一种用于检测犬圆环病毒的引物和高效CL‑RCA‑PCR检测试剂盒及方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测犬圆环病毒的引物、试剂盒及检测方法。

背景技术：

犬圆环病毒(Dog circovirus，DogCV，又称Canine circovirus，CCV)是圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)成员，是一类无囊膜、单链环状DNA病毒。2012年，Kapoor A等首次在犬血清样品(6/205)发现一种新型哺乳动物圆环病毒，将其命名为CaCV-1，并测定其全基因组序列。DogCV基因组长度约为2Kb，包含两个主要的开放阅读框(ORFs)，ORF1编码复制酶Rep蛋白，ORF2编码衣壳Cap蛋白。为了避免与已有的金丝雀圆环病毒(Canary c ircovirus)和犬杯状病毒(canine cal ic ivirus)混淆，研究者建议将该病毒命名为DogCV。随后，DogCV陆续在美国和意大利被发现，并证实这种新的哺乳动物圆环病毒是引起犬坏死性血管炎、淋巴结肉芽肿和肠道综合症的致病因子之一。

目前已报导的圆环病毒感染严重危害动物健康。在禽类中，圆环病毒感染能引起喙异常、嗜睡、厌食和鹅死亡的现象；在养猪业中，猪环病毒2型(PCV2)引起PMWS、呼吸和肠道疾病，皮炎与肾病综合症和繁殖障碍等问题，导致重大经济损失；在狐狸中，圆环病毒感染主要侵染神经系统，引起狐狸的淋巴浆细胞性脑膜脑炎。而Dogcv作为一种新的圆环病毒，其危害性也逐渐被人们认识。2013年Li等利用Real t ime PCR方法检测了病犬和健康犬感染和携带DogCV的情况，发现腹泻犬和健康犬粪便阳性率分别为11.3％(19/168)和6.9％(14/204)；患血小板减少症、中性粒细胞减少症、不明发热症状或被蜱叮咬过的犬血清阳性率为3.3％(19/409)。结合病理剖检、原位杂交和电镜检查结果表明，DogCV与PCV2感染在临床症状和病理变化上均非常相似，主要侵害淋巴细胞，并能在淋巴细胞或巨噬细胞胞浆内形成包涵体，推测该病毒单独或与其它病原体共感染造成犬疾病和死亡。2014年Nicola等在对2009年采集样品进行回溯性调查就检测出了该病毒。2016年Han等也利用Real t ime PCR方法对于2012年6月-2014年6月从台湾地区收集的犬样品进行了检测，结果发现腹泻犬和健康犬粪便阳性率分别为28.0％(58/207)和11.9％(19/160)。同年，Thai等发现DogCV与犬细小病毒2(CPV-2)存在共感染，且利用原位杂交技术(In s i tu hybridi zat ion，ISH)在犬淋巴组织的细胞质和细胞核中检测到大量的犬圆环病毒核酸，并发现DogCV感染的犬只出现淋巴细胞耗竭现象，这可能表明DogCV能引起免疫抑制。随后，孙文超等采用重叠PCR技术首次获得DogCV中国流行毒株的全基因组序列，且通过遗传进化树分析显示该毒株与在美国、欧洲流行的毒株处于不同的分支。

因而，对国内犬开展该病毒的检测及其基因组分析刻不容缓，常规PCR更适用于不具备荧光定量PCR仪的检测条件。然而使用已报道的PCR引物对犬血液样品进行检测存在不敏感或特异性低的缺点，推测可能是犬圆环病毒的靶核酸信号低、引物与病毒靶基因不匹配或病毒DNA含量低等原因导致。因此建立设计一种特异性的引物和新的DogCV常规PCR检测与连接封闭(completion and ligation，CL)、体外滚环扩增(Rolling-circle amplification，RCA)组合方法，以实现对国内DogCV毒株快速、可靠的检测。

圆环病毒基因组是单链闭合环状的DNA，通过滚环复制完成其基因组的复制。圆环病毒侵入细胞后，单链闭合环状的DNA被补上互补链形成其双链的复制中间体(dsDNA)，而转录酶翻译出来的Rep蛋白可以在双链DNA上打一个缺口(nick)，形成开环dsDNA，然后借助细胞核的DNA多聚酶，以滚环复制(rolling circle replication，RCR)的方式来复制圆环病毒基因组(线性互补DNA)，最终通过细胞内连接酶完成单链基因组的连接闭合。圆环病毒感染后中可能存在4种DNA形式：单链闭合环状DNA、闭合dsDNA、开环dsDNA、不闭合线性DNA。

