专利名称：微量分枝杆菌药敏检测方法
技术领域：
本发明涉及一种分枝杆菌药敏检测方法，尤其涉及一种降低生长指示剂对分枝杆菌毒性、能够实现更少菌量样品进行微量分枝杆菌药敏检测、并进一步鉴定分枝杆菌和结核分枝杆菌的方法。
背景技术：
目前主要的分枝杆菌药敏性测试方法包括表型药敏试验和分子药敏试验。其中分子药敏随着分子生物学的发展、分枝杆菌耐药机制研究逐步深入、以及相关耐药基因的直接检测而成为研究热点，目前已经建立了许多检测分枝杆菌突变基因的分子药物敏感试验，无需培养，可直接检测各种标本，生物安全性好、检测快速，如PCR-限制性片段长度多态性分析、DNA测序、PCR单链构象多态性分析、线性探针技术、DNA芯片技术等等，但分子药 敏试验操作繁琐，而且灵敏度和特异性也不甚理想。表型药敏试验主要为噬菌体生物扩增法、显微镜观察药物敏感度检测技术、氧化还原指示剂法。I)卩遼菌体生物扩增法(Phageamplified biologically assay, PhaB ):结核分枝杆菌噬菌体能感染活的结核分枝杆菌，未进入感染菌体内的噬菌体被随后加入的杀毒剂灭活，进入菌体内的噬菌体在菌体内大量增殖，最终将菌体裂解，在琼脂平板上出现透明的噬菌斑。加入抗结核药物的培养基内由于药物对结核菌的抑制，噬菌体不能感染死亡的菌体，导致噬菌斑不能形成，故而表现为敏感；反之，有噬菌斑形成的则为耐药菌株。该方法48小时内就可获得结果，但是由于抗结核药物作用于结核分枝杆菌机制不同，有些是杀菌类药物，有些是抑菌类药物，，导致该方法检测不同抗结核药物的药敏结果的敏感性及特异性差异较大。2)显微镜观察药物敏感度检测技术(microscopic observation drugsusceptibility, MODS) :M0DS技术是一种对结核杆菌形态学进行显微镜观察和耐药性检测的一种液态培养方法。在液体培养基中，结核杆菌能够分泌索状因子，使其呈现特征性索状结构，该结构可通过倒置显微镜进行观察，确定是否有结核杆菌生长，以及对药物是否敏感。胡忠义等人在2009年全国耐药结核病学术大会上公开的论文中，用MODS法检测了 66株结核杆菌对4种一线抗结核药物链霉素、异烟肼、利福平及乙胺丁醇的耐药情况，其敏感性分别为97. 0%、90. 9%,95. 5%和86. 4%，说明MODS方法在耐多药结核杆菌的检测中有良好的应用前景。但该方法目前必须依赖于倒置显微镜，不能肉眼非常直观的观察结果。3)氧化还原指示剂法(redox-1ndicator methods):在接种有结核菌的液体培养基中加入各种不同浓度抗结核药物及氧化还原指示剂，孵育一定时间后，根据指示剂是否发生颜色改变来判断是否有该菌株生长，如指示剂发生还原反应，则提示有结核菌生长，说明该菌株在此药物浓度下对此种药物耐药。此法不需特殊仪器，成本低廉。但是目前各种指示剂对分枝杆菌均具有一定的毒性，需要较高浓度的菌株样品、或者减少指示剂的用量、或者需要更长时间的培养才能获得结果，因此目前氧化还原指示剂法主要用于分枝杆菌临床分离株的药敏检测，无法用于含菌量很少的临床标本中分枝杆菌的直接药敏检测。
发明内容
本发明提供了一种微量分枝杆菌检测方法和药敏检测方法，采用固液两相培养基与分枝杆菌生长指示剂一起使用，意外地发现，在此培养体系内所述菌株生长指示剂对分枝杆菌几乎没有毒性，与现有的氧化还原指示剂法药敏检测时间大幅缩短，而且菌株用量更少，可用于临床标本分枝杆菌的直接药敏检测。本发明第一个目的是提供一种微量分枝杆菌药敏检测方法，步骤包括
步骤1，制备培养基，所述培养基由固体培养基和液体培养基组成，固体培养基在液体培养基的下方；液体培养基中含有结核杆菌生长指示剂；并将抗分枝杆菌药物配置于培养基中；
