本发明属于鱼类遗传育种的分子标记技术领域，具体涉及一种利用荧光标记微卫星鉴定斑点叉尾鮰混养家系子代双亲的方法。
背景技术：
斑点叉尾鮰原产于美国，是一种重要的水产经济物种，1984年引入我国。因其具有肉质细嫩，营养丰富，出肉率高，没有肌间刺等优点，深受广大消费者欢迎。随着我国斑点叉尾鮰养殖规模的扩大以及美国对华种质供应限制力度的加大，我国养殖斑点叉尾鮰出现了明显的生长减慢、体色分化、规格不齐和病害频发等种质衰退的现象，严重影响了斑点叉尾鮰的产品品质、产量和养殖效益。因此，开展斑点叉尾鮰品种改良工作，培育生长快、经济性状好、抗逆性强的斑点叉尾鮰新品种(系)已成为当前斑点叉尾鮰产业可持续发展亟待解决的重要问题。
在鱼类遗传育种中，准确的系谱信息对于遗传力、育种值的计算和育种方案的制定具有至关重要的作用。在传统的选育过程中，不同家系主要通过物理隔离的方式分开养殖，等到子代个体长到较大规格时采用注射荧光染料或电子标记等方式区分不同家系个体。对不同家系采取水泥池、网箱隔离养殖的方式，不仅管理难度大，更为关键的是分养池之间在环境因子上会存在差异，不同的环境因素会使育种相关的遗传参数估计产生偏差，不利于育种方案的制定。
微卫星标记具有多态性高、稳定性强、特异性高、共显性遗传等优点。微卫星分子标记技术的出现使得混养水产动物亲子关系的鉴定成为可能，以微卫星分型为基础的亲子鉴定技术是目前水产动物系谱确认中应用最广泛最可靠的手段之一。众多研究表明微卫星标记在确认水产动物父母本和分析家系关系方面具有重要的应用价值。因此，开发出一套基于微卫星分子标记的快速、准确鉴定斑点叉尾鮰亲子关系的技术体系对斑点叉尾鮰育种工作的开展具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种斑点叉尾鮰微卫星家系鉴定方法，为斑点叉尾鮰分子育种提供必要的分子标记，该方法具有鉴别准确率高、不需将各家系隔离养殖等优点，主要是通过斑点叉尾鮰微卫星标记位点进行多重pcr扩增和基因分型检测来实现。
本发明专利所采取的技术方案：
一种斑点叉尾鮰微卫星家系鉴定方法，包括如下步骤：
(1)提取混养的亲本和子代斑点叉尾鮰的基因组dna，并检测质量和浓度
(2)多态性微卫星标记筛选和引物合成
选取10个微卫星位点引物，按照pcr扩增片段大小分为2组，在正向引物的5’端分别用fam、hex两种不同的荧光基团进行修饰，用于多重pcr扩增；
所述的10对微卫星位点引物的核苷酸序列分别为：
第1对：正向引物如seqidno.1所示；反向引物如seqidno.2所示；
第2对：正向引物如seqidno.3所示；反向引物如seqidno.4所示；
第3对：正向引物如seqidno.5所示；反向引物如seqidno.6所示；
第4对：正向引物如seqidno.7所示；反向引物如seqidno.8所示；
第5对：正向引物如seqidno.9所示；反向引物如seqidno.10所示；
第6对：正向引物如seqidno.11所示；反向引物如seqidno.12所示；
第7对：正向引物如seqidno.13所示；反向引物如seqidno.14所示；
第8对：正向引物如seqidno.15所示；反向引物如seqidno.16所示；
第9对：正向引物如seqidno.17所示；反向引物如seqidno.18所示；
第10对：正向引物如seqidno.19所示；反向引物如seqidno.20所示；
其中，第1、2、3、4、5对为一组，第6、7、8、9、10对为另一组；第1、3、5、6、8、10对引物5’端采用fam荧光基团进行修饰；第2、4、7、9对引物5’端采用hex荧光基团进行修饰；
(3)微卫星位点基因分型及家系鉴定
以步骤(2)中所述的10对微卫星位点引物采用多重pcr反应对亲本及子代的基因组dna进行扩增，扩增按照步骤(2)中所选微卫星引物分组的方法进行，扩增产物在abi3730xl遗传分析系统上进行毛细管电泳，用gs-500作为内参，用genemarkerv2.2.0软件读取每个样品的基因型，采用cervus3.0软件对亲本和子代基因型进行分析，判定子代个体的双亲。
所述的斑点叉尾鮰微卫星家系鉴定方法步骤(1)具体方法优选：剪取用于构建家系的斑点叉尾鮰亲本和每个家系子代的鳍条组织，提取亲本和子代的基因组dna，并检测质量和浓度。
多重pcr扩增反应体系优选为：
