本发明涉及水产品加工领域，尤其是涉及鲶鱼鱼内脏蛋白酶的制备方法的加工技术。
背景技术：
鲶鱼在加工中留下可食用肉质部分，内脏弃去不用。伴随着大批量加工而产生的内脏，不仅造成生态污染，而且也是一种极大的资源浪费，内脏中含有丰富的酶类物质，大量研究表明鱼类内脏可作为蛋白酶的重要来源，鱼内脏中蛋白酶含量丰富，所含蛋白酶在较宽的温度范围内都具有活性，是良好的蛋白酶来源，采用内源酶的最大好处是成本低、活性较高、与底物结合好，因此以鲶鱼加工后所剩下的内脏为原料进行酶资源的开发、利用有着积极的意义，因此，研究鲶鱼鱼内脏蛋白酶的制备方法的提取工艺对鲶鱼产品的综合开发具有重要的现实意义，目前国内外在鱼内脏蛋白酶的研究上多侧重于酶的分离纯化和酶特性研究。
现有技术如授权公告号为cn104070711b的中国发明专利，公开了一种以鱿鱼内脏为原料提取得到的蛋白酶及其提取方法与应用。本发明以新鲜或者冰冻的鱿鱼内脏为原料，鱿鱼内脏经破碎后，用水或食盐溶液进行提取，通过控制提取过程中食盐溶液浓度、固液比、温度、提取时间得到较高的蛋白酶回收率；然后通过等电点沉淀法和添加絮凝剂沉淀等方法去除杂蛋白，提高酶的纯度；最后经浓缩、添加稳定剂、防腐剂等成为液体鱿鱼内脏蛋白酶酶制剂；或者添加填料后经干燥、粉碎，得固体鱿鱼内脏蛋白酶制剂。本发明实现了对鱿鱼内脏的增值利用，提高渔业生产附加值，减少鱿鱼制品生产对环境的污染，而且制备得到的鱿鱼蛋白酶作为水解各种食品蛋白质的酶制剂，增加了商品蛋白酶的品种，但此法提取的蛋白酶纯度不高、效率低、操作不方便。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种提取纯度高、提取方便、活性稳定的的鲶鱼鱼内脏蛋白酶的制备方法。
本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：鲶鱼鱼内脏蛋白酶的制备方法，包括浸提、盐析、透析、纯化，具体步骤为：
浸提：匀浆机均质鲶鱼内脏后,加入缓冲液浸提3~5h，鲶鱼内脏与缓冲溶液的重量体积比为1~1.5g:0.8ml，采用8000~9000r/min的转速将提取液离心10~15min，所得上清液即为鲶鱼内脏粗提液；通过均浆机将鲶鱼内脏组织打散并研磨成均匀的糊状物，使其能够与缓冲液充分接触，从而充分将细胞内含物释放出来，浸提、离心的操作，使固体颗粒与含有细胞内含物的液体分开，得到鲶鱼粗提液；
盐析：在鲶鱼内脏粗提液中加入饱和度硫酸铵沉淀后，鲶鱼内脏粗提液与饱和度硫酸铵的重量体积比为1g:1.3~1.6ml，在4~7℃、9000~10000r/min下离心12~15min；通过将鲶鱼内脏粗提液与硫酸铵溶液混合后，静置过夜后低温离心，即得盐析沉淀物，该步骤中加入大量的硫酸铵，使蛋白酶得溶解度降低而沉淀析出，该方法优点在于硫酸铵浓度变化具有连续性，盐析沉淀效果好，节约能耗；
透析：将沉淀物溶解在磷酸盐缓冲液中，在4~7℃的蒸馏水中透析30~32h，每6~8小时换1次蒸馏水。该透析过程是将与沉淀物溶解的磷酸盐缓冲液装入含有蒸馏水的透析袋中，密封进行透析，该方法利用小分子物质在溶液中可通过透析袋，而大分子物质不能通过透析袋的性质，达到分离小分子杂质的目的，操作简单，效果好，节约能耗；
纯化：将透析液采用羟基磷灰石吸附层析法制备鲶鱼内脏纯蛋白酶，层析柱规格为直径为2~5cm，长52~60cm，流动相选用ph为6.8~7、浓度为0.01~0.02mol/l的磷酸盐缓冲液，流速为0.3~0.7ml/min，将得到的用洗脱液洗脱后并冷冻干燥，即得鲶鱼内脏纯蛋白酶；羟基磷灰石是磷酸氢钙加碱经热处理后得到的碱式磷酸钙结晶，其表面有许多带正电荷的钙离子和带负电荷的po42-离子，羟基磷灰石吸附层析柱通过离子交换吸附，使其蛋白载量高，而加入的磷酸盐缓冲液可以除去样品中的非目的蛋白组分，同时可避免洗脱液对蛋白活性的影响，使纯化得到的鲶鱼内脏纯蛋白酶的纯度高、活性高；
