基于毛细管电泳荧光SSR指纹图谱鉴别刺槐品种的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于毛细管电泳荧光ssr指纹图谱鉴别刺槐品种的方法。

背景技术：

刺槐(robiniapseudoacacial.)为豆科(leguminosae)刺槐属(robinia)阔叶乔木，耐干旱、耐瘠薄、耐轻度盐碱、抗污染能力强、自然更新能力强，是荒山造林和水土保持先锋树种，且具有观赏、材用、蜜源和饲用价值。刺槐作为外来物种，在我国已经栽培了近120年，中国各地区栽培的刺槐无性系来源记载不清，遗传关系不明，遗传多样性状况信息甚少，同物异名现象时有发生，急需系统开展刺槐无性系遗传多样性分析和指纹图谱构建，对于下一步开展新品种选育、遗传改良和品种鉴定具有重要意义。

传统的刺槐品种鉴定主要依靠营养器官和生殖器官的形态性状差异，受环境和生长阶段的影响很大，该方法无法有效的在幼树早期进行应用，并且对于表型性状相似或亲缘关系很近的品种，极易出现无意识的混种、混系、混株现象，或者有意识的侵权现象，给生产、科研和植物新品种保护等工作带来极大的不方便，所以利用ssr标记从分子水平进行品种鉴定稳定性高、重复性好、更有说服力，而且能够鉴定所检测位点是纯合还是杂合的。为此，给特定品种或无性系构建指纹图谱成为非常必要和紧迫的任务，对解决我国刺槐品种间的鉴定问题与良种早期选育等具有重要的意义。

目前在木本植物的遗传学分析中，应用较多的主要是rapd，issr，aflp等分子标记，但是这些标记大多是采用无全基因组序列信息的技术开发得到，荧光ssr是根据ssrs两端的高度保守序列设计引物，进而合成荧光引物，进行pcr扩增，然后用毛细管电泳仪对产物进行毛细管电泳，根据不同的峰值检测多态性并构建指纹图谱，此种方法比聚丙烯酰胺凝胶电泳法更易于实现自动化读值，实现规模化检测，且准确可靠。

到目前为止国内外仅有少量关于刺槐ssr分子标记开发及利用的研究报道，lian等(2004)利用ssr引物研究了刺槐的一个突变位点rops15，该位点表现出超突变性，其在刺槐无性系内、无性系之间和子代的突变率分别是6.27％、6.11％和3.78％；谷俊涛(2006)利用6对基因组ssr引物采用聚丙烯酰胺电泳分析了19个刺槐群体608个刺槐个体的遗传结构和遗传多样性；同年方志达(2006)采用聚丙烯酰胺电泳利用ssr标记成功鉴别形态上不易区分的红花刺槐(robiniapseudoacaciavar.decaisneana)和香花槐；kentaro等(2008)开发了23对基因组引物，并利用日本东北部一个39个样本的群体和一个无性系研究了这些位点的特性，11对具有很高的多态性；袁存权等(2010)利用ssr标记技术进行了航天诱变刺槐群体遗传多样性分析，未检测到基因组的广泛变异；赵克奇等(2014)采用聚丙烯酰胺电泳进行了刺槐est-ssr标记pcr反应体系的优化。尚未见这些ssr标记应用于刺槐指纹图谱构建。

技术实现要素：

基于上述现有技术，本发明的目的之一在于提供一种基于毛细管电泳荧光ssr指纹图谱的构建方法。

为了实现上述目的，提供了以下技术方案：

一种基于毛细管电泳荧光ssr指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：

(1)刺槐总dna提取(优选的：采用植物组织基因组dna提取试剂盒(磁珠法)提取刺槐总dna)；

(2)利用ssr引物进行pcr扩增：以步骤(1)提取的刺槐总dna样品为模板，如seqidno.1-8所示的四对引物进行ssr-pcr扩增；

(3)pcr扩增产物毛细管电泳；

(4)根据步骤(3)中的电泳结果构建刺槐ssr指纹图谱。

优选的：所述步骤(2)中的扩增体系采用10μl体系：步骤(1)提取的刺槐总dna(20ng·μl^-1)0.5μl，灭菌去离子水4.3μl，2×taqpcrmastermix5μl，正反引物(即：引物seqidno.1-8)各0.1μl。

优选的：所述步骤(2)中pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s(每个循环降低0.5℃)，72℃延伸40s，14个循环；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，20个循环；72℃延伸10min。

优选的：所述步骤(3)的具体步骤为：取pcr产物各0.3μl、分子量内标0.5μl和去离子甲酰胺9.5μl混合加入pcr板，95℃变性5min，4℃冷却后离心，1×buffer缓冲液上机检测等位基因数目。

优选的：所述等位基因数目检测，所用参数如下：工作电压15.0kv，进样电压1.6kv，喷射持续时间15s，稳压电流30.0μa。

优选的：所述等位基因数目检测用毛细管电泳仪abi3730xl。

优选的：所述步骤(4)的具体步骤为：采用genemarker2.2.0软件进行数据整理分析，根据每对ssr引物的峰值，组合形成每个无性系的ssr指纹图谱。

本发明的目的之二在于提供上述基于毛细管电泳荧光ssr指纹图谱的构建方法在刺槐品种或无性系鉴定中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明示例的基于毛细管电泳利用四对荧光ssr引物组合构建指纹图谱的方法，不仅是一种从分子水平上快速、高效鉴定刺槐品种或无性系的方法，还能够用来进行刺槐遗传多样性评价，同时为刺槐的引种和遗传育种选择亲本提供科学的理论依据，为刺槐种质资源管理和知识产权保护等方面奠定坚实的基础。

