一种海带GDP岩藻糖合成酶、及其编码基因和用途的制作方法

本发明涉及一种海带gdp岩藻糖合成酶及其编码基因、用途；属于生物领域。
背景技术：
：海带是全世界主要栽培的海洋植物(藻类)种类。作为一种海洋蔬菜，海带具有很高的营养价值，同时，褐藻胶、岩藻多糖(褐藻糖胶)等主要经济成分，可以作为原材料广泛应用于各行各业。褐藻胶的用途广泛，主要应用在食品工业、医药卫生、纺织工业、科学研究等方面。岩藻多糖不仅可以作为金属离子的结合剂和阻吸剂，同时还具有如抗hiv病毒、抗凝血、抗血栓、抗肿瘤等生理功能和功效，是一种重要的药用物质。克隆产物合成相关基因并验证其功能，揭示基因与产物之间的关系，辅助开展品种改良已成为国际农业育种领域提高经济成分含量的有效途径之一；同时，利用基因工程技术生产活性物质与经济产物已成为现代生物技术产业发展的核心内容。岩藻多糖(岩藻多糖硫酸酯，fucoidan或fucansulfate，fs)是一种主要存在于褐藻细胞壁和一些海洋无脊椎动物中的多糖，由l-岩藻糖和硫酸基团组成，此外还有d-木糖、d-半乳糖或者糖醛酸。岩藻多糖的生物来源仅为褐藻纲藻类、海洋无脊椎动物及微生物，如真海带(saccharinajaponica)、马尾藻属(sargassum)、棕色固氮菌(azotobactervinelandii)、海洋假单胞细菌(pseudomonassp.)、铜绿假单胞细菌(pseudomonasaeruginosa)、halomonasmarina等。海带等褐藻是褐藻胶和岩藻多糖天然来源，其大生物量和高含量的特点使其一直以来就是岩藻多糖提取的主要原料。技术实现要素：本发明的目的之一在于提供一种海带gdp岩藻糖合成酶，命名为sjagfs；其氨基酸序列如seqidno：1所示。在本发明中，所述海带gdp岩藻糖合成酶可以将gdp-4-酮-6-脱氧甘露糖催化为gdp-4-酮-6-脱氧半乳糖，进一步地海带gdp岩藻糖合成酶将gdp-4-酮-6-脱氧半乳糖催化为gdp-岩藻糖。其是海带中由gdp-甘露糖转化为gdp-岩藻糖的关键步骤。本发明的目的之二在于提供一种编码海带gdp岩藻糖合成酶的基因，所述基因是从海带(saccharinajaponica)中分离出来的，其序列如seqidno：2所示。本发明目的之三是所述基因及其编码蛋白在合成岩藻多糖中的应用。本发明目的之四是所述基因及其编码蛋白在改良经济成分性状中的应用。本发明通过基因克隆的方法，从海带中克隆到了一个海带gdp岩藻糖合成酶的编码基因，并通过实验证明了其编码的蛋白具有显著的将gdp-4-酮-6-脱氧甘露糖催化为gdp-4-酮-6-脱氧半乳糖的活性，是岩藻多糖的关键基因。克隆和分析海带gdp岩藻糖合成酶的编码基因会为岩藻多糖基因工程和分子育种提供了基因资源。本发明首次从海带(saccharinajaponica)中分离到海带gdp岩藻糖合成酶的编码基因，并通过真核表达载体对重组蛋白进行酶活性检测，证实了其活性功能，具有岩藻多糖基因工程和分子育种的应用价值。附图说明图1为以gdp-甘露糖作为前体的岩藻多糖合成通路示意图。图2为编码海带gdp岩藻糖合成酶基因转化酵母表达产物的western-blot检测图。图3为本发明制备的编码海带gdp岩藻糖合成酶sjagfs的酶活检测质谱图。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆实验指南(sambrookj,etal.2008.molecularcloning:alaboratorymanual,3rded.)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1：基因全长编码区的克隆与分析海带采集自山东省荣成市，采集时间为2011年7月。采用trizol法提取海带雌配子体总rna，以海带配子体总rna反转录的第一链cdna为模板，采用touchdownpcr技术和普通pcr技术进行海带gfs基因的cds序列的扩增，扩增引物包括2组(5′-attagaattcatggcggagaccagcggaaccg-3′和5′-aattgcggccgcctacttgcgggcggtc-3′；5′-ttaatgaattcatggcggagaccagcggaaccg-3′和5′-ttaatgcggccgcctacttgcgggcggtc-3′)，获得全长序列。pcr产物经过1％琼脂糖凝胶电泳检测后，在紫外灯下切割含有目的条带的胶块，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段，于-20℃保存。回收的目的片段，16℃金属浴过夜连接至克隆载体pgex-6p-1，并转化到大肠杆菌感受态细胞e.colibl21(de3)中，涂布于含有100mg/mlamp的lb固体培养基上，37℃过夜培养，经过蓝白斑筛选后，挑取4-10个阳性克隆进行测序。将测序结果通过序列比对，分离到了一个编码海带gdp岩藻糖合成酶基因，命名为sjagfs。其cds序列全长为984bp，其核苷酸序列如seqidno：2所示，编码327个氨基酸，以atg为起始密码子，tag为终止密码子。实施例2：sjagfs编码蛋白的制备及分析海带sjagfs基因的pcr产物经过1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，在紫外灯下切下目的条带，琼脂糖凝胶回收，回收产物sjagfs和pgex-6p-1质粒进行ecori和noti双酶切，在37℃金属浴3-4h后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收。将目的片段sjagfs和质粒pgex-6p-1进行连接，16℃过夜，构建好的重组质粒命名为pgex-6p-1-sjagfs。将重组质粒转化大肠杆菌表达菌株bl21，挑取bl21阳性克隆，摇菌并保存菌株。pcr检测重组子。pcr产物于1％琼脂糖凝胶电泳检测，自动凝胶图像分析仪成像。挑取电泳检测插入条带正确的克隆测序，检测有无突变，移码框是否改变。