滚环扩增是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法。需以环状DNA为模板，通过一个短的、与部分环状模板互补的六聚体随机引物，在DNA聚合酶作用下将dNTPs转变成延伸的单链DNA，产生一条具有大量重复的模板互补片段的线性单链。已有研究表明利用RCA技术能够放大环状DNA病毒的核酸信号，而且病毒样品经RCA后，可将其产物做为模板再进行PCR，这样病毒检出率更高，表明RCA-PCR比常规PCR检测灵敏性更高。但目前还没有利用该原理检测犬圆环病毒的引物、试剂盒及检测方法。

技术实现要素：

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种用于检测犬圆环病毒的引物和高效CL-RCA-PCR检测试剂盒及方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述用于检测犬圆环病毒的引物如下：

DogCV-D-F：GTGCTTCACCATCAATAATCCTACT(SEQ ID NO.1)；

DogCV-D-R：AGACTGAGCCGCCGATAGAG(SEQ ID NO.2)。

所述高效CL-RCA-PCR检测试剂盒中包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物，还包括随机引物。所述试剂盒中还包括离心吸附柱、溶液A、溶液B、溶液C、溶液D、CL反应试剂、RCA反应试剂、PCR反应试剂、DNA Marker、TAE缓冲液、溴化乙锭、琼脂糖、阳性对照为DogCV阳性的DNA样本、阴性对照为DogCV阴性的DNA样本；所述溶液A由150mM Tris-NH₄Cl、10mM KHCO₃、1mM Na₂EDTA组成，所述溶液B由10mMTris-HCl、10％的SDS、750mM CH₆ClN₃组成，所述溶液C为体积百分比浓度为70％的C₂H₅OH，所述溶液D由10mM Tris-HCl和1mM EDTA组成。

所述检测犬圆环病毒的方法是利用上述试剂盒，先通过T4DNA polymerase和T4DNAligase对样本中圆环病毒的开环dsDNA和不闭合线性DNA进行连接封闭成为闭合环状结构，使样品中环状DNA的模板数量增加，然后再将CL产物进行RCA扩增，最大化的富集犬圆环病毒的靶核酸，最后将此CL‐RCA产物为模板，进行常规PCR检测。

下面对本发明作进一步说明：

本发明试剂盒包含：

1.DNA提取试剂盒，其中的成分包括以下几种成分：

1)离心吸附柱

2)溶液A

Tris-NH₄Cl 150mM

KHCO₃ 10mM

Na₂EDTA 1mM

3)溶液B

Tris-HCl 10mM

SDS 10％(M/V，M的单位为g，

V的单位为mL)

CH₆ClN₃ 750mM

4)溶液C

C₂H₅OH 70％(V/V)

5)溶液D

Tris-HCl 10mM

EDTA 1mM

2.CL反应试剂

Phi29DNA聚合酶缓冲液(购自New England Biolabs公司，美国)，0.1mg/mL BSA，0.5mM dNTP，l mM ATP，1.5U T4DNA polymerase(NEB公司，美国)，200U T4DNAligase(NEB公司，美国)

3.RCA反应试剂

pUC19质粒(阳性对照)，样品缓冲液(10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA)，反应缓冲液【330mM Tris-acetate，100mM Mg-acetate，660mM K-acetate，1％(v/v)Tween-20，10mM DTT，30pmol随机引物5’-NNNNNN-3’】，phi29DNA聚合酶(购自Thermo Scientific公司)

4.PCR反应试剂，其中2×EasyTaq PCR SuperMix中含有2.5mM dNTP，10×PCR Buffer(500mM KCL，100mM Tris-Cl，15mM MgCl₂)，6×Loading Buffer与1.5U EasyTaq DNA聚合酶(购自北京全式金生物技术有限公司)。

5.DNA Marker(购自北京艾德莱生物技术有限公司)。

6.TAE缓冲液(40mM Tris，2mM Na₂EDTA.2H₂O，20mM CH₃COOH)

7.溴化乙锭(购自北京博奥拓达科技有限公司)

8.琼脂糖(购自Biowest公司)

9.引物序列(5’-3’)：DogCV-D-F，GTGCTTCACCATCAATAATCCTACT(SEQ ID NO.1)；DogCV-D-R，

AGACTGAGCCGCCGATAGAG(SEQ ID NO.2)

10.阳性对照为DogCV阳性的DNA样本(GenBank登录号KT734828.1)

