一种新型的快速细胞染色剂及其应用的制作方法

本发明涉及一种细胞染色剂及其应用，尤其涉及一种快速细胞染色剂及其应用，属于细胞染色领域。

背景技术：

在基础研究中经常需要观察实验中的细胞形态细节，通过染色可使细胞的微细结构显示不同的颜色，从而在光镜下能清晰地呈现出细胞图像。现有技术提供的染色方法步骤多、时间长，且多需经过细胞固定等一系列程序，为了能够及时、快速地观察细胞形态常采用快速染色法，但目前的快速染色法普遍存在如下缺陷：

(1)快速染色剂中所使用的试剂对环境或人体大多具有潜在的污染或危害。

(2)染液成分复杂，配制麻烦，大多需现配现用，无法长期保存。

(3)染色剂的使用过程比较繁琐，需将细胞固定，染色过程时间长。

(4)适用范围窄，一般仅对特定种类的细胞才具有快染作用。

(5)染色时间短，在快速染色后，在很短的时间内即褪色，无法满足长时间实时观察活细胞的需要。

综上可知，现有技术提供的快速活细胞染色剂还存在诸多缺陷，因此，本领域亟需开发一种新型快速活细胞染色剂，以克服上述缺陷中的一种或多种。

技术实现要素：

有鉴于现实需要，本发明的主要目的在于提供一种细胞染色组合物，该细胞染色组合物可配制成细胞染色剂，该染色剂能够使活细胞快速染色，并且使被着染细胞在很长一段时间内不褪色，以满足长时间实时观察活细胞形态的需要。

本发明的再一目的在于提供由前述细胞染色组合物配制得到的细胞染色剂。

本发明的再一目的在于提供前述细胞染色组合物或前述细胞染色剂的应用。

为实现上述目的，本发明提供一种细胞染色组合物，其中，所述细胞染色组合物包括甲苯胺蓝和硫酸钠。

本发明前述细胞染色组合物可与水配制成细胞染色液，将组合物中的甲苯胺蓝和硫酸钠溶解在水中即可。本发明通过实验表明在进行活细胞快速染色时，甲苯胺蓝(toluidineblue)具有鲜亮的着色效果，细胞着色很快，仅需2秒左右，但是着色后于较短时间内，约15min后细胞即开始褪色，无法满足长时间实时观察活细胞形态的需要。本发明甲苯胺蓝和硫酸钠的组合，是经过反复测试得出的，发明人发现在甲苯胺蓝染色液中加入硫酸钠能够显著延长被着染细胞的褪色时间，具有染色稳定、持久的作用，细胞着色后于很长一段时间内都不会褪色，封片后可维持细胞着色数日之久(可达48h)。此外，如标本干燥后细胞褪色，如再滴加此染色液则细胞又呈现出鲜艳的色泽。

本发明所述甲苯胺蓝(toluidineblue，cas编号：6586-04-5)为深绿色或黑灰色粉末，其可商购获得，本发明下甲苯胺蓝的计量均以净含量计算。

本发明所述硫酸钠既可为水合形式也可为无水形式，本发明下述硫酸钠的计量均以无水形式计算。

作为本发明前述细胞染色组合物的一具体形式，以所述细胞染色组合物的总重量为100％计，所述甲苯胺蓝的质量百分比为1.6％～14.3％。

作为本发明前述细胞染色组合物的一具体形式，以所述细胞染色组合物的总重量为100％计，所述硫酸钠的质量百分比为85.7％～98.4％。

作为本发明前述细胞染色组合物的一具体形式，以所述细胞染色组合物的总重量为100％计，所述甲苯胺蓝的质量百分比为1.6％～14.3％，所述硫酸钠的质量百分比为85.7％～98.4％。