作为优选，缓冲溶液为含有活性多肽的磷酸盐缓冲液，缓冲溶液的ph为6.6~7，缓冲液中活性多肽浓度为0.2~0.3%，上述活性多肽的氨基酸序列为scasrygrrcragrckgyacrcrsfrcragrsrigrckcfrc，鲶鱼鱼内脏蛋白酶的制备方法属于细胞内蛋白质，提取时需要破除其细胞膜，通过静电作用，活性多肽附着在细胞膜表面，活性多肽穿透细胞膜，使内脏细胞膜上形成小孔，导致内脏细胞内含物能够快速释放，提高浸提速率，从而提高了活性蛋白酶的得率，该缓冲液一方面可以维持浸提过程中体系的ph值处于一个平衡的状态，使得浸提能够顺利进行，另一方面可破坏内脏细胞膜的完整性，使得胞内物质游离出来，进而提高鲶鱼粗提液中有效成分的含量。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明提取的蛋白酶，纯度高、活性稳定，能作为各种水解食品蛋白质酶解剂，实现了对鲶鱼内脏的增值利用，提高了鲶鱼的经济附加值。同时，该方法提取的高纯度蛋白酶能够能提高淋巴细胞活性，从而增强了机体的防病、抗病能力，还能出乎意料的具有清除生物体内的自由基的效果。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
鲶鱼鱼内脏蛋白酶的制备方法包括浸提、盐析、透析、纯化，具体步骤为：
1）浸提：匀浆机均质鲶鱼内脏后,加入缓冲液浸提3~5h，采用8000~9000r/min的转速将提取液离心10~15min，所得上清液即为鲶鱼内脏粗提液；通过均浆机将鲶鱼内脏组织打散并研磨成均匀的糊状物，使其能够与缓冲液充分接触，从而充分将细胞内含物释放出来，浸提、离心的操作，使固体颗粒与含有细胞内含物的液体分开，得到鲶鱼粗提液；
2）盐析：在鲶鱼内脏粗提液中加入饱和度硫酸铵沉淀后，鲶鱼内脏粗提液与饱和度硫酸铵的重量体积比为1g:1.3~1.6ml，在4~7℃、9000~10000r/min下离心12~15min；通过将鲶鱼内脏粗提液与硫酸铵溶液混合后，静置过夜后低温离心，即得盐析沉淀物，该步骤中加入大量的硫酸铵，使蛋白酶得溶解度降低而沉淀析出，该方法优点在于硫酸铵浓度变化具有连续性，盐析沉淀效果好，节约能耗；
3）透析：将沉淀物溶解在磷酸盐缓冲液中，在4~7℃的蒸馏水中透析30~32h，每6~8小时换1次蒸馏水。该透析过程是将与沉淀物溶解的磷酸盐缓冲液装入含有蒸馏水的透析袋中，密封进行透析，该方法利用小分子物质在溶液中可通过透析袋，而大分子物质不能通过透析袋的性质，达到分离小分子杂质的目的，操作简单，效果好，节约能耗；
4）纯化：将透析液采用羟基磷灰石吸附层析法制备鲶鱼内脏纯蛋白酶，层析柱规格为直径为2~5cm，长52~60cm，流动相选用ph为6.8~7、浓度为0.01~0.02mol/l的磷酸盐缓冲液，流速为0.3~0.7ml/min，将得到的用洗脱液洗脱后并冷冻干燥，即得鲶鱼内脏纯蛋白酶；羟基磷灰石是磷酸氢钙加碱经热处理后得到的碱式磷酸钙结晶，其表面有许多带正电荷的钙离子和带负电荷的po42-离子，羟基磷灰石吸附层析柱通过离子交换吸附，使其蛋白载量高，而加入的磷酸盐缓冲液可以除去样品中的非目的蛋白组分，同时可避免洗脱液对蛋白活性的影响，使纯化得到的鲶鱼内脏纯蛋白酶的纯度高、活性高；