11.阴性对照为DogCV阴性的DNA样本。

利用RCA方法放大犬圆环病毒的靶核酸信号的最为关键的步骤是闭合环状DNA的模板。本发明先通过T4DNA polymerase和T4DNA ligase，对样本中圆环病毒的开环dsDNA和不闭合线性DNA进行连接封闭(completion and ligation，CL)成为闭合环状结构，使样品中环状DNA的模板数量增加，然后再将CL产物进行RCA扩增，最大化的富集犬圆环病毒的靶核酸，最后将此CL-RCA产物为模板，进行常规PCR检测。该CL-RCA-PCR方法能够检测到普通PCR和RCA-PCR检测中没有检测到的健康犬DNA样本中的圆环病毒。表明CL-RCA-PCR比常规PCR和RCA-PCR检测灵敏性更高。

总之，本发明提供了一种用于检测犬圆环病毒的引物以及包含该引物的试剂盒及针对不同样本的检测方法，利用该试剂盒及检测方法检测犬圆环病毒具有准确性高、特异性强、灵敏性高等特点。

附图说明

图1为引物信息分析附图；

A1、A2为25株DOGCV全长序列比对后特异性引物A上下游引物所处的位置，

B1、B2为25株DOGCV全长序列比对后特异性引物B上下游引物所处的位置，

C1、C2为25株DOGCV全长序列比对后特异性引物C上下游引物所处的位置，

D1、D2为25株DOGCV全长序列比对后特异性引物D上下游引物所处的位置；

图2为不同引物PCR对DogCV阳性样品检测结果的比较示意图；M：DL 2000Maker；1，2，3为检测的DogCV阳性样品；

图3为健康犬样本的CL-RCA-PCR与RCA-PCR检测结果示意图；M1:DL 5000maker；P:pUC19质粒M2：DL 2000Maker；A:1.DogCV阴性样本的CL-RCA产物；2.健康犬DogCV阳性DNA样本的的RCA产物；3.健康犬DogCV阳性DNA的CL-RCA产物；B:1.DogCV阴性DNA样本的CL-RCA-PCR检测；2.健康犬DogCV阳性DNA样本的RCA-PCR检测；3.健康犬DogCV阳性DNA的CL-RCA-PCR检测；

图4为腹泻犬样本的PCR检测结果示意图；M:DL 2000Maker；N:阴性，1，2为DogCV阳性样品。

具体实施方式

1.方法与结果

1.1引物设计

根据GenBank中25个DogCV全基因组序列保守区域进行比对，利用Primer 5.0设计了4对引物特异性引物，分别为引物A、引物B、引物C、引物D(表1)。并利用在线网站http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/以及DNAMan软件分析引物的同源性(图1)。

表1 DogCV PCR引物序列

其中，CGTGACACTGAATGGCGTTTG(SEQ ID NO.3)，GCAGAGACCCCGTTGCTATG(SEQ ID NO.4)，GATGTGGAAGACGGAAGTGGAG(SEQ ID NO.5)，

ACGCCATTCAGTGTCACGAGT(SEQ ID NO.6)，GTGACACTGAATGGCGTTTG(SEQ ID NO.7)，CACTAACCACATCCCGTTCAT(SEQ ID NO.8)，

GTGCTTCACCATCAATAATCCTACT(SEQ ID NO.1)，AGACTGAGCCGCCGATAGAG(SEQ ID NO.2)。

1.2 PCR方法的体系建立

1.2.1 DNA的提取

利用DNA提取相关试剂从犬血液中提取DNA，具体步骤如下：

1.在200-500ul抗凝血或者新鲜血液中加入500ul溶液A，吹吸混匀。

2.12000rpm离心5min，弃去上清。

3.在含有沉淀的离心管中加入500ul溶液B，将沉淀充分悬浮并吹吸均匀，室温静置2-3min，溶液清亮后将其转移到离心吸附柱中静止3-5min。

4.12000rpm离心30s，弃去收集管中的废液

5.加入700ul溶液C，12000rpm离心30s，弃去收集管中的废液

6.再次重复步骤5

7.13000rpm再离心2min

8.将离心吸附柱置于新的1.5mL的离心管中，加入30-50ul溶液D静止2min，13000rpm离心1min收集洗脱的DNA溶液，保存于-20℃备用。

1.2.2 PCR反应体系

PCR反应体系为(25ul)如下：

在PCR管中混匀后放入ABI Veriti梯度PCR仪(购自Life Technologies公司)，反应条件设置为：94℃5min，之后94℃30s，(53℃-63℃)30s，72℃20s运行35个循环，72℃7min，4℃保存。