本发明前述组合物在实际销售时可以有其他替代名称，例如试剂盒、套件、套组或系统等。前述组合物中两种物质可以混合在一起包装，也可独立分开包装。

本发明所用术语“包括”意指组合物或方法包括所列举要素，但并不排除其他要素。当“基本上或主要由某些组分或步骤组成”用于定义组合物及方法时，应意指排除对组合物或方法有任何本质意义的其他要素。“由组分或步骤组成”应意指排除针对于所主张组合物及实质方法步骤而言多于痕量要素的其他成分。由这些过渡术语中的每一者所定义的实施例均在本发明范围内。因此，方法及组合物可意欲包括其他步骤及组分(包含)或另一选择为包括不重要的步骤及组合物(基本上或主要由其组成或步骤)或另一选择为仅意指所述方法步骤或组合物(由其组成)。

本发明所有数值指定(例如温度、时间、浓度及重量等，包括其中每一者的范围)通常可是适当以0.1或1.0的增量改变(+)或(-)的近似值。所有数值指定均可理解为前面有术语“约”。

另一方面，本发明提供一种细胞染色剂，其中，该细胞染色剂为水溶液，其包括溶质甲苯胺蓝和溶质硫酸钠。

该细胞染色剂可采用上述细胞染色组合物配制而成。如前所述，该细胞染色剂具有快速染色并且着染细胞不易褪色的优点。此外，本发明细胞染色剂还具有安全环保、成分简单、用量少、价格低、配制方便、可长期贮存1年以上(现行一般的染液都是现用现配)等优点。

作为前述细胞染色剂的一具体实施方式，所述溶质甲苯胺蓝的质量浓度范围为0.01mg/ml～5mg/ml。

作为前述细胞染色剂的一具体实施方式，所述溶质硫酸钠的质量浓度范围为0.615mg/ml～30mg/ml。

作为前述细胞染色剂的一具体实施方式，所述溶质甲苯胺蓝的质量浓度范围为0.01mg/ml～5mg/ml，所述溶质硫酸钠的质量浓度范围为0.615mg/ml～30mg/ml。

再一方面，本发明提供前述的细胞染色组合物或前述的细胞染色剂在对细胞或组织染色中的应用。

在实际应用前述细胞染色组合物时，可先将其配制成前述细胞染色剂，而对于细胞染色剂，直接将其应用即可。

在实际应用时，可将待染细胞、微载体上的细胞或凃片上的细胞与本发明细胞染色剂直接接触染色，即可对细胞进行着染。染色时间一般只需0.5～2min即可完成，而褪色时间可维持数天。采用本发明细胞染色剂，染色操作简便快捷，细胞无需固定，只需将细胞直接与染液混合，数分钟后即可清晰着染细胞，非常有利于细胞形态学研究中的实时观察。因此，本发明提供了一种细胞染色的方法，其包括如下步骤：

(1)将前述细胞染色组合物配制成水溶液：

(2)将步骤(1)所得溶液或前述的细胞染色剂与待染细胞或组织直接接触染色，优选染色0.5～2min，完成对细胞的染色；

优选地，步骤(1)中所得水溶液中所述甲苯胺蓝的浓度范围为0.01mg/ml～5mg/ml，所述硫酸钠的浓度范围为0.615mg/ml～30mg/ml。

本染色方法适用范围广，几乎适用于所有单个细胞的体外染色。细胞的种类包括但不限于黑色素瘤细胞、宫颈癌、肝癌、洋葱内皮细胞、肥大细胞、口腔上皮细胞、肺成纤维细胞或单核-巨噬细胞等。本发明被染色的细胞包括但不限于悬浮细胞、贴壁细胞、微载体上的细胞或凃片上的细胞。