鲶鱼内脏与缓冲溶液的重量体积比为1~1.5g:0.8ml，缓冲溶液为含有活性多肽的磷酸盐缓冲液，缓冲溶液的ph为6.6~7，缓冲液中活性多肽浓度为0.2~0.3%，上述活性多肽的氨基酸序列为scasrygrrcragrckgyacrcrsfrcragrsrigrckcfrc，鲶鱼鱼内脏蛋白酶属于细胞内蛋白质，提取时需要破除其细胞膜，通过静电作用，活性多肽附着在细胞膜表面，活性多肽穿透细胞膜，使内脏细胞膜上形成小孔，导致内脏细胞内含物能够快速释放，提高浸提速率，从而提高了活性蛋白酶的得率，该缓冲液一方面可以维持浸提过程中体系的ph值处于一个平衡的状态，使得浸提能够顺利进行，另一方面可破坏内脏细胞膜的完整性，使得胞内物质游离出来，进而提高鲶鱼粗提液中有效成分的含量。
实施例2：
鲶鱼鱼内脏蛋白酶的制备方法，具体步骤为：
1）浸提：匀浆机均质鲶鱼内脏后,加入缓冲液浸提3~5h，采用8000~9000r/min的转速将提取液离心10~15min，所得上清液即为鲶鱼内脏粗提液；
2）盐析：在鲶鱼内脏粗提液中加入饱和度硫酸铵沉淀后，鲶鱼内脏粗提液与饱和度硫酸铵的重量体积比为1g:1.6ml，在5℃、10000r/min下离心13min；
3）透析：将沉淀物溶解在磷酸盐缓冲液中，在5℃的蒸馏水中透析30h，每7小时换1次蒸馏水；
4）纯化：将透析液采用羟基磷灰石吸附层析法制备鲶鱼内脏纯蛋白酶，层析柱规格为直径为2cm，长52cm，流动相选用ph为6.8、浓度为0.01mol/l的磷酸盐缓冲液，流速为0.3ml/min，将得到的用洗脱液洗脱后并冷冻干燥，即得鲶鱼内脏纯蛋白酶。
鲶鱼内脏与缓冲溶液的重量体积比为1g:0.8ml，缓冲溶液为含有活性多肽的磷酸盐缓冲液，缓冲溶液的ph为6.6，缓冲液中活性多肽浓度为0.2%，活性多肽的氨基酸序列为scasrygrrcragrckgyacrcrsfrcragrsrigrckcfrc。
实施例3：
鲶鱼鱼内脏蛋白酶的制备方法，具体步骤为：
1）浸提：匀浆机均质后,加入与之前等量的缓冲液浸提4h，采用9000r/min的转速将提取液离心13min，所得上清液即为鲶鱼内脏粗提液。
2）盐析：在鲶鱼内脏粗提液中加入饱和度硫酸铵沉淀后，鲶鱼内脏粗提液与饱和度硫酸铵的重量体积比为1g:1.3ml，在4℃、9000r/min下离心12min。
3）透析：将沉淀物溶解在磷酸盐缓冲液中，在6℃的蒸馏水中透析32h，每8小时换1次蒸馏水。
4）纯化：将透析液采用羟基磷灰石吸附层析法制备鲶鱼内脏纯蛋白酶，层析柱规格为直径为5cm，长60cm，流动相选用ph为7、浓度为0.02mol/l的磷酸盐缓冲液，流速为0.7ml/min，将得到的用洗脱液洗脱后并冷冻干燥，即得鲶鱼内脏纯蛋白酶。
鲶鱼内脏与缓冲溶液的重量体积比为1.5g:0.8ml，缓冲溶液为含有活性多肽的磷酸盐缓冲液，缓冲溶液的ph为7，缓冲液中活性多肽浓度为0.3%，活性多肽的氨基酸序列为scasrygrrcragrckgyacrcrsfrcragrsrigrckcfrc。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>金华市川璞农业科技有限公司
<120>鲶鱼鱼内脏蛋白酶的制备方法
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>42
<212>prt
<213>人工合成(mytiluscoruscus)
<400>1
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