一种多维多浓度药敏检测微流控芯片的制作方法
【专利摘要】本实用新型提供了一种多维多浓度药敏检测微流控芯片，该微流控芯片由玻璃基片、第一膜片、第二膜片和多孔膜组成；第一膜片上有细胞三维培养单元；第二膜片上有梯度浓度生成器和细胞二维培养通道；在第一膜片和第二膜片之间有一层多孔膜；细胞三维培养单元的个数与细胞二维培养通道相同；细胞二维培养通道分别位于细胞三维培养单元上方。该微流控芯片类似一个处于流动状态的多浓度药物透过血管内皮细胞屏障作用于管周组织的仿生模型，可同时考察多浓度药物对三维培养病变细胞的作用和对血管内皮细胞的毒性。该产品具有操作简单、低消耗、高通量、仿生性强等优点，在生物医学研究中具有重要的价值和广阔的应用前景。
【专利说明】一种多维多浓度药敏检测微流控芯片
【技术领域】
[0001]本实用新型属于将微流控芯片技术应用于生物医学研究领域，涉及一种检测多种浓度药物作用于三维培养及二维培养的细胞的微流控芯片。
【背景技术】
[0002]目前，检测药物敏感性的常用体外模型为96孔板，将细胞培养于孔板中，然后于每个孔中分别加入不同种类或不同浓度的药物，观察药物对细胞的影响。但是这样的方法有很多缺点:1)操作繁琐，工作量大，例如孔板中的一个孔只能代表一种浓度，为遵循生物学研究的三个平行复孔实验原则，同一种浓度需要3个孔，如果需要检测6种药物浓度，就需要18个孔，即18次进样过程；2)孔板的底面积大，试剂消耗多；3)药物在孔板中是呈静止状态，不能现体内药物在血管中随血液流动的状态；4)药物直接作用于细胞，而在体内药物需要透过血管内皮屏障后才能作用于细胞。因此，96孔板方法在考察药物的作用和毒性方面有很大的局限性。
[0003]微流控芯片技术起始于20世纪90年代，是近年来发展的一项新技术，也是目前已被公认的系统生物学研究的主要技术平台之一。它是指把常规生物或化学实验室的基本功能如样品制备、反应、分离、检测等集成或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道构成网络，以可控流体贯穿整个系统的一种技术，具有耗量少、通量高、集成化、仿生性强等特性。微流控芯片制作材料具有透气、透光、透明等特征，可清楚地观察到细胞的生长状况，方便数据采集。
[0004]本实用新型构建了一种多维多种药物检测微流控芯片，在该芯片上可以生成多种浓度的药物，进而不同浓度的药物透过内皮细胞屏障作用于三维培养的细胞，该模型可用来模拟体内血液内的药物透过内皮细胞屏障作用于病变组织的过程，即可以考察药物对病变组织的作用效果，同时也可以考察药物对内皮细胞的毒性。
实用新型内容
[0005]本实用新型的目的在于提供一种操作简单方便的微流控芯片，实现多种类、多浓度药物同时作用于二维及三维培养的细胞，同时检测药效和药物毒性。
[0006]一种多维多浓度药敏检测微流控芯片，该微流控芯片由玻璃基片1、第一膜片2、第二膜片3和多孔膜4组成，其特征在于:第一膜片2上有η个细胞三维培养单元5 ;细胞三维培养单元5由细胞进样口 6、三个相连的细胞三维培养池7和细胞出样口 8构成；第二膜片3上有可以生成η种浓度的梯度浓度生成器9和η条细胞二维培养通道10 ;细胞二维培养通道10的一端与梯度浓度生成器9相连，另一端与内皮细胞进样口 11相连；η条细胞二维培养通道10分别位于η个细胞三维培养单元5的上方；多孔膜4位于细胞二维培养通道10和细胞三维培养单元5中间；以上η为大于零的整数。
[0007]本实用新型所述的多维多浓度药敏检测微流控芯片，其特征在于:所述梯度浓度生成器9由2个药物进样口 9a、2条进样通道9b和药物混合通道9c组成；其中药物混合通道9c由多层药物混合单元构成，每层药物混合单元包括一条横向通道以及多条与该条横向通道垂直相连的曲线形药物混合通道，且每层曲线形药物混合通道同时与下一层的横向通道相连通；第一层药物混合单元有三条曲线形药物混合通道，最末一层有η条曲线形药物混合通道，且每条曲线形药物混合通道均与一条细胞二维培养通道10相连；每条进样通道9b的一端设有药物进样口 9a，另一端与药物混合单元的第一条横向通道相连。
[0008]本实用新型所述多维多浓度药敏检测微流控芯片，其特征在于:第一膜片2上各细胞三维培养单元5相互独立，且平行排列；第二膜片3上的各细胞二维培养通道10相互独立，且平行排列。
[0009]本实用新型所述的多维多浓度药敏检测微流控芯片，其特征在于:所述多孔膜4为允许液体和细胞因子在第一膜片2的细胞三维培养单元5和第二膜片3的细胞二维培养通道10之间传送的膜，优选为聚碳酸酯膜。