1.2.3琼脂糖凝胶电泳检测

量取25ml TAE溶液，加入0.25g琼脂糖，混匀后于微波炉加热1min，冷却至60℃后加入1ul溴化乙锭，将混匀后的溶液加入制胶槽中凝固。取5ul PCR产物与1ul6×Loading Buffer混匀后加入单一的泳道中，另取5ul DNA Marker加入的其它泳道中来判断PCR产物的大小。

1.3不同引物PCR方法的比较

对不同PCR方法进行验证，在PCR管中加入12.5ul 2×EasyTaq PCR SuperMix，9.5ulddH₂O与1ul DogCV阳性DNA，再往不同的PCR管中分别引物A、引物B、引物C、引物D的上下游引物各1ul，反应总体积25ul。在PCR管中混匀后放入ABI Veriti梯度PCR仪(购自Life Technologies公司)，反应条件设置为：94℃5min，之后94℃30s，(53℃-63℃)30s，72℃20s运行35个循环，72℃7min，4℃保存。利用琼脂糖凝胶电泳进行检测PCR产物，确定引物A、引物B、引物C、引物D的最佳退火温度。确定了各对引物的最佳反应条件后，利用引物A、引物B、引物C、引物D检测临床样本，验证不同PCR方法的准确性。

1.4 PCR特异性分析

分别将犬瘟和犬冠状病毒阳性cDNA样本、犬细小病毒阳性DNA样本分别用引物D进行检测，通过观察是否有目的条带来确认该PCR方法的特异性。

1.5 PCR敏感性分析

通过对重组DogCV基因组(GenBank登录号KT734828.1)的阳性质粒Psp72进行连续8次的10倍梯度稀释，检测连续10倍梯度稀释的样品，确定该PCR方法检测的灵敏度，质粒拷贝数公式为：拷贝数copies/ul＝(6.02×10²³copies)×(质粒浓度ng/ul×10^-9)/(碱基数目×660daltons/bp)。在PCR管中加入12.5ul 2×EasyTaq PCR SuperMix，1ul 10uM上游引物，1ul 10uM下游引物与9.5ul ddH₂O，再往不同的PCR管中分别加入1ul不同稀释浓度的DNA，反应总体积为25ul。反应条件设置为：94℃5min，之后94℃30s，58℃30s，72℃20s运行35个循环，72℃7min，4℃保存。利用琼脂糖凝胶电泳进行检测PCR产物。

1.6健康犬血液DNA的CL-RCA-PCR检测

1.6.1 DogCV基因组CL-RCA扩增

为了排除健康犬携带了微量DogCV而漏检的情况，保证检测的准确性，对样本中圆环病毒的开环dsDNA和不闭合线性DNA进行CL成为闭合环状结构，然后再将CL产物进行RCA扩增，使得微量的基因组能够富集起来，从而能够达到被检测水平。

1)CL反应

将从健康犬血液中提取出来的DNA进行CL反应。在反应体系中加入5ul DNA，8ul Phi29DNA聚合酶缓冲液，7ul 0.1mg/mL BSA，0.5mM dNTP，l mM ATP，1.5U T4DNApolymerase和200U T4DNA ligase，将上述反应混合物于30℃45min，然后75℃20min。

2)RCA反应

将CL产物进行RCA。反应体系如下：2ul CL产物和2ul pUC19质粒(阳性对照)分别与10ul样品缓冲液(10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA)混匀后，在ABI 2700PCR仪中95℃作用3min后，冷却至4℃后转移到冰上放置。加入10ul反应缓冲液(330mM Tris-acetate，100mM Mg-acetate，660mM K-acetate，1％(v/v)Tween-20，10mM DTT，30pmol随机引物5’-NNNNNN-3’和30pmol引物D)与0.5ul phi29DNA聚合酶(购自Thermo Scientific公司)混匀，在ABI 2700PCR中于30℃运行18h后，于65℃运行10min，冷却至4℃，取2ul RCA产物与1ul 6×Loading Buffer混匀，用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，剩余RCA产物于-20℃保存备用。

1.6.2样品CL-RCA产物的PCR检测

将CL-RCA产物作为模板，配置PCR反应体系。在PCR管中加入12.5ul 2×EasyTaqPCR SuperMix，1ul CL-RCA产物，1ul引物D上游引物，1ul引物D下游引物和9.5ulddH₂O反应总体积25ul。反应条件设置为：94℃5min，之后94℃30s，58℃30s，72℃20s运行35个循环，72℃7min，4℃保存。

