本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种血液体外培养抗肿瘤药药敏检测方法。
背景技术：
肿瘤目前的发生率位居世界第一。如何选择肿瘤患者药物，进行有的放矢的精准治疗是目前临床医护人员关注的问题。
抗肿瘤药体外药敏实验可以给医护人员建议选择哪个或哪些药物可以准确的治疗某个个体肿瘤患者，达到肿瘤化疗药的精准治疗以避免化疗药引起的严重不良反应。目前抗肿瘤药的药敏实验常用的样本均是通过活检或手术得到的组织样本。
现有的抗肿瘤药药敏检测方法存在以下问题：
1.不管是通过活检还是通过手术得到的组织样本，都会对患者造成一定程度的创伤，不仅会对患者造成不可避免的痛楚，还不利于患者的健康恢复；
2.不管是通过活检还是通过手术得到的组织样本，都需要肿瘤组织长大到一定程度才能进行，无法在肿瘤早期进行。
技术实现要素：
为解决现有技术的不足，本发明旨在提供一种血液体外培养抗肿瘤药药敏检测方法，无需通过手术得到组织样本，不会对患者造成大的创伤；并且可以在肿瘤早期进行检测。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明公开的一种血液体外培养抗肿瘤药药敏检测方法，包括以下步骤：
a)采集外周血液；
b)分离外周血液中的肿瘤血小板、循环肿瘤细胞、肿瘤干细胞；
c)将分离出的肿瘤血小板、循环肿瘤细胞、肿瘤干细胞加入胶原蛋白进行三维立体培养；
d)加入待测药物，在细胞培养箱中孵育；
e)采用atp-tca或mtt方法对细胞进行形态及生长情况的鉴定，获得肿瘤对抗肿瘤药的药敏信息。
血液系统是肿瘤转移的重要途径，外周血液中可检测到ctc(循环肿瘤细胞)和csc(肿瘤干细胞)及teps(肿瘤血小板)。其中ctc和csc对肿瘤早筛、用药和预后均具有强大的指示作用。由于前两者在肿瘤早期得率极低，血小板因其在血液中量大、易富集等优点能够作为探究肿瘤早期筛查及药敏实验技术的优先选择对象。并且根据已知的teps基因panel，还能对早期癌症实现高准确度的检测。因此，本发明是通过全血提取ctc、csc及teps进行药物敏感性测定，将其作为对肿瘤患者血液活检以及进行药物敏感性研究的目标物质，是一种肿瘤早筛及药敏实验的新思路且具有广阔的应用前景。
优选的，所述c)步骤后，进行一次筛选：选取状态良好的细胞，离心收集，加入胶原蛋白进行三维立体培养。筛选后的细胞状态良好，能够避免已死亡细胞对培养环境造成影响，从而减小干扰，提高整个药敏检测的准确性。
优选的，所述b)步骤中，首先采集外周血液中的白膜血，再以白膜血∶ficoll＝2∶1的比例加入到含有ficoll的离心管中离心，用巴氏吸管吸出白膜，用pbs(磷酸盐缓冲液)稀释混匀洗涤，能够方便分离，而且不会损伤到分离的细胞，有利于细胞的生长。
进一步的，白膜用pbs稀释混匀洗涤后，用基础培养液洗涤，能够进一步除去其他杂质，并且能够让分离出的细胞得到松弛，有利于细胞适应后续的培养环境。
进一步的，所述三维立体培养的条件为：o2含量为1％～18％，co2含量为1％～10％，压力为1～4psi，温度为25～40℃，湿度为30％～95％。通过大量实验发现在该条件下ctc、csc及teps能够在胶原蛋白培养基中良好生长，方便检测的展开。
优选的，所述三维立体培养的条件为：o2含量为1％，co2含量为5％，压力为2psi，温度为37～37.5℃，湿度为95％。在更接近于人体内环境下培养出来的ctc、csc及teps其药敏检测的结果更加准确，结果更有临床指导的意义。
优选的，加入胶原蛋白进行三维立体培养时，细胞悬液的细胞密度为2.5×105细胞/ml。该细胞密度条件下ctc、csc及teps能够在胶原蛋白培养基中良好生长。
