一株具有绿色荧光标记的PRRSVXH‑GD毒株及其构建方法与流程

本发明涉及一种蓝耳病毒，特别涉及一株具有绿色荧光标记的prrsvxh-gd毒株及其构建方法。
背景技术：
：猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，prrs)的病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，prrsv)临床主要引起母猪流产、死胎或木乃伊胎，育肥猪和仔猪的呼吸障碍的传染病。直至今日，prrs仍在全球大部分地区流行，为严重危害养猪业的主要传染病之一。为抗病毒药物筛选验证，减少相关抗体的使用和操作的工作量，直观且实时的观测病毒在不同药物环境下增值情况。更方便地为研究prrsv的致病分子机制和为设计基因标记疫苗提供基础。技术实现要素：为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一株具有绿色荧光标记的prrsvxh-gd毒株。本发明的目的在荧光显微镜下可以直观的观察其感染过程，且具有什么生物学特性，在且抗病毒药物和prrsv示踪具有直观，便捷、节省抗体成本荧光蛋白egfp的基因以独立转录单元方式插入至prrsv基因组中，由转录调控序列trs6启动转录，得到的egfp-xh-gd株具有和亲本毒较为一致的生物学特性。具有荧光蛋白基因的egfp-xh-gd在细胞中的荧光蛋白表达情况可代表prrsv的感染性，在抗病毒药物功能的验证中具有可视化优势。为更方便地为研究prrsv的致病分子机制和为设计疫苗提供基础，显示蛋白对感染细胞的抗病毒效应。本发明的另一目的在于提供上述具有绿色荧光标记的prrsvxh-gd毒株的构建方法。本发明的目的通过下述技术方案实现：prrs在生产中对养猪业造成重大的经济损失，目前还没有一个有效的方法来根除。在prrsv的研究中可视化研究相对较少，实验结果的判断不够迅速直观，需要昂贵试剂，不利于推广，可通过病毒可视化可解决。荧光蛋白引入病毒基因组的构建过程为其他外源基因的引进提供操作基础，其在荧光上的物理特性为抗病毒药物的筛选和病毒生物学特征的快速验证提供了便捷，也为prrsv的精确示踪提供有力的研究工具，对生物体“活”状态下事件的记录和了解生命真实情况的有力手段。prrsv可视化对了解prrsv感染和防控具有重要的意义。本发明提供一株具有绿色荧光标记的prrsvxh-gd毒株，是将经trs6改造的绿色荧光标记egfp基因(egfp+trs6)插入至prrsvxh-gd基因组orf1b和orf2a非结构蛋白之间。本发明基于已拯救的prrsvxh-gd株，通过向其基因组中引入绿色荧光蛋白(egfp)来实现prrsv的可视化。egfp被插入至xh-gd基因组orf1b和orf2a非结构蛋白之间，作为一个独立转录单元分别由prrsv转录调控序列trs6来启动转录，重组病毒在marc-145细胞上得到拯救。在marc-145细胞上的研究表明，拯救的病毒egfp-xh-gd与亲本xh-gd毒株在生长动力学曲线，病毒滴度和噬斑实验等生物学特性上较为一致，且荧光蛋白的表达保持着高效率和稳定的荧光密度和荧光强度。所述的trs6的序列如seqidno：1所示。所述的egfp基因的序列如seqidno：2所示。所述的prrsvxh-gd基因组的genbank：eu624117.1。所述的具有绿色荧光标记的prrsvxh-gd毒株的构建方法，包括如下步骤：(1)提取prrsvxh-gd毒株rna，并反转录，得到cdna，备用；(2)引物序列设计如下：egfp-trs6-1-2-f：5'-ggacgagctgtacaagtaagttccgtggcaacccctttaaccagag-3'；(seqidno：3)trs6-2-orf2-f：5'-ctttaaccagagtttcagcggaacaatgaaatggggtccatgcaa-3'；(seqidno：4)14-11f：5'-ggtgctggaaagtgatgttgg-3'；(seqidno：5)14-11r：5'-aaagcgggcataccgtgtaat-3'；(seqidno：6)trs2-egfp-f：5'-ttgaaccaactttaggcctgaattgaaatggtgagcaagggcgaggagc-3'；(seqidno：7)egfp-orf2a-fus-r：5'-tggaccccatttcatttacttgtacagctcg-3'；(seqidno：8)pok-xh-nsp12r：5'-tcaattcaggcctaaagttggttc-3'；(seqidno：9)(3)以步骤(1)得到的prrsvxh-gdcdna为模板，用引物trs6-2-orf2-f和14-11r，14-11f和pok-xh-nsp12r分别进行pcr扩增，获得片段1和片段2；以合成的egfp(egfp片段由华大公司合成)为模板，用引物trs2-egfp-f和egfp-orf2a-fus-r进行pcr扩增，获得片段3；以片段1为模板，用引物egfp-trs6-1-2-f和14-11r进行扩增，获得片段4；片段2和片段3进行overlappcr，获得目的片段5；再将目的片段5和目的片段4进行overlappcr获得目的片段6；将目的片段6与载体pok-a2bcd分别进行双酶切，然后进行重组，得到重组载体；(4)将重组载体转染细胞，收毒，得到具有绿色荧光标记的prrsvxh-gd毒株，命名为egfp-xh-gd。