1.7腹泻犬DNA的检测

1.7.1DNA的提取

按照DNA提取试剂盒进行操作，提取腹泻犬中的DNA，保存于-20℃备用。

1.7.2样品检测

将提取出来的DNA作为模板，配置PCR反应体系，检测腹泻犬的感染DogCV的情况，在PCR管中加入12.5ul 2×EasyTaq PCR SuperMix，1ul DNA，1ul引物D上游引物，1ul引物D下游引物和9.5ul ddH₂O反应总体积25ul。反应条件设置为：94℃5min，之后94℃30s，58℃30s，72℃20s运行35个循环，72℃7min，4℃保存。利用琼脂糖凝胶电泳进行检测PCR产物。

2.实验结果

2.1不同引物PCR结果

本发明首先根据GenBank上DogCV基因组序列的保守区域设计了4对引物，从中筛选出特异性强、敏感性高的引物。引物A最佳退火温度为60℃，目的条带约为675bp，检测DogCV样本结果如图2-A所示，675bp附近有疑似条带，将条带切下连接T载体后测序后发现与目的片段不符，属于非特异性条带，并且泳道内还存在许多其他非特异性扩增的条带。引物B最佳退火温度为58℃，目的条带为600bp，检测DogCV样本结果如图2-B所示，没有目的条带，非特异性条带非常多。引物C最佳退火温度为60℃，目的条带为902bp，检测DogCV样本结果如图2-C所示，没有目的条带，非特异性条带非常多，引物A、引物B、引物C均存在非特异性扩增，与预期目的条带大小不一致。引物D最佳退火温度为61℃，目的条带为774bp，引物D检测DogCV样本能够扩得预期的目的条带，检测DogCV样本结果如图2-D所示，能够得到清晰的目的条带，将条带切下连接T载体后测序后发现与目的片段一致。

2.2 PCR特异性

通过琼脂糖凝胶电泳鉴定引物D检测的犬瘟阳性样本、犬细小病毒和犬冠状病毒阳性样本的PCR产物，发现没有目的条带产生，证明本发明中引物D的特异性好，没有交叉反应。

2.3 PCR敏感性

本发明建立的用引物D检测DogCV的PCR方法灵敏度高，能够检测到50个拷贝的阳性质粒。

2.4健康犬CL-RCA-PCR检测

2.4.1健康犬样本CL-RCA-PCR与RCA-PCR比较

健康犬基因组CL-RCA扩增结果如图3-A所示，能够将犬DNA样本中环状DNA富集，达到PCR检测的要求。所有PCR反应均使用引物D。利用琼脂糖凝胶电泳进行检测CL-RCA-PCR产物，结果显示，健康犬的DogCV阳性样本能检测到目的条带。

DogCV阴性健康犬DNA样本经过CL-RCA-PCR检测后，DogCV阴性DNA样本中没有目的条带(结果如图3-B所示)；经过CL-RCA-PCR反应后的健康犬DogCV阳性DNA样本中出现明亮的目的条带(结果如图3-B所示)，能进行准确的检测，而通过RCA-PCR检测的健康犬DogCV阳性DNA样本,出现微弱的目的条带(结果如图3-B所示)，不能准确的检测判断。仅通过PCR检测的健康犬DogCV阳性DNA样本,未出现目的条带，不能检测判断。检测中采用的所有阳性和阴性样本已经通过文献报道(Hsu et al.BMC Veterinary Research(2016)12:116，DOI 10.1186/s12917-016-0722-8)的Real time PCR体系进行验证，检测结果与本发明一致。以上结果表明CL-RCA-PCR检测方法优于RCA-PCR检测和普通PCR检测方法，可以对健康犬DogCV阳性DNA样本进行高效、准确检测。

2.5腹泻犬样本的PCR检测

腹泻犬检测的阳性结果如图4所示，用引物D能够准确检测出腹泻犬粪便DNA样本中DogCV阳性样本，条带单一，特异性好。检测中采用的所有阳性和阴性样本已经通过文献报道(Hsu et al.BMC Veterinary Research(2016)12:116，DOI 10.1186/s12917-016-0722-8)的Real time PCR体系进行验证，检测结果与本发明一致。以上结果表明，利用本发明的引物D即可以实现腹泻犬样本DogCV的高效检测。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南农业大学

<120> 一种用于检测犬圆环病毒的引物和高效CL-RCA-PCR检测试剂盒及方法

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gtgcttcacc atcaataatc ctact 25

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

agactgagcc gccgatagag 20

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

cgtgacactg aatggcgttt g 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gcagagaccc cgttgctatg 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gatgtggaag acggaagtgg ag 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

acgccattca gtgtcacgag t 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

gtgacactga atggcgtttg 20

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

cactaaccac atcccgttca t 21