[0010]本实用新型所述的多维多浓度药敏检测微流控芯片，其特征在于:第一膜片2和第二膜片3的材料为聚二甲基硅氧烷；玻璃基片1、第一膜片2和第二膜片3为不可逆封接。
[0011]采用本实用新型所述微流控芯片研究多维多浓度药敏检测方法为:分别在第一膜片2的细胞三维培养单元5内加入第一预定类型材料，在第二膜片3的通道内加入第二预定类型材料，在第二膜片细胞二维培养通道内多孔膜4表面接种一层第三预定类型材料，驱动第二预定类型材料在通道内流动，然后考察第二预定类型材料对第一预定类型材料和第三预定类型材料的作用情况。
[0012]所述第一预定类型材料为细胞、组织、器官；第二预定类型材料为培养基、药物、趋化因子或生长因子；第三预定类型材料为血管内皮细胞。
[0013]具体研究过程如下:
[0014]——通过细胞进样口 6将第一预定类型材料和细胞外基质替代物加入第一膜片细胞三维培养单元5内；
[0015]——通过药物进样口 9a将第二预定类型材料加入第二膜片的通道内；
[0016]——通过内皮细胞进样口 11将第三预定类型材料加入第二膜片的细胞二维培养通道10内，静置12?24小时，使第三预定类型材料充分贴附于多孔膜4表面；
[0017]—将注射泵与药物进样口9a相连接，驱动第二预定类型材料在通道内流动。
[0018]本实用新型所述微流控芯片类似于一个多浓度药物透过血管内皮屏障作用于管周三维病变组织的仿生模型，且同时考察药物对病变组织的效果和对血管内皮细胞的毒性。本实用新型解决了传统模型通量低、消耗大、仿生性差等问题，具有操作简单、低消耗、高通量、仿生性强等优点，在生物医学研究中具有重要的价值和广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1实施例1所述微流控芯片结构示意图，其中包括玻璃基片1、第一膜片2、第二膜片3、多孔膜4 ；
[0020]图2第一膜片2结构示意图；
[0021]图3第二膜片3结构示意图；
[0022]图4显示微流控芯片整体操作过程；
[0023]图5显示接种于多孔膜4表面的血管内皮细胞；
[0024]图6显示第二膜片3梯度浓度生成情况；在第二膜片3的药物进样口 9a两侧分别同时用注射泵驱动加入磷酸盐缓冲液(PBS)和荧光染料罗丹明-123后，荧光染料罗丹明-123通过梯度浓度生成器9形成六种逐渐增强的浓度的荧光强度情况(图中由左到右依次为细胞二维培养通道10a、10b、10c、1cU 10e、10f)；
[0025]图7显示微流控芯片中肿瘤细胞株(ACC-M)的药物敏感性试验；在第一膜片2的细胞三维培养单元5内接种三维基质胶包裹的肿瘤细胞株(ACC-M)，细胞二维培养通道10内接种血管内皮细胞株HUVEC，初始浓度为0.Syg/ml的紫杉醇(PTX)经过梯度浓度生成器9形成六种不同的药物浓度，进而作用肿瘤细胞株(ACC-M)的情况(图中由左到右依次为细胞三维培养单元5a、5b、5c、5d、5e、5f)。
【具体实施方式】
[0026]下面结合附图对本实用新型的【具体实施方式】作进一步详细地描述。
[0027]实施例1
[0028]本实验室自行设计及制备的微流控芯片结构如图1-3所示，该微流控芯片由玻璃基片1、第一膜片2、第二膜片3和多孔膜4组成，其中第一膜片2和第二膜片3的材料为聚二甲基硅氧烷，多孔膜4为聚碳酸酯膜，位于第一膜片2和第二膜片3中间。
[0029]第一膜片2上有六个相互独立的细胞三维培养单元5，每个细胞三维培养单元5由细胞进样口 6、三个相连的细胞三维培养池7和细胞出样口 8构成；第二膜片3上有可以生成6种浓度的梯度浓度生成器9和六条细胞二维培养通道10 ;细胞二维培养通道10的一端与梯度浓度生成器9相连，另一端与内皮细胞进样口 11相连；其中梯度浓度生成器9由两个药物进样口 9a、两条进样通道9b和药物混合通道9c组成；六条细胞二维培养通道10分别位于六个细胞三维培养单元5的上方。其中药物混合通道9c由四层药物混合单元构成，每层药物混合单元包括一条横向通道以及多条与该条横向通道垂直相连的曲线形药物混合通道，且每层曲线形药物混合通道同时与下一层的横向通道相连通；第一层有三条曲线形药物混合通道，第四层有六条曲线形药物混合通道；进样通道9b的一端设有药物进样口 9a,另一端与药物混合单元的第一条横向通道相连。
[0030]所述芯片的制备过程为:首先，通过不可逆封接技术将第一膜片2与玻璃基片I封接；然后，将多孔膜4覆盖于第一膜片2的细胞三维培养单元5上方；最后，将第二膜片3的细胞二维培养通道10对准第一膜片2上的细胞三维培养单元5进行不可逆封接。