步骤(3)得到的目的片段6的序列如seqidno：10所示。本发明的机理是：本发明基于本实验室真核反向遗传系统xh-gd，成功构建携带绿色荧光标记的egfp-xh-gd株。其中经trs6改造的绿色荧光标记egfp基因插入基因病毒基因组之间，绿色荧光能随着病毒复制稳定在病毒囊膜上表达，经50传代仍能稳定表达，说明该毒株具有很好的稳定性。其生物学特性与同一代次原毒株xh-gd生长动力学曲线等生物学特性上较为一致，以上说明egfp-xh-gd具有很好的稳定性，其生物学特性与亲本毒株基本一致。病毒的可视化，在荧光显微镜下可以直观的观察其感染过程，且具有什么生物学特性，在且抗病毒药物和prrsv示踪具有直观，便捷、节省抗体成本，具有很好的应用推广前景。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：在细胞中的连续传代稳定表达荧光蛋白的egfp-xh-gd株，可以应用在抗病毒药物筛选验证，减少相关抗体的使用和操作的工作量，直观且实时的观测病毒在不同药物环境下增值情况，具有无可比拟的优势。可以方便地为研究prrsv的致病分子机制和为设计基因标记疫苗提供基础。活细胞成像发现荧光的出现可一定程度上作为早期感染的标志，直观的显示病毒感染进程。附图说明图1是含egfp基因的egfp-xh-gd质粒构建示意图。图2是片段1的电泳图。图3是片段4的电泳图。图4是片段2的电泳图。图5是片段3的电泳图。图6是片段5的电泳图。图7是目的片段6的电泳图。图8是酶切后图的电泳图。图9是菌液检测pcr结果的电泳图。图10是转染bhk细胞荧光图图11是出现cpe和荧光图。图12是生长曲线。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例中所用的prrsvxh-gd株、载体pok-a2bcd均在文献“prrsvxh-gd株nsp9缺失感染性克隆的构建.黑龙江畜牧兽医.2016(12):10-13,295”中公开。含egfp基因的egfp-xh-gd质粒构建示意图，如图1所示。实施例1基于本实验室已由反向遗传学拯救毒株prrsvxh-gd株基础上进行改造。(一)pcr扩增各片段(1)引物设计由invitrogen公司合成egfp-trs6-1-2-f：5'-ggacgagctgtacaagtaagttccgtggcaacccctttaaccagag-3'；(seqidno：3)trs6-2-orf2-f：5'-ctttaaccagagtttcagcggaacaatgaaatggggtccatgcaa-3'；(seqidno：4)14-11f：5'-ggtgctggaaagtgatgttgg-3'；(seqidno：5)14-11r：5'-aaagcgggcataccgtgtaat-3'；(seqidno：6)trs2-egfp-f：5'-ttgaaccaactttaggcctgaattgaaatggtgagcaagggcgaggagc-3'；(seqidno：7)egfp-orf2a-fus-r：5'-tggaccccatttcatttacttgtacagctcg-3'；(seqidno：8)pok-xh-nsp12r：5'-tcaattcaggcctaaagttggttc-3'。(seqidno：9)(2)pcr扩增提取prrsvxh-gd毒株rna，并反转录，得到的cdna。egfp片段由华大公司合成。①pcr扩增片段1反应体系为(50μl)：10×phantamaxsuper-fidelitydnapolymerase(1u/μl)1μldntpmix(10mmeach)1μltrs6-2-orf2-f2μl14-11r2μl2×phantamaxbuffer25μlprrsvxh-gdcdna2μlddh2o17μl反应条件为：95℃5min预变性，35个循环(95℃30s，58℃45s，72℃2min20s)，延伸72℃8min，4℃保存。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。如图2所示。从图2可知，成功得到目的片段1。②pcr扩增片段4反应体系为(50μl)：10×phantamaxsuper-fidelitydnapolymerase(1u/μl)1μldntpmix(10mmeach)1μlegfp-trs6-1-2-f2μl14-11r2μl2×phantamaxbuffer25μl片段1胶回收产物2μlddh2o17μl反应条件为：95℃5min预变性，35个循环(95℃30s，58℃45s，72℃2min20s)，延伸72℃8min，4℃保存。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。