步骤2，将待测菌株样品加入到步骤I培养基中； 步骤3，将加入待测菌株样品的培养基在37°C条件下培养7 35天，作为实验组；观察液体培养基是否变色，或观察固体培养基表面或液体培养基中是否出现带色颗粒。其中，所述培养基为可用的培养分枝杆菌的培养基，包括固体培养基、液体培养基、和菌株生长指不剂。固体培养基如米氏7H10琼脂糖培养基、罗氏培养基等，也可以是本领域其它固体培养基，或上述固体培养基的任意混合物。所述固体培养基中还可以含有孔雀绿。 液体培养基如含10%0ADCA或10%ADC的米氏7H9液体培养基，也可以是本领域其它液体培养基(如苏通培养基)，或上述液体培养基的任意混合物。所述液体培养基中还可以含有抗生素用于抑制常见快速生长的病源微生物，如金黄色葡萄球菌、链球菌、铜绿假单胞菌、绿脓杆菌、白色念珠球菌等。上述的方法中，所述固体培养基与液体培养基体积比优选为I1:5。上述的方法中，所述生长指示剂可以是XTT (3，3’-[1_(苯氨酰基)_3，4四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠)、刃天青(偶氮间苯四酚)等等，此时观察液体培养基是否变色；如果变色，则待测菌株样品对药物不明感，如果不变色、或变色不明显，则待测菌株样品对药物敏感。本发明优选的生长指示剂为TTC (2，3，5-氯化三苯基四氮唑)和/或MTT (溴化噻唑蓝四氮唑)，此时观察液体培养基中或固体培养基表面是否出现带色颗粒，如果出现带色颗粒，则待测菌株样品对药物不明感，如果不不出现带色颗粒、或带色颗粒很少，则待测菌株样品对药物敏感。所述生长指示剂在所述液体培养基中的浓度优选为I μ g/mf IOOyg/ml ο本发明上述的方法中，优选将待测菌株用液体培养基培养至104CFU/ml浓度，并每Iml液体培养基中加入待测菌株悬液O.1ml0上述的方法中，所述分枝杆菌优选为结核分枝杆菌，可用的抗结核药物如利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇、氧氟沙星、莫西沙星、阿米卡星、卷曲霉素等；抗结核药物可以加入到液体培养基中，也可以加入到固体培养基中。本发明上述的方法中，加入抗结核药物进行检测时，也可以设有不加抗分枝杆菌感染药物的对照组，对照组加入菌量为实验组的1°/Γ10%，优选为10%，其它条件相同。培养至对照组液体培养基变色或出现带色颗粒，即可进行判定判定方法如下含药待测组中固体培养基表面出现带色颗粒比对照组多，则表示待测菌株对所述药物不敏感，则判定为菌株对该药物的耐药；待测组固体表面培养基表面没有出现带色颗粒或者比对照组少，表示待测菌株对所述药物敏感，则判定为菌株对该药物不耐药或敏感。本发明第二个目的是提供一种微量分枝杆菌鉴定方法，步骤包括
步骤1，制备培养基，所述培养基由固体培养基和液体培养基组成，固体培养基在液体培养基的下方；液体培养基中含有分枝杆菌生长指示剂；并将分枝杆菌鉴定试剂配置于培养基中；所述分枝杆菌生长指示剂优选为结核分枝杆菌生长指示剂，所述分枝杆菌鉴定试剂优选为结核分枝杆菌将定试剂； 步骤2，将待测菌株样品加入到步骤I培养基中；
