一种黄单胞杆菌发酵生产葡甘聚糖酶的方法与流程

本发明涉及细菌的发酵培养及工艺，具体涉及一种黄单胞杆菌发酵生产葡甘聚糖酶的培养基及方法。
背景技术：
：葡甘聚糖(konjacglucomannan，kgm)是一种天然高分子杂多糖，它是魔芋的主要成分，由d-甘露糖与d-葡萄糖残基按照1.69:1(白魔芋，a.albus)或1.5或1.6:1(花魔芋，a.konjac)的分子比基于β-1,4-糖苷键相连接而成，其水溶性和凝胶性显著高于普通魔芋精粉，从而替代了普通魔芋精粉，并具有防止便秘的功效，还是一种植物性胶体且具有独特的理化性质，因而拥有广泛的开发价值和应用前景。葡甘聚糖酶(glucomannanase)是一种胞外分泌酶，它能够降解魔芋主要成分葡甘聚糖为葡甘低聚糖。有学者用从魔芋废渣中分离到的枯草芽孢杆菌b23生产葡甘聚糖酶，用来自海洋的枯草芽孢杆菌q1生产葡甘聚糖酶。目前葡甘聚糖酶的生产菌株，主要集中在枯草芽孢杆菌上，本发明采用的是植物病原菌黄单胞杆菌属的甘蓝黑腐黄单胞菌桃穿孔致病型，以拓宽产葡甘聚糖酶的菌株资源。因此研究黄单胞杆菌葡甘聚糖酶具有重要意义。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种黄单胞杆菌发酵生产葡甘聚糖酶的培养基及方法，具有葡甘聚糖酶产率高，活力高等优点。本发明采取的技术方案如下：一种黄单胞杆菌发酵生产葡甘聚糖酶的初始培养基原料，含甘露醇12g/l，蛋白胨16g/l，mn2+399.04g/l，维生素b20.02g/l；ph为5.6。本发明的显著优点在于：本发明的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；培养基具有葡甘聚糖酶产率高，葡甘聚糖酶活力高等优点。附图说明图1不同碳源对黄单胞杆菌产葡甘聚糖酶的影响；图2不同氮源对黄单胞杆菌产葡甘聚糖酶的影响；图3不同金属离子对黄单胞杆菌产葡甘聚糖酶的影响；图4不同维生素对黄单胞杆菌产葡甘聚糖酶的影响；图5不同ph对黄单胞杆菌产葡甘聚糖酶的影响。具体实施方式本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实。实施例1：单因素实验确定培养基最优成分1)种子培养基配制：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，ph为7，121℃灭菌20min。2)发酵种子的制作：将黄单胞杆菌接种于lb固体平板培养基上，于35℃下培养24h，即活化；将活化后的菌株用接种针将菌体接种至种子培养基，35℃，转速150r/min下培养24h，即为发酵液。3)酶液的制备取步骤2)的种子液5ml接种于产葡甘聚糖酶的培养基中培养34h，接种量为10％，取发酵液在4℃下，10000r/min离心10min，得上清液即为粗酶液待用。按酶活性测定在在波长540nm处测定吸光值。所述产葡甘聚糖酶的培养基含甘露醇12g/l，蛋白胨16g/l，mn2+399.04g/l，维生素b20.02g/l；ph为5.6。4)试剂的配制a试剂-dns显色剂：秤取酒石酸钾钠182g、naoh21g、3,5-二硝基水杨酸6.3g和苯酚5g。先将182g的酒石酸钾钠加热溶解于500ml的蒸馏水中，加热温度不宜超过50℃，再向热溶液中加入21g的naoh，随后立即加入6.3g的3,5-二硝基水杨酸，其中naoh和3,5-二硝基水杨酸加入的时间一定要十分接近，否则会产生很难溶的沉淀物质，最后加入5g的苯酚，溶解定容至1000ml，在室温下避光保存一周后使用。b溶液-0.4％葡甘聚糖溶液：精确秤取4g葡甘聚糖，用蒸馏水溶解并定容至1000ml，室温保存。c溶液-1mg/ml标准甘露糖溶液：在105℃下将无水甘露糖干燥至恒重，秤取干燥后的甘露糖100mg，用蒸馏水溶解后定容至100ml，室温保存。5)葡甘聚糖酶的酶活测定取2ml粗酶液于10000r/m下离心10min，取离心后的上清酶液0.1ml于试管中，加入0.9ml的b溶液，于30℃水中水浴10min后立刻放入100℃中水浴5min，水浴结束后流水冷却终止反应，然后加入2mldns显色剂，放入100℃中水浴显色5min，水浴后用流水冷却终止反应，用蒸馏水定容至20ml，摇匀后用酶标仪于波长为540nm处测定其吸光度值，每组样品设定3个重复取平均值以提高实验结果的准确性。根据甘露糖标准曲线得出的线性回归方程计算出相应吸光度值(y)所对应的质量浓度(x＝(y-0.026)/0.8342)，再根据葡甘聚糖酶酶活公式e＝(x*200)/(0.1×10)计算出酶活。6)标准曲线的制作取10支25ml的具塞试管，按照(表1)给出的配制方法依次加入a试剂、蒸馏水和c溶液，摇匀。将各试管在100℃下水浴5min，待其冷却定容至20ml，摇匀测定各溶液的od值(波长＝540nm)。以0号管作空白，将所得结果以甘露糖的质量浓度作为横坐标(x)，所测出的od540nm值作为纵坐标(y)，绘制甘露糖标准曲线。通过试验得出线性回归方程：y＝0.8342x，r2＝0.9996。表1甘露糖标准曲线制作表格7)不同碳源、氮源、金属离子、维生素对产脂肪酶的影响在基础发酵培养基中分别更换不同单因素的营养条件(不同碳源、氮源、维生素、金属离子等)，接种相同的黄单胞杆菌菌液，测定其葡甘聚糖酶活性，实验结果见下图1～5。实施例2正交实验确定最优发酵条件正交实验确定最佳培养基1)从单因素实验确定的培养基的基础上，改变各成分的溶度，配置不同的培养基，五因素四水平配制配方见表2，将相同量的接种量(5ml)菌种接种于250ml，装有100ml培养液，在35℃，转速150r/min下培养。然后测定酶活，选取正交实验最优结果和其产酶量最高的实验组号，进行验证实验。为了避免累赘，实施例中的培养基配法、粗酶液的制作、酶活测定方法均与实施例1的方法相同。(正交实验结果见表3)表2正交试验设计方案表3正交试验结果注:ⅰ1为各因素水平1的所有酶活力之和，ⅱ2为各因素水平2的所有酶活力之和，ⅲ3为各因素水平3的所有酶活力之和，ⅳ4为各因素水平4的所有酶活力之和，r为极差，酶活力的数字代表3次重复的平均值(mean)±标准差(s.d)。表4培养基优化验证试验项目平均酶活力u/mla3b2c4d3e1698.729a3b3c4d3e1708.247从5因素4水平的16个组合中显示最优组合为a3b3c4d3e1，即最优产葡甘聚糖酶的培养基组成为甘露醇12g/l，蛋白胨16g/l，mn2+399.04g/l，维生素b20.02g/l及ph5.6，且结果与验证试验相符合。根据极差r可知，蛋白胨、锰离子和维生素对的变化与黄单胞杆菌产葡甘聚糖酶息息相关，其中锰离子浓度的改变对产酶影响在5个因素非常显著，ph的变化对产酶影响最小。最终优化后从最初的142.19u/ml酶活达到了734.247u/ml，提高了4.98倍。该实施例表明本发明的摇瓶实验工艺良好。以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。当前第1页12