如图3所示。从图3可知，成功得到目的片段4并成功将trs6加入。③pcr扩增片段2反应体系为(50μl)：反应条件为：95℃5min预变性，35个循环(95℃30s，58℃45s，72℃2min20s)，延伸72℃8min，4℃保存。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。如图4所示。经鉴定成功得到目的片段2(如图4)。④pcr扩增片段3反应体系为(50μl)：10×phantamaxsuper-fidelitydnapolymerase(1u/μl)1μldntpmix(10mmeach)1μltrs2-egfp-f2μlegfp-orf2a-fus-r2μl2×phantamaxbuffer25μlegfp片段2μlddh2o17μl反应条件为：95℃5min预变性，35个循环(95℃30s，58℃45s，72℃2min20s)，延伸72℃8min，4℃保存。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。如图5所示。从图5可知，成功得到目的片段3，egfp片段由华大公司合成。(二)pcr产物的纯化及cdna片段的回收①pcr产物的纯化rt-pcr产物在1.0％的琼脂糖凝胶上电泳后，切下目的条带，用magen生物技术有限公司的凝胶回收与纯化试剂盒回收rt-pcr产物。具体操作如下：(1)配制合适浓度的琼脂糖凝胶，电泳分离dna片段。当dna片段分离后，把凝胶放置于紫光灯下，快速切下含目的条带的dna片段的凝胶，并尽量去除多余的凝胶。(2)称取凝胶块的重量，并转移至1.5或2.0ml离心管中。按100mg凝胶块相当100μl体积计算，加入等体积buffergdp。50～55℃水浴7～10分钟，让凝胶块完全溶解。其间颠倒轻摇离心管几次，加速胶溶；(3)暂时离心收集管壁上的液滴。将hipurednacolumn套在2ml收集管中。把≤700μl溶胶液转移至柱子中。12,000×g离心30～60秒。(4)倒弃滤液，把柱子套回收集管中。加入300μlbuffergdp至柱子中。静置1分钟。12,000×g离心30～60秒。将500μlresina加入离心柱中，3000r/min离心30秒；(5)倒弃滤液，把柱子套回收集管中。加入600μlbufferdw2(已加无水乙醇稀释)至柱子中。12,000×g离心30～60秒；(6)重复步骤(5)，然后再12,000×g离心2分钟；(7)将离心柱置于新的1.5ml的离心管上，在离心柱膜的中央加入50μl灭菌双蒸水(50℃预热)，室温静置1min；(8)12,000×g离心1min洗脱dna。丢弃柱子，把dna保存于-20℃。将扩增出片段egfp和trs6，95℃5min预变性，10个循环(95℃30s，58℃45s，72℃1kb/min)，延伸72℃8min，4℃保存。②overlappcr加入所连接片段2与其上游引物14-11f和片段3与其下游引物egfp-orf2a-fus-r(95℃5min预变性，25个循环(95℃30s，58℃45s，72℃1kb/min)，延伸72℃8min，4℃保存。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。如图6所示。从图6可知，片段2和片段3已成功融合，成功得到片段5。加入所连接片段5与其上游引物14-11f和片段4与其下游引物14-11r(95℃5min预变性，25个循环(95℃30s，58℃45s，72℃1kb/min)，延伸72℃8min，4℃保存。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，经鉴定egfp和trs6成功融合，目的片段6已成功构建。如图7所示。③重组载体构建overlappcr获得的目的片段6按照操作步骤①进行回收与纯化，然后进行双酶切。酶切连接后片段和载体pok-a2bcdcustmartbuffer2μlecorv0.5μlascⅰ0.5μl片段617μlcustmartbuffer5μlecorv1μlascⅰ1μlpok-a2bcd20μlddh2oto50μl于37℃水浴，2～3h，后经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。如图8所示。目的片段6已成功连接上载体(图8)。胶回收上述载体与片段后经t4连接酶连接：常温配制如下体系：10×t4dnaligasebuffer2μlt4dnaligase1μl载体2μl片段2μlddh2oto20μl室温静置反应10min，后经连接仪连接2～16h。连接产物的转化(1)从-80℃取出大肠杆菌dh5α感受态细胞(购自天根生物科技有限公司(北京))置于冰上；(2)加入5～10μl连接液，轻轻混匀；(3)冰浴30min；(4)42℃水浴热激90s；(5)冰上静置5～10min；(6)加入1000μl无抗性lb培养基，37℃下220r/min振荡培养45min；(7)将细菌均匀涂布在含卡那霉素(100μg/ml)固体lb培养基平板中；(8)平板置37℃温箱，正向放置1h以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜(12h～16h)。