本发明待染细胞可为活细胞。需要说明的是，本发明的细胞染色剂同样可适用于死细胞。只是说本发明特别适用于活细胞的染色，因为可对其细胞形态进行实时观察。

本发明所述的组织可为植物组织。

本发明在具体实施时发现在对微载体培养细胞的染色时，本发明细胞染色剂的染色效果优于一般染色剂，如giemsa(吉姆萨)、eosin(伊红)染色剂，这主要是因为使用本发明染色剂既能清晰显示细胞结构，又不着染微载体，更有利于染色细胞的观察；而giemsa使微载体呈淡红色、eosin使微载体呈橙红色，很难将染色后微载体和细胞区分开来，不利于染色细胞的观察。因此，本染色方法能用于原位观察微载体培养细胞的形态。从上可知，本发明提供了一种原位观察微载体培养细胞的形态的方法，其包括如下步骤：

(1)采用前述细胞染色的方法对微载体培养细胞进行染色；

(2)原位观察被着染的微载体培养细胞的形态。

本发明在具体实施时发现甲苯胺蓝染料具有异染性，可着染肥大细胞中丰富的嗜碱性颗粒，采用本发明染色剂较传统肥大细胞染色更快捷，对颗粒的着色更敏感、更清晰。而在传统的肥大细胞甲苯胺蓝染色过程中，细胞需要离心、干燥、固定、染色、脱水等多个环节，整个时间约需2.5～3小时。因此，本方法还可作为在体外诱导分化培养肥大细胞过程中，实时鉴定肥大细胞成熟度的形态学方法。从上可知，本发明提供了一种实时鉴定肥大细胞成熟度的形态学方法，其包括如下步骤：

(1)采用前述细胞染色的方法对肥大细胞中的嗜碱性颗粒进行染色；

(2)观察嗜碱性颗粒的染色情况以确定肥大细胞的成熟度。

综上可知，本发明主要提供了一种快速细胞染色剂及其应用，其具有如下优点：

(1)染液由甲苯胺蓝和硫酸钠以及蒸馏水组成。甲苯胺蓝为医用药物，对人体安全，而且不会污染环境；硫酸钠亦无毒害作用。因此该染液安全无毒无污染。

(2)染液成分少，均为常用试剂，成本低(按目前原料价格，100ml染色液的试剂原料成本仅约需2元)，配制方便，可长期存放，无需现用现配。

(3)染色操作简便快捷，细胞无需固定，只需将细胞直接与染液混合，数分钟后即可清晰着染细胞，且染色稳定、持久，非常有利于细胞形态学研究中的实时观察。

(4)本染色方法适用范围广，几乎适用于所有单个细胞的体外染色。

(5)对微载体培养细胞的染色效果优于一般染色剂(如giemsa、eosin)，因该染色方法既能清晰显示细胞结构，又不着染微载体；而giemsa使微载体呈淡红色、eosin使微载体呈橙红色，从而影响细胞染色的清晰度。因此，本染色方法能用于原位观察微载体培养细胞的形态。

(6)甲苯胺蓝染料具有异染性，可着染肥大细胞中丰富的嗜碱性颗粒，本方法较以往肥大细胞染色更快捷，对颗粒的着色更敏感、更清晰，因此，还是体外诱导分化培养肥大细胞过程中，实时鉴定肥大细胞成熟度简便易行的形态学方法。

附图说明

图1为本发明实施例1中所得甲苯胺蓝快染液对微载体上细胞的染色的结果图。

图2为本发明实施例1中所得甲苯胺蓝快染液对口腔上皮细胞涂片染色的结果图。

图3为本发明实施例1中所得甲苯胺蓝快染液在细胞湿润状态下对肥大细胞染色的结果图。

图4为本发明实施例1中所得甲苯胺蓝快染液在干燥状态下对肥大细胞染色的结果图。

图5为本发明实施例1中所得甲苯胺蓝快染液对洋葱内皮细胞染色的结果图。

图6为对比例1中接种于微载体上的b16黑色素瘤细胞，应用giemsa染液快速染色的结果图。

图7为对比例1中接种于微载体上的b16黑色素瘤细胞，应用eosin染液快速染色的结果图。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。