步骤3，将加入待测菌株样品的培养基在37°C条件下培养7 35天，作为实验组；观察液体培养基是否变色，或观察固体培养基表面或液体培养基中是否出现带色颗粒，并记录带色颗粒数。其中，所述培养基为可用的培养分枝杆菌的培养基，包括固体培养基、液体培养基、和菌株生长指不剂。固体培养基如米氏7H10琼脂糖培养基、罗氏培养基等，也可以是本领域其它固体培养基，或上述固体培养基的任意混合物。所述固体培养基中还可以含有孔雀绿。液体培养基米氏7H9液体培养基，也可以是本领域其它液体培养基(如苏通培养基)，或上述液体培养基的任意混合物。本发明优选为如含10%0ADCA或10%ADC的米氏7H9液体培养基。所述液体培养基中还可以含有抗生素用于抑制常见快速生长的病源微生物，如金黄色葡萄球菌、链球菌、铜绿假单胞菌、绿脓杆菌、白色念珠球菌等。上述的方法中，所述固体培养基与液体培养基体积比优选为I1:5。上述的方法中，所述结核分枝杆菌鉴别试剂如对硝基苯甲酸、噻吩-2-羧酸肼等等。核分枝杆菌鉴别试剂可以加入到液体培养基中，也可以加入到固体培养基中。上述的方法中，所述生长指示剂可以是XTT (3，3’-[1_(苯氨酰基)_3，4四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠)、刃天青(偶氮间苯四酚)等等，此时观察液体培养基是否变色。本发明优选的生长指示剂为TTC (2，3，5-氯化三苯基四氮唑)和/或MTT (溴化噻唑蓝四氮唑)，此时观察液体培养基中或固体培养基表面是否出现带色颗粒。所述生长指示剂在所述液体培养基中的浓度优选为I μ g/πιΓ ΟΟ μ g/ml。本发明上述的方法中，优选将待测菌株用液体培养基培养至104CFU/ml浓度，并每Iml液体培养基中加入待测菌株悬液O.1ml0本发明上述微量分枝杆菌检测方法或药敏检测方法的一种优选实施方式，其中，步骤3中所述培养在微量多孔板中进行，每个培养孔的开口处对应有一个凸透镜，所述凸透镜可以是设置在培养孔的开口，多孔板有配套的盖子，盖子对应于培养孔的位置设有凸透镜。本发明上述的微量分枝杆菌检测方法或药敏检测方法中，待测菌株样品可以是痰标本、胸水、脑脊液、血液等含有或疑似含有分枝杆菌的体液标本，也可以是分离的分枝杆菌菌株。本发明提供的微量检测分枝杆菌和药敏检测的方法，采用两相培养基与分枝杆菌生长指示剂进行分枝杆菌的检测，出乎意料地，指示剂对待测菌株几乎没有毒性，从而仅需少量的菌株样品即可完成药物敏感性检测和菌种的鉴定。即使是l(T5mg/ml浓度的菌株样品，检测时间仅需10天左右，而传统氧化还原指示剂法检测时间需要I个月以上，检测时间大幅缩短。同时由于指示剂对待测菌株几乎没有毒性，还可以通过加大指示剂的用量使显色更为明显，观察更为准确。由于结核杆菌指示剂能够通过颜色的变化来直观的现实待测菌的培养生长情况，因此，本发明药敏检测方法无需其他仪器，即可肉眼直接观察到细菌生长产生的显色颗粒，从而判断菌株的药物敏感性和进行菌种鉴定。
综上，本发明提供了一种快速、简单、直观、而且经济的分枝杆菌检测方法和分枝杆菌药敏检测方法，该方法可用于检测分枝杆菌的药敏性、分枝杆菌的鉴定、以及抗分枝杆菌药物的研发和筛选。
具体实施例方式本发明提供了一种微量分枝杆菌的药敏检测方法，将固体培养基、液体培养基以及分枝杆菌生长指示剂配合使用，意外地发现，在此情况下菌株生长指示剂对分枝杆菌几乎没有毒性，仅需少量的菌株样品即可进行药敏检测实验。本发明药敏检测方法无需显微镜等其它设备和仪器，通过指示剂颜色的变化可直观的观察药敏检测结果。下面通过具体实施例，对本发明微量分枝杆菌药敏检测方法进行详细的介绍和描述，意识更好的理解本发明范围，但是下述实施例并不限制本发明范围。实施例1
