利用蚊源C6/36细胞系增殖培养鸭坦布苏病毒的方法与流程

本发明涉及病毒培养领域，具体提供了利用蚊源c6/36细胞系增殖培养鸭坦布苏病毒的方法。

背景技术：

近年来，我国鸭养殖业取得了显著的发展，鸭的存栏量大约有40亿只，位居全球首列。但从2010年春季以来，在我国东南沿海地区(如福建、山东、浙江、上海和江苏等)的许多鸭养殖场爆发了一种以蛋鸭和种鸭产蛋急剧下降、卵泡出血等为主要特征的急性传染病。仅在2010年，就有约1.2亿蛋鸭和1500万肉鸭被感染，对我国家禽养殖业造成了重大的经济损失。造成如此严重损失的病原经研究证实是由黄病毒科黄病毒属于恩塔亚病毒群的鸭坦布苏病毒引起的，该病毒最早于1955年，在马来西亚的蚊子体内分离得到。

对于该病毒的体外增殖，通常采用鸡胚或鸭胚成纤维细胞(即cef或def细胞)，但又由于鸡胚或鸭胚中可能存在母源抗体(如禽流感抗体等)，会对一些病毒的增殖培养会产生不良影响。如根据发明人近期的研究表明，用def细胞培养鸭坦布苏病毒的细胞病变不明显，有时甚至传至第6-8代时也无明显的细胞病变。但pcr检测结果显示，接种后的def细胞培养液均显阳性。

然而，白纹伊蚊细胞即c6/36细胞作为最早分离该病毒的细胞，其不仅是该病毒的天然宿主，同时也是该病毒快速传播的重要媒介。为此，本发明本着追本溯源的研究思路，首次公布了利用蚊源c6/36细胞系增殖培养鸭坦布苏病毒的方法。

技术实现要素：

本发明的发明人针对现有技术存在的空白之处，首次利用蚊源c6/36细胞系增殖培养鸭坦布苏病毒，采用这种蚊源c6/36细胞系培养坦布苏病毒，采用这种方法后坦布苏病毒在c6/36细胞上连续传4-5代后即可获得稳定的毒力，且在接种后的2-3天，形成明显的细胞病变。

本发明的具体技术方案是：

利用蚊源c6/36细胞系增殖培养鸭坦布苏病毒的方法，具体步骤如下：

(1)用常规细胞培养液dmem/f-12加体积比为10％胎牛血清作为细胞生长液，将1ml细胞数量约为1.0×10⁶个的c6/36细胞液加入至25cm²的细胞培养瓶中，再加4ml上述细胞生长液，混匀后置于27℃的5vt％co2细胞培养箱中培养，使之形成单层贴壁细胞，待细胞生长密度，即单位体积或面积内的细胞紧密程度至80％时结束；

(2)将pcr检测结果为坦布苏病毒感染阳性的鸭的尿囊液用pbs匀浆至均匀介质，过滤后的滤液0.5ml接种于步骤(1)所得生长密度80％的c6/36细胞培养瓶中；

(3)将接种病毒后的c6/36细胞培养瓶放入27℃的5vt％co2细胞培养箱中感作30-45min，期间每隔15min手动摇匀一次；

(4)以dmem/f-12加体积比为2％胎牛血清作为细胞维持液，用4-5ml上述细胞维持液替换步骤(3)培养结束后培养瓶中的细胞生长液；

(5)加入维持液的细胞继续置于27℃的5vt％co2细胞培养箱中培养，每天观察细胞状态和细胞病变；

(6)于连续培养至细胞病变达到80-90％时收获细胞培养液，反复冻融2次，取1ml含有细胞病变的细胞培养液加入至25cm²的细胞培养瓶中，再加4ml体积比为10％胎牛血清的dmem/f-12，混匀后置于27℃的5vt％co2细胞培养箱中继续传代培养；