进一步的，所述d)步骤中，在细胞培养箱中孵育的条件为：co2含量为5％，压力为1～4psi，温度为37℃，湿度为95％，培养4天。该孵育条件模拟了人体内的环境，能够模拟药物在人体内的作用机理，使药敏检测的结果更加准确，结果更有临床指导的意义。
进一步的，所述d)步骤在96孔板上进行，加入不同浓度的多种待测药物及阳性对照药及空白对照孔。采用96孔板能够同时进行多组试验，同时还方便设置不加药的对照组，能够一次检测多组信息，方便为医护人员提供最适合患者的药物参考信息。
优选的，所述e)步骤中，在96孔板各细胞孔内分别加入细胞裂解液200μl，室温下混合5min，从96孔板各孔中分别吸取50ul细胞混合溶液加入发光检测板各孔中，依次在各孔中加入50μl荧光素酶试剂混匀，用荧光检测仪检测荧光强度，能够获得每个孔中培养细胞的存活状况，计算平均值，获得定量的数据供医护人员参考。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明采用患者外周血进行化疗药物的敏感性检测，患者不需要进行活检或手术，检验样本来源简单，减轻肿瘤患者在肿瘤诊疗期的取样痛苦。
2.本发明能够对肿瘤患者在患病的各个肿瘤分期进行实时重复的药敏检测，以及时获得最新最佳的治疗方案，特别是对肿瘤早期的筛查，能够尽早的对患者进行诊断治疗，以免延误治疗时间、增大患者不必要的花费。
3.本发明以个体肿瘤患者的血液作为检测对象，能够实现精准的个体化、高效率的抗肿瘤治疗方案的制定，节约医疗资源的同时提高治疗效果。
4.本发明运用了现今发展较为成熟的检测方式，能够对肿瘤患者进行高效抗肿瘤药物敏感性检测。
5.本发明能够为临床提供抗肿瘤药物的最佳搭配实现对肿瘤的精准治疗。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下对本发明进行进一步详细说明。
实施例一：
对75例肺癌患者和25例非恶性肿瘤的患者，分别取其外周血7.5ml，4度保存运输。利用免疫磁珠技术将血液样本中的肿瘤血小板富集分出来。离心15分钟，2000rpm。用pbs稀释混匀洗涤。随后用基础培养液继续洗。洗好的细胞中加入配制好的胶原蛋白3维立体培养液，再全部转移到培养瓶中，置孵育箱孵育过夜。进行三维立体培养时的条件如下：o2含量在1％，co2含量在5％，压力在2psi，温度在37℃，湿度在95％。次日向各孔加入待测药物，每种药物设置3个平行孔，并设不加药对照组。将96孔板放入湿度大于95％、37℃、5％co2，压力在1～4psi细胞培养箱中孵育4d。96孔板各细胞孔内加入细胞裂解液200μl，室温下混合5min，从96孔板各孔中吸取50ul细胞混合溶液加入发光检测板各孔中，依次在各孔中加入50μl荧光素酶试剂，混匀。用荧光检测仪检测荧光强度，计算平均值。
实施例二：
选取120例卵巢肿瘤患者，其中卵巢癌组78例。卵巢交界性肿瘤组42例，年龄24～72岁,中位年龄51岁。卵巢良性肿瘤组50例，年龄18～71岁,中位年龄49岁。选取同时间健康体检女性60例作为对照组，年龄22～78岁,中位年龄50岁。患者清晨空腹抽取静脉血7.5ml(取标本前均未经放疗、化疗或其他治疗)，放入含edta-k2抗凝管中充分混匀，采血后2h内应用xe-2000全血细胞自动检测分析仪检测血小板计数。进行三维立体培养时的条件如下：o2含量在1％，co2含量在5％，压力在2psi，温度在37.5℃，湿度在60～95％。次日向各孔加入待测药物，每种药物设置3个平行孔，并设不加药对照组。将96孔板放入湿度95％、37℃、5％co2，压力在2psi细胞培养箱中孵育4d。96孔板各细胞孔内加入细胞裂解液200μl，室温下混合5min，从96孔板各孔中吸取50ul细胞混合溶液加入发光检测板各孔中，依次在各孔中加入50μl荧光素酶试剂，混匀。用荧光检测仪检测荧光强度，计算平均值。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。