取无菌微量多孔板，培养孔中加入Iml罗氏培养基，然后凝固得到固体培养基。固体培养基凝固后，培养孔内加入Iml液体培养基,本实施例中液体培养基为含10%0ADC营养添加剂的米氏7H9液体培养基。本发明实验组向不同培养孔内液体培养基中分别加入结核分枝杆菌生长指示剂TTC, TTC在液体培养基中浓度为10 μ g/ml。对比组1:不使用固体培养基，而且液体培养基中不加任何指示剂，其他条件与实验组相同。结核分枝杆菌菌株用液体培养基培养至104CFU/ml，向培养孔内加入O.1ml结核分枝杆菌悬液。盖上盖板，将微量多孔板置于37°C培养箱内培养，实验组肉眼观察是否出现红色颗粒(即结核分枝杆菌生长)，对比组I用倒置显微镜观察是否出现特征性索状结构(即结核分枝杆菌生长)。检测结果发现，两组回报结果时间大致相当，说明本发明检测方法中生长指示剂对结核分枝杆菌几乎没有毒性。对比组2 :不使用固体培养基，10%0ADC营养添加剂的米氏7H9液体培养基2ml，其他条件与实验组相同，肉眼观察是否出现红色颗粒(即结核分枝杆菌生长)结果发现，对比组2出现红色颗粒的时间比实验组多1(Γ20天。实施例2取无菌微量多孔板，培养孔中加入Iml罗氏培养基，然后凝固得到固体培养基。
固体培养基凝固后，培养孔内加入2ml液体培养基,本实施例中液体培养基为含10%0ADC营养添加剂的米氏7H9液体培养基。向培养孔内加入利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇、氧氟沙星、莫西沙星、阿米卡星、卷曲霉素和卡那霉素等抗结核分枝杆菌感染的药物，同时向液体培养基中加入结核分枝杆菌生长指示剂MTT，MTT在液体培养基中浓度为20 μ g/ml。磨菌比池后的临床分离株用液体培养基培养至104CFU/ml,向培养孔内加入O.1ml结核分枝杆菌悬液。盖上盖板，将微量多孔板置于37°C培养箱内培养，20天后观察结果，观察时直接肉眼透过微量多孔板的盖板进行观察，观察是直接肉眼透过微量多孔板的盖板进行观察，培养孔内出现灰褐色颗粒，说明表示该培养孔内待测菌株对该药物不敏感，不是结核分枝杆菌，培养孔内没有出现灰褐色颗粒，说明表示该培养孔内待测菌株对该药物敏感，是结核分枝杆菌。实施例3
取无菌微量多孔板，培养孔中加入Iml高压灭菌米氏7H10琼脂糖固体培养基。然后培养孔内加入2ml液体培养基，本实施例中液体培养基为含10%0ADC营养添加剂的米氏7H9液体培养基。向不同培养孔内分别加入对硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)，，同时向液体培养基中加入50 μ g结核分枝杆菌生长指示剂TTC。磨菌比池后的临床分离株用液体培养基培养至104CFU/ml,向培养孔内加入O.1ml结核分枝杆菌悬液。盖上盖板，将微量多孔板置于37°C培养箱内培养，10天后观察结果，观察时直接肉眼透过微量多孔板的盖板进行观察，PNB培养孔内出现红色颗粒，说明待测菌株不是结核分枝杆菌；PNB和TCH培养孔内均没有出现红色颗粒，说明待测菌株是人结核分枝杆菌；如果PNB培养孔内没有出现红色颗粒，而TCH培养孔内有红色颗粒，则说明待测菌株为牛结核分枝杆菌。实施例4
取无菌微量多孔板，培养孔中加入Iml高压灭菌米氏7H10琼脂糖固体培养基。固体培养基中还加入有孔雀绿。固体培养基凝固后，每个培养孔内加入Iml液体培养基,本实施例中液体培养基为含10%0ADC营养添加剂的米氏7H9液体培养基。液体培养基中还加入混合抗生素，抑制包括金黄色葡萄球菌、链球菌、铜绿假单胞菌、绿脓杆菌、白色念珠球菌等细菌的生长。向不同培养孔内分别加入利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇、氧氟沙星、莫西沙星、阿米卡星、卷曲霉素和卡那霉素等抗结核分枝杆菌感染的药物，同时向液体培养基中加Λ 50 Ug结核分枝杆菌生长指示剂TTC。磨菌比浊后的临床分离株(待测样品)用液体培养基培养至104CFU/ml，向培养孔内加入O.1ml结核分枝杆菌悬液,作为实验组。同时设置对照组，对照组中不加抗结核药物，并且待测样品加入量为O. 01ml。