扩增条件优选：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃～51℃每个循环减1℃退火30s，72℃延伸60s，9个循环；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，15个循环；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸60s，15个循环；72℃延伸10min。
用鉴定于斑点叉尾鮰微卫星家系的微卫星位点引物组合物，由以下10对微卫星位点引物组成：
第1对：正向引物如seqidno.1所示；反向引物如seqidno.2所示；
第2对：正向引物如seqidno.3所示；反向引物如seqidno.4所示；
第3对：正向引物如seqidno.5所示；反向引物如seqidno.6所示；
第4对：正向引物如seqidno.7所示；反向引物如seqidno.8所示；
第5对：正向引物如seqidno.9所示；反向引物如seqidno.10所示；
第6对：正向引物如seqidno.11所示；反向引物如seqidno.12所示；
第7对：正向引物如seqidno.13所示；反向引物如seqidno.14所示；
第8对：正向引物如seqidno.15所示；反向引物如seqidno.16所示；
第9对：正向引物如seqidno.17所示；反向引物如seqidno.18所示；
第10对：正向引物如seqidno.19所示；反向引物如seqidno.20所示；
所述的引物组合物优选：第1、2、3、4、5对引物为一组，第6、7、8、9、10对引物为另一组；第1、3、5、6、8、10对引物的5’端采用fam荧光基团进行修饰；第2、4、7、9对引物的5’端采用hex荧光基团进行修饰。
本发明所述的用鉴定于斑点叉尾鮰微卫星家系的微卫星位点引物组合物在混养斑点叉尾鮰的亲子鉴定中的应用。
一种混养斑点叉尾鮰亲子鉴定试剂盒，包含本发明所述的引物组合物。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明可将不同斑点叉尾鮰家系混养在同一池塘内，不需要采用物理隔离的方式将各家系子代养殖于水族箱或水泥池，可极大节省人力、物力和财力；
(2)本发明将不同家系子代放在一起混养，可避免家系分开放养引入的环境误差，减少小水体养殖病害问题，极大地提高了选育效果；
(3)采用本发明可以等到混养的斑点叉尾鮰子代长到较大规格后注射电子标记，降低电子标记注射后子代死亡率；
(4)本发明中所选的10对微卫星引物建立的两组多重pcr扩增反应稳定、扩增片段清楚，毛细管电泳反应结束后易于判型，适用于斑点叉尾鮰的亲子鉴定。
具体实施方式
实施例1
(1)斑点叉尾鮰核心选育家系的建立
2008年使用1997～2004年从美国引进德克萨斯(1997)群体、阿肯色(1999)群体、密西西比(2001)群体、阿肯色(2003)群体和阿肯色(2004)群体共405尾斑点叉尾鮰建立育种基础群体，利用基础群体进行g0代家系构建。2011年6月选用g0代选育群体作为亲本构建50个g1代家系。2015年6月选用g1代选育群体作为亲本构建100个g2代家系。剪取用于繁殖亲本的尾鳍鳍条，储存在95％的酒精内，—20℃保存。斑点叉尾鮰母本产卵后，每个家系卵块独立孵化，待鱼苗孵出15天后，从每个家系随机选取200尾鱼苗于面积为3亩的池塘中混合养殖。待鱼苗长到较大规格时再转移至大池塘中养殖。养殖12个月后，随机选取500尾g2代斑点叉尾鮰个体，剪取小块尾鳍组织，储存在95％的酒精内，—20℃保存。
(2)斑点叉尾鮰亲本和子代基因组提取
剪取步骤(1)中采集的每个斑点叉尾鮰亲本和子代尾鳍样品约25mg，用液氮研磨成粉末，转移到1.5ml离心管中。先后加入450μlstedna抽提缓冲液(10mmol/ltris-hcl，ph8.0；1mmol/ledta，ph8.0)、35μlsds(10％)，最后加入15μl蛋白酶k(0.2％)颠倒混匀。加入rnasea1μl，置于水浴锅55℃温浴1h。加入等体积(约700μl)tris饱和酚，在dna混合仪上振荡混匀，4℃下12000rpm离心10min，结束后使用移液枪将上清液转移入另一个干净的离心管中。在上清液中加入等体积酚仿醇混合物(酚、氯仿、异戊醇比例为25:24:1)，置于dna混合仪上振荡混匀15min。在上清液中加入等体积氯仿约500μl，置于dna混合仪上振荡混匀15min。在上清液中加入—20℃预冷的无水乙醇1ml沉淀dna，离心机12000rpm离心5min后弃上清液。先加入70％乙醇洗涤两次，再加入无水乙醇洗涤一次，干燥后加入200μlte，溶解充分。用nanodropnd-1000分光光度仪检测浓度，并将各dna样品稀释成100ng/μl的工作液。