[0031]如图4，通过细胞进样口 6加入肿瘤细胞，通过药物进样口 9a加入细胞培养基，37°C>5% CO2培养箱内培养，至细胞成球体；通过内皮细胞进样口 11将血管内皮细胞株HUVEC接种于多孔膜4的表面。然后将芯片置于37°C、5% CO2培养箱内培养24小时，使HUVEC充分贴附(图5)。
[0032]实施例2
[0033]采用实施例1所述芯片进行研究:通过两侧药物进样口 9a，利用注射泵分别驱动磷酸盐缓冲液(PBS)和荧光染料罗丹明-123通过梯度浓度生成器9，一段时间后，荧光染料罗丹明-123在六条细胞二维培养通道10内形成整体稳定的逐渐增强的六种不同浓度荧光强度的情况见图6。
[0034]实施例3
[0035]采用实施例1所述芯片进行研究:通过细胞进样口 6在第一膜片2的6个细胞三维培养单元5内加入三维基质胶包裹的肿瘤细胞株(ACC-M)，37°C、5% CO2培养箱内培养三天。通过内皮细胞进样口 11将血管内皮细胞株HUVEC接种于多孔膜4的表面，将芯片置于37°C>5% CO2培养箱内培养24小时，使HUVEC充分贴附。通过两侧药物进样口 9a利用注射泵分别驱动细胞培养基和紫杉醇(PTX，浓度为0.5 μ g/ml)药物通过梯度浓度生成器9，持续灌流24小时。去除第二膜片3，用H0echst33342和PI荧光染色，在荧光显微镜下拍照，计算ACC-M细胞生存情况(图7)。
[0036]上述实施例只为说明本实用新型的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本实用新型的内容并据以实施，并不能以此限制本实用新型的保护范围。凡根据本实用新型精神实质范围所作的等效变化、改型或修饰，都应涵盖在本实用新型的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种多维多浓度药敏检测微流控芯片，该微流控芯片由玻璃基片(I)、第一膜片(2)、第二膜片(3)和多孔膜(4)组成，其特征在于:第一膜片(2)上有η个细胞三维培养单元(5);细胞三维培养单元(5)由细胞进样口(6)、3个相连的细胞三维培养池(7)和细胞出样口(8)构成；第二膜片(3)上有可以生成η种浓度的梯度浓度生成器(9)和η条细胞二维培养通道(10);细胞二维培养通道(10)的一端与梯度浓度生成器(9)相连，另一端与内皮细胞进样口(11)相连；η条细胞二维培养通道(10)分别位于η个细胞三维培养单元(5)的上方；多孔膜(4)位于细胞二维培养通道(10)和细胞三维培养单元(5)中间；以上η为大于零的整数。
2.按照权利要求1所述的多维多浓度药敏检测微流控芯片，其特征在于:所述梯度浓度生成器(9)由2个药物进样口(9a)、2条进样通道(9b)和药物混合通道(9c)组成；其中药物混合通道(9c)由多层药物混合单元构成，每层药物混合单元包括一条横向通道以及多条与该条横向通道垂直相连的曲线形药物混合通道，且每层曲线形药物混合通道同时与下一层的横向通道相连通；第一层药物混合单元有三条曲线形药物混合通道，最末一层有η条曲线形药物混合通道，且每条曲线形药物混合通道均与一条细胞二维培养通道(10)相连；每条进样通道(％)的一端设有药物进样口(9a)，另一端与药物混合单元的第一条横向通道相连。
3.按照权利要求1或2所述的多维多浓度药敏检测微流控芯片，其特征在于:第一膜片(2)上各细胞三维培养单元(5)相互独立，且平行排列；第二膜片(3)上的细胞二维培养通道(10)相互独立，且平行排列。
4.按照权利要求1或2所述的多维多浓度药敏检测微流控芯片，其特征在于:所述多孔膜(4)为允许液体和细胞因子在第一膜片(2)的细胞三维培养单元(5)和第二膜片(3)的细胞二维培养通道(10)之间传送的膜。
5.按照权利要求4所述的多维多浓度药敏检测微流控芯片，其特征在于:所述多孔膜为聚碳酸酯膜。
6.按照权利要求1或2所述的多维多浓度药敏检测微流控芯片，其特征在于:第一膜片(2)和第二膜片(3)的材料为聚二甲基硅氧烷；玻璃基片(I)、第一膜片(2)和第二膜片(3)为不可逆封接。
【文档编号】C12M1/00GK204097450SQ201420262631
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年5月21日 优先权日:2014年5月21日
【发明者】刘婷姣, 金冬, 林炳承, 罗勇 申请人:大连医科大学