获得变性样品液；
3、培育：将2ul的2.5mmdntp，2ul的10×bsa，1ulofphi29dna聚合酶buffer，以及0.2ul的templiphitmdna测序模板扩增试剂盒中的phi29dna酶混合液(该酶混合液包括phi29dna聚合酶和引物六聚体)，混匀，置于冰上，得到预混合酶液；将5ul预混合酶液加入所述变性样品液中，混匀，得到多引物rca反应液；在多引物rca反应液中加入0.5ul的0.1mg/ml的peg8000溶液；多引物rca反应液分别于30℃下水浴4-18h；65℃加热10min，冷却至4℃；得到改良的多引物rca扩增产物。
将所述改良的多引物rca扩增产物，市售多引物rca试剂盒反应产物，puc19-hupb质粒分别用fastdigestecori(thermoscientific)进行酶切试验验证。
多引物rca扩增产物检测：取3ul所述改良的多引物rca扩增产物以1％(w/v)琼脂糖凝胶为电泳支持介质，在1×tae和90v电压下电泳40min，然后在0.5μg/ml溴化乙锭染色液中染色15min，用紫外透射仪观察，具体实验结果见图3。
图3各泳道表示：
m为1kbdnaladdermarker；
3为市售多引物rca试剂盒的滚环扩增产物酶切情况；
2表示puc19-hupb质粒的酶切情况；
1表示在本发明的多引物rca反应体系中加入0.5ul的0.1mg/ml的peg8000溶液后产物酶切情况。
由图3可以看出：以重组质粒puc19-hupb为模板时，改良的多引物rca扩增产物经酶切后片段大小与puc19-hupb质粒酶切片段大小一致，说明改良的多引物rca可以正确的扩增puc19-hupb质粒，与试剂盒rca反应产物相比非特异性扩增的拖尾现象显著减少。
实施例4：pcr鉴定改良多引物rca产物质量(以重组质粒puc19-hupb为模板)
一种提高多引物rca特异性的方法，包括以下步骤：
1、重组质粒puc19-hupb的构建：将来源于大肠杆菌的hupb基因插入puc19质粒中，并通过菌落pcr、酶切鉴定及测序验证，得到重组质粒puc19-hupb；
2、变性：以puc19-hupb重组质粒dna作为模板，在5ulddh2o中加入1ngpuc19-hupb重组质粒dna，混匀后，95℃加热3min，然后冷却至室温或4℃，获得变性样品液；
3、培育：将2ul的2.5mmdntp，2ul的10×bsa，1ulofphi29dna聚合酶buffer，以及0.2ul的templiphitmdna测序模板扩增试剂盒中的phi29dna酶混合液(该酶混合液包括phi29dna聚合酶和引物六聚体)，混匀，置于冰上，得到预混合酶液；将5ul预混合酶液加入所述变性样品液中，混匀，得到多引物rca反应液；在多引物rca反应液中加入0.5ul的0.1mg/ml的peg8000溶液，然后于30℃下水浴4-18h；65℃加热10min，冷却至4℃；得到改良的多引物rca扩增产物。
pcr操作：5′-aggatccatatgaccaagtcagaattgatag-3′(hupb上游引物)5′-tacccggaattcttaaccgtaaatattg-3′(hupb下游引物)。10ul的体系中包含02.ul改良的多引物rca产物(模板)，5ul的2×phusionmastermix(thermoscientific)和5pmol的引物，其余用ddh2o补齐；pcr反应温度：一个循环95℃1min；34个循环95℃30s,55℃30s,72℃30s；最后72℃5min；使用的是abiproflextmpcr(applicationbiosystems,usa)。
多引物rca扩增产物检测：取3ul所述改良的多引物rca产物以1％(w/v)琼脂糖凝胶为电泳支持介质，在1×tae和90v电压下电泳40min，然后在0.5μg/ml溴化乙锭染色液中染色15min，用紫外透射仪观察，具体实验结果见图4。
图4各泳道表示：
m为1kbdnaladdermarker；
1，2，3，4，5分别为重复了5次以改良的多引物rca产物为模板的pcr结果。
由图4可以看出：pcr条带大小与hupb基因大小一致，说明改良多引物rca可以准确的扩增重组质粒puc19-hupb。
实施例5：peg8000对改良多引物rca效率影响的数据统计(以重组质粒puc19-hupb为模板)
一种提高多引物rca特异性的方法，包括以下步骤：
1、重组质粒puc19-hupb的构建：将来源于大肠杆菌的hupb基因插入puc19质粒中，并通过菌落pcr、酶切鉴定及测序验证，得到重组质粒puc19-hupb；
2、参照实施例2步骤2的方法，制备21管变性样品液。
3、参照实施例2步骤3的方法，制备21管多引物rca反应液，其中每3管为一组，向每组中分别加入peg8000溶液(0.1mg/ml)0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6和3.2ul，在30℃下水浴4-18h；65℃加热10min，冷却至4℃，得到含有peg8000不同含量的改良的多引物rca扩增产物。
数据统计：利用uv/visible蛋白核酸分析仪(biomate3fromthermofisherscientific)对每组改良的多引物rca反应产物进行含量测定。结果如图5所示。
由图5可以看出：以重组质粒puc19-hupb为模板时，电泳条件下所展现的图像与数据统计的结果呈现相似的结果，随着加入的peg8000溶液的量的增加，dna条带逐渐变粗、变亮，dna滚环扩增特异性显著提高，不同之处在于随着peg8000溶液的量继续增加，多引物rca反应产物出现减少的情况，说明peg8000对多引物rca反应的增强效果存在一定的计量依赖。
总结：本发明通过对试剂盒多引物rca反应体系进行改良，并添加一定浓度的peg8000溶液，不仅可以显著的减少多引物rca反应中常见的非特异性扩增出现的拖尾现象，而且可以将分散在体系中的目标dna模板和随机引物聚集起来，提高了多引物rca各组分的相对浓度，增加了目标核酸模板和引物之间的配对几率，从而实现对目标核酸序列的特异性的增强，在很大程度上解决了多引物rca技术反应速度慢、灵敏度低、非特异扩增严重等问题。总之，本发明可以显著地减少非特异性扩增现象，提高滚环扩增的特异性，增强滚环扩增的灵敏度，实现了对市售多引物rca试剂盒的显著优化。
序列表
<110>华侨大学
<120>一种提高多引物rca特异性的方法
<160>2
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>273
<212>dna
<213>大肠杆菌的hupb
<400>1
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gcaggtaaagcactgaaagacgcggtaaactaa273
<210>2
<211>2966
<212>dna
<213>重组质粒puc19-hupb
<400>2
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