(3)多态性微卫星标记筛选和反应体系优化
从已发表的斑点叉尾鮰微卫星引物文献中选取10个具有较高多态性微卫星位点，建立多重pcr进行扩增，每个多重pcr包含5组微卫星引物，引物如表1所示。经优化的pcr反应体系为20μl：2xtaqmastermix，10μl；基因组dna，1μl；10p上下游引物，0.25μl；ddh2o，6.5μl。多重pcr扩增反应在eppendorfmastercyclernexuspcr仪上进行，扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃～51℃(每个循环减1℃)退火30s，72℃延伸60s，9个循环；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，15个循环；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸60s，15个循环；72℃延伸10min。
表1用于斑点叉尾鮰家系鉴定的微卫星位点及引物信息
注：f为正向引物，r为反向引物
(3)微卫星位点基因分型
pcr反应结束后，取3μl扩增产物样品加入到abi3730xl遗传分析系统配置的96孔板内，每个孔内加入0.5μl的genescantm350roxtm标准片段(购自abi公司)，另外在每个孔内加入6.5μl的hi-ditm甲酞胺(购自abi公司)，将96孔板放入pcr仪器内于95℃变性10min，变性后立即置于冰上，然后上样到abi3730xl遗传分析系统(购自美国abi公司)，或者用铝箔纸包好后放入—20℃保存待后续上机分析。待abi3730xl遗传分析系统毛细管电泳结束后，使用genemarkerv2.2.0软件读取每个斑点叉尾鮰亲本和子代个体在各微卫星位点的基因型。
(4)亲子鉴定分析
采用cervus3.0软件对基因分型数据进行等位基因频率(allelefrequency)、观测杂合度(observedheterozygosity,ho)、期望杂合度(expectedheterozygosity,he)、多态信息含量(polymorphicinformationcontent,pic)、hardy-weinberg平衡及无效等位基因频率(nullallelefrequency)分析。接下来，进行模拟分析以及亲子鉴定分析。通过似然率(lod)检验待测个体与亲本基因型之间的关联性，并在95％置信水平下，确定待测个体与哪个亲本具有亲子关系。
表210个斑点叉尾鮰微卫星位点在g2代选育群体中的遗传多样性
注：n为检测个体数，na为等位基因数，ho为观测杂合度，he为期望杂合度，pic为多态信息含量，hw为哈迪温伯格平衡检验，表示ns符合，*表示偏离，f为无效等位基因频率。
(5)结果
利用10对微卫星引物对58尾子代和6尾亲本进行扩增和基因分型，基因型应用cervus3.0软件分析结果如表2。为保证鉴定结果准确，根据lod值鉴定候选父母本时,只有比家系记录数据一致，并且lod值大于0的才确认亲子关系。最终确认了56尾子代，鉴定准确率为96.6％。以上结果表明，利用本发明的微卫星多重荧光方法能高效快捷实现斑点叉尾鮰家系的亲子鉴定分析。
序列表
<110>江苏省淡水水产研究所
<120>一种斑点叉尾鮰微卫星家系鉴定方法
<130>062017i1829
<160>20
<170>siposequencelisting1.0
<210>2
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
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<210>2
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