盖上盖板，将微量多孔板置于37°C培养箱内培养，2天后观察固体培养基的绿色是否加深，如果绿色明显变深则表示有其他结核分枝杆菌污染，需要重新进行检测。7天后，对照组中出现红色颗粒，观察实验组结果，观察时直接肉眼透过微量多孔板的盖板进行观察，培养孔内出现红色颗粒，说明表示该培养孔内待测菌株对该药物不敏感，不是结核分枝杆菌，培养孔内没有出现红色颗粒，说明表示该培养孔内待测菌株对该药物敏感，是结核分枝杆菌。实施例5
取无菌24孔微量多孔板，每个培养孔中加入Iml罗氏培养基，然后凝固得到固体培养·基，固体培养基中还加入有孔雀绿。并且不同培养孔内固体培养基中分别加入利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇、氧氟沙星、莫西沙星、阿米卡星、卷曲霉素和卡那霉素等抗结核分枝杆菌感染的药物。固体培养基凝固后，每个培养孔内加入Iml液体培养基，本实施例中液体培养基为含10%0ADC营养添加剂的米氏7H9液体培养基。液体培养基中还加入混合抗生素，抑制包括金黄色葡萄球菌、链球菌、铜绿假单胞菌、绿脓杆菌、白色念珠球菌等细菌的生长。向液体培养基中加入100 μ g结核分枝杆菌生长指示剂TTC。经液化处理的含结核分枝杆菌的痰标本沉淀用磷酸盐缓冲液(或生理盐水)洗涤2次，液体培养基重悬，向每个培养孔中加入O.1ml痰标本沉淀悬池液。磨菌比池后的临床分离株用液体培养基培养至104CFU/ml,向培养孔内加入O.1ml结核分枝杆菌悬液。盖上盖板，将微量多孔板置于37°C培养箱内培养，7天后观察结果，观察时直接肉眼透过微量多孔板的盖板进行观察，培养孔内出现红色颗粒，说明表示该培养孔内待测菌株对该药物不敏感，不是结核分枝杆菌，培养孔内没有出现红色颗粒，说明表示该培养孔内待测菌株对该药物敏感，是结核分枝杆菌。实施例6
取无菌微量多孔板，培养孔中加入Iml罗氏培养基，然后凝固得到固体培养基，固体培养基中还加入有孔雀绿。固体培养基凝固后，每个培养孔内加入5ml液体培养基,本实施例中液体培养基为含10%0ADC营养添加剂的米氏7H9液体培养基。液体培养基中还加入混合抗生素，抑制包括金黄色葡萄球菌、链球菌、铜绿假单胞菌、绿脓杆菌、白色念珠球菌等细菌的生长。向培养孔内加入新研发的可能抗结核分枝杆菌感染的药物，同时向液体培养基中加入200 μ g结核分枝杆菌生长指示剂TTC。结核分枝杆菌用液体培养基培养至104CFU/ml，向培养孔内加入O.1ml结核分枝杆菌悬液。盖上盖板，将微量多孔板置于37°C培养箱内培养，20天后观察结果，观察时直接肉眼透过微量多孔板的盖板进行观察，培养孔内出现红色颗粒，说明结核分枝杆菌对该培养孔内待测药物不敏感，该药物不能用作抗结核感染药物；如果培养孔内没有出现红色颗粒，说明结核分枝杆菌对该培养孔内待测药物敏感，该药物可用作抗结核感染药物。
同时，上述实施例中，盖板为透明盖板，而且盖板在每个培养孔所对应点位置处还可以设有凸透镜，通过凸透镜放大培养孔中出现的红色颗粒，从而更为方便的进行观察。实施例7
孔雀绿加入米氏9H10琼脂糖固体培养基中，高压灭菌，取Iml灭菌后的固体培养基加入24孔板。然后加入I含100ADC营养添加剂的米氏7H9液体培养基，分别向不同孔内加入利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇、氧氟沙星、莫西沙星、阿米卡星、卷曲霉素、卡那霉素(以上为药物组)、对硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH);同时向液体培养基中添加生长指示剂TTC，浓度为50 μ g/ml。