将成功连接了目的片段的bl21菌株，以按照1:1000比例(10mllb液体培养基+10ulap+10ul菌液)摇菌培养，每隔一个小时测od值，直到od600nm值达到0.6(3-4h)。用0.05mm的iptg浓度诱导菌液，诱导条件为20℃，160rpm，诱导6-8h。诱导结束后取2ml菌液4℃12000rpm5min离心，弃上清，将管倒置于吸水纸上；沉淀加入1/2体积提前预冷好的1×pbs(ph＝7.5)中(即2ml离心后的沉淀中加入1ml1×pbs)，充分混匀。超声法破碎菌液，收集破碎后的上清液，用0.45μm的滤膜过滤，gst柱纯化后，收集的蛋白样品放入透析袋中透析，以除去不需要的离子，获得重组sjagfs蛋白，其氨基酸序列如seqidno：1所示，采用sds-page、western-blot检测重组蛋白的表达(图2)。实施例3：sjagfs编码蛋白(海带gdp岩藻糖合成酶)的功能验证gm46d-gfs酶活反应体系：1ml100mmmops,ph7.0；100mmnacl；10mm二硫苏糖醇；5mmedta；1mmgdp-甘露糖(sigma)；0.4mmnadph；and1mmnadp。反应起始加入1.5mg/mlgm46d2酶，37℃反应3h，然后加入1.5mg/mlgfs酶(实施例2制备)，调整nadph浓度至1.5mm,37℃反应2h，然后加热至100℃，2min终止反应。2％胰蛋白酶，0.5％碱性蛋白酶，37℃处理3h去除反应体系中的蛋白，最小截留分子量的透析袋(索莱宝，截留分子量500)去除反应体系中的盐离子。然后将透析液注射入质谱仪中检测，结果见图3。由质谱图可以看出，峰605.38为反应底物gdp-甘露糖，峰589.45为反应产物gdp-岩藻糖。实施例4sjagfs编码蛋白(海带gdp岩藻糖合成酶)的酶活研究按照非专利文献reny,perepelovav,wangh,etal.biochemicalcharacterizationofgdp-l-fucosedenovosynthesispathwayinfungusmortierellaalpina.[j].biochemical&biophysicalresearchcommunications,2010,391(4):1663-9.公开的方法对实施例2制备的sjagfs编码蛋白进行酶活测试，具体结果如下：底物vmax(mm/min)kcat/min实施例2gdp-4-酮-6-脱氧甘露糖0.058±0.0032925.87±121.46尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。序列表<110>中国海洋大学<120>一种海带gdp岩藻糖合成酶、及其编码基因和用途<130>1<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>327<212>prt<213>海带(laminariajaponica)<400>1metalagluthrserglythraspalaalaprolyslysvalvalmet151015valthrglyglythrglyleuvalglycysglyilelysglupheval202530gluseraspalaglualalysglulysgluglutyrilepheleuser354045serlysaspglyaspileargasnmetglugluthrlysleuilephe505560glulystyrlysprothrhisvalilehisleualaalaargvalgly65707580glyleupheserasnleulystyrlysvalgluphephearggluasn859095ileleuileasnaspasnvalmetglucyscysargiletyrlysval100105110glulysleuvalsercysleuserthrcysilepheproasplysthr115120125thrtyrproileaspgluthrmetvalhisasnglyproprohisval130135140serasngluglytyralatyralalysargmetileaspvalleuasn145150155160argcystyrlysgluglutyrglycysasnphethrservalilepro165170175thrasniletyrglylysglyaspasnpheserileaspasnglyhis180185190valleuproglyleuilehislyscystyrlysalalysglnalagly195200205gluaspleuhisvaltrpglythrglyserproleuargglnpheile210215220tyrasnvalaspleuglyalaleumetiletrpthrmetargasntyr225230235240hisgluvalaspproileileleuservalglyglugluaspgluval245250255serilealaaspalaalalysmetilealaseralametasppheglu260265270glyasnvalvalpheaspthrasplysseraspglyglnphelyslys275280285thralacysasnaspleuleulysglnlysasnproaspphelysphe290295300thrprometlysgluglyleulysglnalacysglutrpphecysglu305310315320asntyrgluthralaarglys325<210>2<211>984<212>dna<213>海带(laminariajaponica)<400>2atggcggagaccagcggaaccgatgccgcgcccaagaaggtggtgatggtcaccggtggt60actggcctggt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