实施例1

本实施例提供一种快速染色剂及其应用，所述快速染色剂按如下方法制备得到：

将225mg甲苯胺蓝(质量百分比10％)和2025mgna2so4(质量百分比90％)溶解于蒸馏水，待溶质完全溶解后，用蒸馏水定容至100ml静置过夜，即为本实施例快速染色剂—甲苯胺蓝快染液。本实施例按如下方法测试所得甲苯胺蓝快染液的染色效果：

(1)微载体上细胞的染色

将b-16黑色素瘤细胞接种于微载体上，并加入培养基培养。用前从微载体培养体系取含有b-16黑色素瘤细胞的微载体细胞悬液及所得甲苯胺蓝快染液各一滴置于载玻片上，混匀，染色0.5～2min，同时在显微镜下观察染色情况，适时直接封片。然后于光镜(40×镜头)下观察。所得结果如图1所示，从图1中可以看出微载体上接种的b-16黑色素瘤细胞着鲜明的紫红色(箭头所指)，结构清晰，微载体不着色；凋亡细胞核固缩深染，坏死细胞多膨大、核溶解或碎裂；然而藏于微载体深部的细胞影像较模糊，染色封片后48h内，微载体上接种的b-16黑色素瘤细胞保持着鲜明的紫红色，结构清晰，微载体不着色。

(2)口腔上皮细胞涂片染色

刮取少量口腔上皮细胞，置于载玻片上，加所得甲苯胺蓝快染液一滴，混匀，染色0.5～2min，同时在显微镜下观察染色情况，适时直接封片。然后于光镜(40×镜头)下观察。所得结果如图2所示，从图2中可以看出口腔上皮细胞可清晰着染，细胞形态清晰，染色封片后48h内，口腔上皮细胞保持着清晰着染，细胞形态清晰。

(3)肥大细胞染色

(3.1)取小鼠股骨骨髓细胞，经条件培养基培养四周，诱导分化成肥大细胞(bonemarrow-derivedmastcells，bmmc，胞浆中充满颗粒表示肥大细胞成熟)，备用。

(3.2)取适量步骤(3.1)所得肥大细胞悬液于离心涂片机上甩片，200rpm，1min，趁细胞湿润时立即滴加所得甲苯胺蓝快染液约100μl。

(3.3)着染10～15min，染色同时在显微镜下观察染色情况，适时直接封片、终止染色，用纸巾沿盖玻片周围吸去多余染液。

(3.4)于100×油镜下观察。

所得结果如图3所示，从图3中可以看出，步骤(3.1)～步骤(3.4)可令肥大细胞中的颗粒清晰着染(图3中箭头所指即为胞浆中的颗粒)，但不能着染细胞核，染色封片后48h内，肥大细胞中的颗粒保持着清晰着染，但不能着染细胞核。若需观察细胞核，甩片后将细胞涂片在室温干燥15min，然后滴加染液100μl，重复步骤(3.3)和(3.4)，所得结果如图4所示，从图4中可以看出于干燥状态下该快染液不仅可着染细箭头所指为胞浆中的颗粒(图4中细箭头所指)，还能使细胞核清晰着染(图4中粗箭头所指)，染色封片后48h内，细胞核保持清晰着染。此外，对比图3与图4还可发现，在细胞湿润状态下对bmmc胞浆颗粒的着染较在细胞干燥状态下更敏感，颗粒显示更加锐利和清晰。

(4)洋葱内皮细胞染色

(4.1)剥取适量洋葱内皮，平铺于载玻片上。

(4.2)用酒精灯火焰小心、短暂加温载玻片底部数秒，令洋葱内皮适度干燥。

(4.3)滴加所得甲苯胺蓝快染液，着染5～10min，染色同时在显微镜下观察染色情况，适时直接封片、终止染色，用纸巾沿盖玻片周围吸去多余染液。

(4.4)于光镜(40×镜头)下观察。

所得结果如图5所示，从图5中可以看出洋葱内皮细胞的细胞结构清晰可见，细胞核被清晰着染成蓝绿色(图5中箭头所指)，染色封片后48h内，洋葱内皮细胞的细胞结构保持着清晰可见，细胞核被清晰着染成蓝绿色。

