本发明涉及生物检测领域，特别涉及一种可同时检测cyp2c19和ugt1a1基因多位点突变试剂盒。
背景技术：
ugt1a1基因是ugts基因家族中的一员，位于染色体2q37上，其基因产物尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶1a1的主要作用是使各种不同外源性药物和内生底物葡萄糖醛酸化，增加底物的极性，使其更好地从体内被清除，如胆红素、雌激素、伊立替康等。ugt1a1基因以插入、缺失、单核苷酸多态性等形式表现出了序列间很大的个体差异，从而造成对上述药物的代谢能力的差异。例如，国外试验研究证明含有ugt1a1*28及ugt1a1*6的纯合子或杂合子基因型个体，ugt1a1酶的浓度明显低于野生型。而ugt1a1酶是sn-38转化为sn-38g的关键酶，故含有ugt1a1*28及ugt1a1*6的患者应用伊立替康后，出现ⅲ～ⅳ度腹泻和粒细胞缺乏的风险更大。
伊立替康因抗肿瘤普广，现已用于胃癌、结直肠癌、肺癌等实体肿瘤的治疗。尤其是在消化道肿瘤的治疗方面，在使用伊立替康进行化疗期间除了因ugt1a1*28及ugt1a1*6突变引起的ⅲ～ⅳ度腹泻和粒细胞缺乏的高风险外，还可引起化学性胃炎，恶心呕吐是最常见的症状，直接影响到患者的营养状态和生活质量。在临床上，使用质子泵抑制剂可以有效地预防和抑制因化疗引起的化学性胃炎及上消化道症状。而质子泵抑制剂经由cyp2c19代谢。
cyp2c19是cyp450家族中重要的药物代谢酶之一。主要存在于肝脏微粒体内，临床上大约2％的药物都由其催化代谢。cyp2c19也存在着遗传多态性，例如，经研究显示大于99％的东方人弱代谢者以及约88％的白种人弱代谢者的表型与cyp2c19*2和cyp2c19*3两种突变有关。而其遗传多态性，可分为快代谢型(extensivemetabolizer，em)和慢代谢型(poormetabolizer，pm)，经cyp2c19代谢的药物主要包括以下几类:抗癫痫药、质子泵抑制剂、抗抑郁药、镇静、催眠药、抗真菌药等。一般情况，快代谢型em(主要为w型等位基因携带者)代谢药物比较快，不易产生不良反应，而慢代谢型pm则反之。因此对于em患者应适当的加大药量以达到有效血药浓度，而对于pm患者来说应当适当地减小药量以防止药物的不良反应。
伊立替康及质子泵抑制剂的组合使用在临床上非常常见。用药前先对患者进行基因型检测能够更加准确、安全、有效地指导用药。想要检验患者对两种药物的代谢能力，就得同时检测cyp2c19和ugt1a1的基因多态性，但目前只有分别检测cyp2c19和ugt1a1的试剂盒，如：《一种检测cyp2c19基因多态性的试剂盒及方法》cn201310437151.9、《一种用于检测ugt1a1基因多态性的引物、探针、试剂盒及检测方法》cn201410604304.9等。没有能够同时检测两个基因多态性的产品。因为两个试剂盒的体系与反应程序各不相同，分开检测才能获得较好的结果，这使得要检测两个基因的多态性操作繁琐且花费时间较长，消耗更多的人力物力。因此，获得一种能同时检测两种基因的试剂盒具有十分重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于公开一种可同时检测cyp2c19和ugt1a1基因多位点突变试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：一种可同时检测基因多位点突变的试剂盒，该试剂盒含有检测cyp2c19基因多态性和ugt1a1基因多态性的引物。
优选的，cyp2c19基因多态性位点为cyp2c19*2、cyp2c19*3。
优选的，ugt1a1基因多态性位点为ugt1a1*28、ugt1a1*6。
进一步优选的，检测cyp2c19*2基因位点的引物是：
正向引物：5’-tcttagatatgcaataattttccca-3’(seqidno：1)；
反向引物：5’-aaaatatcactttccataaaagcaag-3’(seqidno：2)；
野生型探针序列是：cccgggaacccata(seqidno：3)；
突变型探针序列是：ttcccaggaacccat(seqidno：4)。
进一步优选的，检测cyp2c19*3基因位点的引物是：
正向引物：5’-tggaaaaattgaatgaaaacatcag-3’(seqidno：5)；
反向引物：5’-ggatttcccagaaaaaaagactg-3’(seqidno：6)；
野生型探针序列是：attgtaagcaccccctggatccag(seqidno：7)；
突变型探针序列是：ttgtaagcaccccctgaatccagg(seqidno：8)。
进一步优选的，检测ugt1a1*28基因位点的引物是：
正向引物：5’-cagtcaaacattaacttggtgtatcg-3’(seqidno：9)；
反向引物：5’-ctttgctcctgccagaggttcg-3’(seqidno：10)；
野生型探针序列是：ttgccatatatatatatataagtagga(seqidno：11)；
突变型探针序列是：ttgccatatatatatatatataagtagga(seqidno：12)。
进一步优选的，检测ugt1a1*6基因位点的引物是：
正向引物：5’-ctagcacctgacgcctcgtt-3’(seqidno：13)；
反向引物：5’-ctctttcacatcctccctttgg-3’(seqidno：14)；
野生型探针序列是：catcagagacagagca(seqidno：15)；
突变型探针序列是：catcagagacggagca(seqidno：16)。
本发明的有益效果是：该试剂盒可以同时基因多态性位点cyp2c19*2、cyp2c19*3、ugt1a1*28、ugt1a1*6，操作简单方便，克服了不同基因位点间的下相互之间的干扰问题，并且这种试剂盒具有检测灵敏度高、效果好的优点。
具体实施方式
下面将结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤、条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若无特别说明，实施例中所用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术，试剂或材料均为通过商业途径得到。
实施例1
设计cyp2c19*2、cyp2c19*3、ugt1a1*28、ugt1a1*6位点的特异性引物对与探针，具体如下表所示：
实施例2
以四个位点的质粒为模板，按以下体系及程序进行验证。
pcr反应，体系如下：
dna模板：2*105copies/μl
引物：300nm
探针：600nm
qpcrmastermix:40％v/v
超纯水：余量
反应程序如下：
94-95℃10min——1个循环
94-95℃30s；55-70℃30s——40个循环
得到结果如下表所示；表中，野生型指等位基因均为野生型，杂合型指等位基因中一个发生突变，突变型指等位基因均发生突变。
实施例3
按照实施例2的反应体系，检验50个成人血液样本，样本使用天根生化科技(北京)有限公司生产的血液基因组dna提取试剂盒(离心柱型)(货号：dp318规格：50/200人份)提取人类基因组dna。再用直接测序法验证，检测结果如下表所示：试剂盒结果(直接测序法结果)单位：例。
检验样本，准确率为100％，证实本方法及试剂盒检验结果可靠。
实施例4
取市售的cyp2c19试剂盒及ugt1a1试剂盒中的引物及探针作对比例，以不同浓度的杂合质粒为模板，按本发明的反应程序扩增验证。
质粒浓度：高为106copies/μl、中为105copies/μl、低为104copies/μl。按照实施例2的反应体系，结果如下表所示：(ct-fam/ct-vic)
本发明各浓度质粒的检出率为100％，相比于对比例，本发明灵敏度更高，特异性更好。
sequencelisting
<110>广州海思医疗科技有限公司
<120>一种同时检测cyp2c19和ugt1a1基因多位点突变试剂盒
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