(7)连续传4-5代，即可得到毒力稳定的鸭坦布苏病毒。

本发明之所以选用蚊源的c6/36细胞，主要原因在于：发明人发现鸡胚或鸭胚中存在一种或多种母源抗体(如禽流感抗体，坦布苏抗体、鸡瘟或鸭瘟抗体以及新城疫抗体等)，而对应的以上病毒的感染大都可经过种蛋垂直传播，上述多种母源抗体的存在就对坦布苏病毒的正常增殖产生消极影响，导致增殖过程不稳定；但对于蚊源的c6/36细胞来说，至今未见有蚊子自然感染禽流感、新城疫、鸡瘟或鸭瘟等家禽疾病的报道，即用蚊源的c6/36细胞则不会发生以上问题，提供一个稳定的坦布苏病毒增殖环境；另外，根据发明人利用c6/36和def细胞对比试验，结果均证明用c6/36细胞培养坦布苏病毒的可行性和高效性。

本发明所提供的方法，坦布苏病毒在蚊源c6/36细胞上连续传4-5代后即可获得稳定的毒力(即eld50)，且在接种后的2-3天，形成明显的细胞病变，这对于快速分离、诊断、制备高效的抗体疫苗及进一步深入阐明该病毒的致病机制等提供了良好的物质基础。

附图说明

图1为鸭坦布苏病毒感染的c6/36细胞示意图，其中a为对照组，接种pbs，无细胞病变；b为感染组，绝大多数细胞出现脱离，皱缩等细胞病变(传至第4代，3dpi)；

图2为鸭坦布苏病毒感染的def细胞示意图，其中a为对照组，接种pbs，无细胞病变；b为感染组，少数细胞出现细胞脱离，变圆等轻微细胞病变(传至第6代，4dpi)；

图3为鸭坦布苏病毒分别感染的c6/36和def细胞后的毒力(eld50)变化曲线，其中，用c6/36细胞培养该毒在4-8代的eld50变化趋势基本持平，说明4-8代的毒力较稳定；而def细胞培养该毒的eld50变化不稳定，且毒力明显低于用c6/36细胞所产生的毒力。

具体实施方式

下述实施例中除特殊注明外，其他均采用现有常规技术。

实施例

利用蚊源c6/36细胞系增殖培养鸭坦布苏病毒的方法，具体步骤如下：

先将液氮保存的c6/36细胞系(约1ml，购于上海弘顺生物科技有限公司)取出，迅速放37℃水浴环境下1min内解冻，使用移液器将其缓慢加入至已加9mldmem/f-12(ham)细胞生长液(内含有体积比为10％胎牛血清)的15ml离心管中，1000r/min，离心5min，弃上清；

再向上述离心管内加入5ml10vt％胎牛血清的dmem/f-12(ham)细胞生长液，使用移液器轻轻吹打混匀；

将混匀后的细胞悬液移至25cm²细胞培养瓶中，放置于27℃的5％co2昆虫细胞培养箱中培养，使之形成单层贴壁细胞，待细胞生长密度，即单位体积或面积内的细胞紧密程度约至80％时结束；

将临床病例中pcr检测结果为鸭坦布苏病毒感染阳性的鸭的尿囊液用pbs匀浆至均匀介质，将过滤后的滤液0.5ml接种与上述生长密度约至80％的c6/36细胞培养瓶(25cm²)中；

将接种病毒后的c6/36细胞培养瓶放入27℃的5％co2细胞培养箱中感作30-45min，期间每隔15min手动摇匀一次；

用dmem/f-12(ham)加体积比为2％胎牛血清作为c6/36细胞维持液，将4-5ml上述细胞维持液替换原细胞培养瓶中的细胞生长液；

加入维持液的细胞继续置于27℃的5％co2细胞培养箱中培养，每天观察细胞状态和细胞病变(光学显微镜下的病变标准如细胞脱落、变圆和皱缩等)；

于连续培养至细胞病变达到80-90％时收获细胞培养液，反复冻融2次，取1ml含有细胞病变的细胞培养液(含有坦布苏病毒)加入至25cm²的细胞培养瓶中，再加4mldmem/f-12(ham)(内加体积比为10％胎牛血清)，混匀后置于27℃的5vt％co2细胞培养箱中继续传代培养。

连续传4-5代，即可得到毒力(半数致死量eld50)较稳定的鸭坦布苏病毒(如图1-3所示)。

同时采用常规方法进行def细胞培养坦布苏病毒，结果发现坦布苏病毒的eld50变化不稳定，且毒力明显低于用c6/36细胞所产生的毒力(图3)。