2、本发明示例的基于毛细管电泳利用四对荧光ssr引物组合构建指纹图谱的方法，结合了ssr标记与毛细管荧光检测的优点，克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳的不足，不仅能准确读出产物片段的大小，精确度达到1bp之内，而且成本较低，极具应用价值。

3、本发明示例的基于毛细管电泳利用四对荧光ssr引物组合构建指纹图谱的方法，采用特异性的ssr引物组进行刺槐品种鉴定，特异性高，扩增效率好，能快速鉴定刺槐的不同品种，具有快速、准确、操作方便等优势，并且鉴定结果不易受环境影响。

附图说明

图1为本发明示例的荧光ssr引物对1的部分pcr扩增产物毛细管电泳图；

图2为本发明示例的荧光ssr引物对2的部分pcr扩增产物毛细管电泳图；

图3为本发明示例的荧光ssr引物对3的部分pcr扩增产物毛细管电泳图；

图4为本发明示例的荧光ssr引物对4的部分pcr扩增产物毛细管电泳图。

具体实施方式

为了更好的了解本发明的技术方案，下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

1、实验材料：

本实验以12个刺槐无性系为供试材料。分别为鲁刺1(r.pseudoacacialuci1)、鲁刺2(r.pseudoacacialuci2)、鲁刺7(r.pseudoacacialuci7)、鲁刺8(r.pseudoacacialuci8)、鲁刺9(r.pseudoacacialuci9)、鲁刺10(r.pseudoacacialuci10)、鲁刺11(r.pseudoacacialuci11)、鲁刺13(r.pseudoacacialuci13)、鲁刺14(r.pseudoacacialuci14)、鲁刺28(r.pseudoacacialuci28)、鲁刺32(r.pseudoacacialuci32)、鲁刺36(r.pseudoacacialuci36)。

材料采集自山东省费县大青山林场。

2016年5月，采集幼嫩叶片，硅胶干燥，备用。

2、基因组dna的提取：

取幼嫩的刺槐无性系叶片，采用英芮诚生化科技(上海)有限公司植物组织基因组dna提取试剂盒(磁珠法)(货号pted-6030)按照说明书进行提取。

3、利用ssr引物进行pcr扩增：

以步骤2提取的刺槐总dna样品为模板，采用如下四对引物进行ssr-pcr扩增，可以使用fam、hex、rox或tamra四种荧光对引物进行标记，

引物对1：上游：5‘accctgctgtggcaaataac’3(如：seqidno.1)

下游：5‘ctcccaatggacgtttcac’3(如：seqidno.2)；

引物对2：上游：5‘gggagtggtttgtttgtgct’3(如：seqidno.3)

下游：5‘gtccgtgtgtccgaagtttt’3(如：seqidno.4)；

引物对3：上游：5‘gggattgaagatggggtttt’3(如：seqidno.5)；

下游：5‘gctgatgcagcaatcaaaga’3(如：seqidno.6)

引物对4：上游：5‘tcacattggtcagggtcaga’3(如：seqidno.7)

下游：5‘atcggcacttcgaacaaaat’3(如：seqidno.8)。

上述荧光ssr-pcr采用10μl体系：dna(20ng·μl^-1)0.5μl，灭菌去离子水4.3μl，2×taqpcrmastermix5μl，正反引物各0.1μl。

上述荧光引物pcr扩增程序采用：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s(每个循环降低0.5℃)，72℃延伸40s，14个循环；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，20个循环；72℃延伸10min。

4、毛细管电泳上机检测

用毛细管电泳仪abi3730xl检测pcr产物等位基因数目。取pcr产物各0.3μl、分子量内标(生产商abi)0.5μl和去离子甲酰胺(生产商abi)9.5μl混合加入pcr板，95℃变性5min，4℃冷却后离心，1×buffer缓冲液上机检测。基因分析仪生产厂家是abi公司，型号3730xldnaanalyzer，所用参数如下：工作电压15.0kv，进样电压1.6kv，喷射持续时间15s，稳压电流30.0μa。

5、ssr指纹图谱构建及分子鉴定：采用genemarker2.2.0软件进行数据整理分析，根据每对ssr引物的峰值，组合形成每个无性系的ssr指纹图谱，根据指纹图谱的差异，再区分鉴定刺槐品种或者无性系。上述四对ssr引物组合构建的指纹图谱见表1。

表1：四对荧光ssr引物组合构建的指纹图谱

结果表明：利用本发明提供的两对ssr引物组合(引物对1和引物对3，引物对2和引物对3，引物对3和引物对4)即可将以上12种刺槐材料完全区分开，四对引物对应的ssr位点在不同刺槐中部分指纹带型见图1～图4。这些引物组合的试验结果重复性好，多态性高，能快速、准确、高效的完成刺槐品种或者无性系鉴定。

以上描述仅为本申请的较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本申请中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。

sequencelisting

<110>山东省林业科学研究院

中国林业科学研究院林业研究所

费县国有大青山林场

<120>基于毛细管电泳荧光ssr指纹图谱鉴别刺槐品种的方法

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