实施例2

本实施例提供一种快速染色剂及其应用，所述快速染色剂按如下方法制备得到：

将50mg甲苯胺蓝(质量百分比5％)和950mgna2so4(质量百分比95％)溶解于蒸馏水，待溶质完全溶解后，用蒸馏水定容至100ml，静置过夜，即为本实施例快速染色剂—甲苯胺蓝快染液。

(1)微载体上细胞的染色

将b-16黑色素瘤细胞接种于微载体上，并加入培养基培养。用前从微载体培养体系取含有b-16黑色素瘤细胞的微载体细胞悬液及所得甲苯胺蓝快染液各一滴置于载玻片上，混匀，染色0.5～2min，同时在显微镜下观察染色情况，适时直接封片。试验结果显示：微载体上接种的b-16黑色素瘤细胞着鲜明的紫红色，结构清晰，微载体不着色，染色封片后48h内，微载体上接种的b-16黑色素瘤细胞保持着鲜明的紫红色，结构清晰，微载体不着色。

(2)口腔上皮细胞涂片染色

刮取少量口腔上皮细胞，置于载玻片上，加所得甲苯胺蓝快染液一滴，混匀，染色0.5～2min，同时在显微镜下观察染色情况，适时直接封片。试验结果显示：口腔上皮细胞可清晰着染，细胞形态清晰，染色封片后48h内，口腔上皮细胞保持着清晰着染，细胞形态清晰。

(3)肥大细胞染色

(3.1)取小鼠股骨骨髓细胞，经条件培养基培养四周，诱导分化成肥大细胞(bonemarrow-derivedmastcells，bmmc，胞浆中充满颗粒表示肥大细胞成熟)，备用。

(3.2)取适量步骤(3.1)所得肥大细胞悬液于离心涂片机上甩片，200rpm，1min，趁细胞湿润时立即滴加所得甲苯胺蓝快染液约100μl。

(3.3)着染10～15min，染色同时在显微镜下观察染色情况，适时直接封片、终止染色，用纸巾沿盖玻片周围吸去多余染液。

(3.4)于100×油镜下观察。

显微镜观察结果显示：本实施例染液可使肥大细胞中的颗粒清晰着染，但不能着染细胞核，染色封片后48h内，肥大细胞中的颗粒保持清晰着染，但不能着染细胞核。若需观察细胞核，甩片后将细胞涂片在室温干燥15min，然后滴加染液100μl，重复步骤(3.3)和(3.4)，即可观察到干燥状态下该快染液不仅可着染细胞浆中的颗粒，还能使细胞核清晰着染，染色封片后48h内，细胞核保持着清晰着染。此外，在细胞湿润状态下对bmmc胞浆颗粒的着染较在细胞干燥状态下更敏感，颗粒显示更加锐利和清晰。

(4)洋葱内皮细胞染色

(4.1)剥取适量洋葱内皮，平铺于载玻片上。

(4.2)用酒精灯火焰小心、短暂加温载玻片底部数秒，令洋葱内皮适度干燥。

(4.3)滴加所得甲苯胺蓝快染液，着染5～10min，染色同时在显微镜下观察染色情况，适时直接封片、终止染色，用纸巾沿盖玻片周围吸去多余染液。

(4.4)于光镜(40×镜头)下观察。

显微镜观察结果显示：洋葱内皮细胞的细胞结构清晰可见，细胞核被清晰着染成蓝绿色，染色封片后48h内，洋葱内皮细胞的细胞结构保持着清晰可见，细胞核被清晰着染成蓝绿色。

实施例3

本实施例提供一种快速染色剂及其应用，所述快速染色剂按如下方法制备得到：

将400mg甲苯胺蓝(质量百分比14％)和2457mgna2so4(质量百分比86％)溶解于蒸馏水，待溶质完全溶解后，用蒸馏水定容至100ml，静置过夜，即为本实施例快速染色剂—甲苯胺蓝快染液。