液化处理的痰标本沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤2次，用液体培养基重悬，向每个孔内加入O.1ml标本沉淀悬浊液；向不加药物和鉴别试剂的孔内加入O. Olml标本沉淀悬浊液，作为对照组。盖上盖板，密封。37°C培养，7天后通过盖板上肉眼观察结果
O如果对照组和药物组均出现红色颗粒，则表示待测菌株对抗结核药物不敏感(耐
药)；
2)如果对照组出现红色颗粒，而药物组不出现红色颗粒，则表示待测菌株对抗结核药物敏感(不耐药)；
3)如果PNB孔内出现红色颗粒，则表示待测菌株为非结合分枝杆菌；
4)如果PNB孔和TCH孔内均无红色颗粒，则表示待测菌株为人结核分枝杆菌；
5)如果PNB孔无红色颗粒，而TCH孔内有红色颗粒，则表示待测菌株为牛结核分枝杆菌。上述内容虽然仅以结核分枝杆菌为例进行了介绍，但是，同通过上述描述，本领域技术人员能够理解的是，本发明也可以用于其他分枝杆菌的药敏及初步菌种鉴定；而且根据培养基颜色和红色颗粒进行判定的方法可以由本领域技术人员根据使用的指示剂和鉴别试剂采用现有技术进行实施。以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
权利要求
1.一种微量分枝杆菌鉴定或药敏检测方法，其特征在于，步骤包括 步骤1，制备培养基，所述培养基由固体培养基和液体培养基组成，固体培养基在液体培养基的下方；液体培养基中含有结核杆菌生长指示剂；并将抗分枝杆菌药物或分枝杆菌鉴定试剂配置于培养基中； 步骤2，将待测菌株样品加入到步骤I培养基中； 步骤3，将加入待测菌株样品的培养基在37°C条件下培养7 35天；观察是否出现带色颗粒，或液体培养基是否变色。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生长指示剂为TTC或MTT。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述生长指示剂在所述液体培养基中的浓度为 I U g/ml^lOO u g/mlo
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液体培养基为含10%0ADC培养基和/或10%ADC培养基的米氏7H9液体培养基。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固体培养基为米氏7H10培养基、罗氏培养基中的一种或两种的混合物。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述固体培养基为罗氏培养基，所述液体培养基为含10%0ADC营养添加剂的米氏7H9液体培养基。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述固体培养基与所述液体培养基体积比为1:1 1:5。
全文摘要
本发明提供了一种微量分枝杆菌的检测方法和药敏检测方法，采用固体培养基、液体培养基与能表示分枝杆菌生长的指示剂进行检测，只需少量菌株，和更短的时间内即可完成多个药物的药敏检测和分枝杆菌的鉴定，无需显微镜等仪器，肉眼即可观察检测结果。
文档编号C12Q1/04GK103014120SQ20111028305
公开日2013年4月3日 申请日期2011年9月22日 优先权日2011年9月22日
发明者崔振玲, 胡忠义, 王洁, 陆俊梅, 黄晓辰 申请人:上海市肺科医院