(1)微载体上细胞的染色

将b-16黑色素瘤细胞接种于微载体上，并加入培养基培养。用前从微载体培养体系取含有b-16黑色素瘤细胞的微载体细胞悬液及所得甲苯胺蓝快染液各一滴置于载玻片上，混匀，染色0.5～2min，同时在显微镜下观察染色情况，适时直接封片。试验结果显示：微载体上接种的b-16黑色素瘤细胞着鲜明的紫红色，结构清晰，微载体不着色，染色封片后48h内，微载体上接种的b-16黑色素瘤细胞保持着鲜明的紫红色，结构清晰，微载体不着色。

(2)口腔上皮细胞涂片染色

刮取少量口腔上皮细胞，置于载玻片上，加所得甲苯胺蓝快染液一滴，混匀，染色0.5～2min，同时在显微镜下观察染色情况，适时直接封片。试验结果显示：口腔上皮细胞可清晰着染，细胞形态清晰，染色封片后48h内，口腔上皮细胞保持着清晰着染，细胞形态清晰。

(3)肥大细胞染色

(3.1)取小鼠股骨骨髓细胞，经条件培养基培养四周，诱导分化成肥大细胞(bonemarrow-derivedmastcells，bmmc，胞浆中充满颗粒表示肥大细胞成熟)，备用。

(3.2)取适量步骤(3.1)所得肥大细胞悬液于离心涂片机上甩片，200rpm，1min，趁细胞湿润时立即滴加所得甲苯胺蓝快染液约100μl。

(3.3)着染10～15min，染色同时在显微镜下观察染色情况，适时直接封片、终止染色，用纸巾沿盖玻片周围吸去多余染液。

(3.4)于100×油镜下观察。

显微镜观察结果显示：本实施例染液可使肥大细胞中的颗粒清晰着染，但不能着染细胞核，染色封片后48h内，肥大细胞中的颗粒保持着清晰着染，但不能着染细胞核。若需观察细胞核，甩片后将细胞涂片在室温干燥15min，然后滴加染液100μl，重复步骤(3.3)和(3.4)，即可观察到干燥状态下该快染液不仅可着染胞浆中的颗粒，还能使细胞核清晰着染，染色封片后48h内，细胞核保持着清晰着染。此外，在细胞湿润状态下对bmmc胞浆颗粒的着染较在细胞干燥状态下更敏感，颗粒显示更加锐利和清晰。

(4)洋葱内皮细胞染色

(4.1)剥取适量洋葱内皮，平铺于载玻片上。

(4.2)用酒精灯火焰小心、短暂加温载玻片底部数秒，令洋葱内皮适度干燥。

(4.3)滴加所得甲苯胺蓝快染液，着染5～10min，染色同时在显微镜下观察染色情况，适时直接封片、终止染色，用纸巾沿盖玻片周围吸去多余染液。

(4.4)于光镜(40×镜头)下观察。

显微镜观察结果显示：洋葱内皮细胞的细胞结构清晰可见，细胞核被清晰着染成蓝绿色，染色封片后48h内，洋葱内皮细胞的细胞结构保持着清晰可见，细胞核被清晰着染成蓝绿色。

对比例

针对实施例1～3中的微载体上细胞的染色，本对比例将b-16黑色素瘤细胞接种于相同的微载体上，应用现有技术提供的giemsa染液快速染色或eosin染液快速染色，染色结果图分别如图6及图7所示，从图6及图7中可以看出giemsa染液使微载体呈淡红色，eosin染液使微载体呈橙红色，均不利于将微载体和细胞区分开来，不利于染色细胞的观察。最后说明的是：以上实施例仅用于说明本发明的实施过程和特点，而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，均应涵盖在本发明的保护范围当中。