挑取白色单个菌落于含卡那霉素(100μg/ml)的lb液体中37℃，225r/min振荡培养(8h～16h)。取出后置于4℃密封保存。将可疑菌落用灭菌牙签(灭菌小枪头)挑出，放入加有卡那霉素的lb液体培养基中，在37℃150r/min的状态下振摇培养12h，取菌液作pcr鉴定。pcr扩增体系(20μl)，具体见下表。ddh2o6μl2×tap酶10μl上游primer：14-11f1μl下游primer：14-11r1μl菌液2μl反应条件为：95℃5min预变性，35个循环(95℃30s，56℃45s，72℃1kb/min)，延伸72℃8min，4℃保存。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。如图9所示。从图9可知，目的片段6以成功连接上载体，并成功表达。挑选上述阳性菌液送华大公司测序。将上述已测序菌液抽200μl入经高温高压消毒锥形瓶中，加15mlk+(卡那霉素，100μg/ml)的lb培养液，摇菌使其复兴生长12h以上。使用e.z.n.a.endo-freeplasmidminikitⅰ去内毒素质粒小规模提取试剂盒抽取质粒。1.在10～20ml试管或烧瓶中，将携带有所需质粒的e.coli接种到5mllb培养基lb(含卡那霉素50μg/ml)，37℃振荡培养12～16h(300rpm)。2.取1.5～5ml菌液室温10000×g离心1min；3.去上清，加250μl溶液ⅰ(含rnasea)，涡漩振荡器震荡(或上下吹吸)至菌体完全悬浮。4.加入250μl溶液ⅱ，温和颠倒离心管4～6次，获得澄清的裂解液。最好室温孵育2min，剧烈混合会使剪切染色体dna，降低质粒纯度。5.加入125μl用冰预冷的buffern3，颠倒混匀离心管直到出现白色絮状沉淀，12000×g室温离心10分钟(最好4℃)。6.特别小心吸取上清，移至洁净的容积1.5ml离心管中，加入0.1volume(0.1倍体积)etrsolution至澄清裂解液中，颠倒混匀7～10次，冰上孵育10min，孵育期间颠倒混匀离心管几次。7.42℃孵育裂解液5min，裂解液应再次变浑浊，12000×g25℃离心3min，etrsolution会在柱子底部形成一层蓝色。8.将上清转移至新的1.5ml离心管中并加入0.5volume(0.5倍体积)纯酒精(室温，96～100％)，通过颠倒混匀离心管6～7次进行温和混合，室温孵育1～2min。9.将步骤8中的混合物700μl转移至2ml吸收柱中，室温10000×g离心1min，使裂解物通过吸收住。10.弃滤过液，将剩余混合物加入吸收住，10000×g离心1min。弃滤过液，重利用吸收柱。11.500μlbufferhb，10000×g离心1min。清洗吸收柱，除去残余蛋白质保证dna的纯度。12.弃滤过液，再用100％乙醇稀释的700μlwashbuffer清洗吸收柱，室温10000×g离心1min；13.再加700μlwashbuffer清洗吸收柱14.弃滤过液，以最大速度(>13000×g)离心空柱子2min，不要跳过此步，这对于清除柱子中的乙醇很关键。15.将吸收柱放入干净1.5ml离心管，加30～50μl(取决于需要的终浓度)无菌水或去内毒素elutionbuffer在滤膜上1～2min，13000×g离心1min(可进行再洗脱，但会降低dna浓度)。(三)病毒的拯救选2μg重组质粒与5μl脂质体(lipofectamine2000脂质体，invitrogen)混匀，转染bhk细胞。转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90％。细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基(如opti-memⅰ培养基)稀释0.8μg～1.0μgdna。对于每孔细胞，使用50μlopti-memⅰ培养基稀释1μl～3μllipofectamine2000试剂。lipofectamine2000稀释后保温5分钟(在30分钟内同稀释的dna混合。保温时间过长会降低活性。)注意：即使lipofectamine2000使用opti-memⅰ稀释，细胞也可以使用d-mem培养。如果d-mem做为lipofectamine2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的dna混合。混合稀释的dna(第2步)和稀释的lipofectamine2000(第3步)。在室温保温20分钟。直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在37℃，5％的co2中保温24～48小时，后除去含有lipofitertm-dna的无血清培养液。每孔加入2ml新鲜含血清的细胞培养液继续培养。观察细胞出现明显荧光时，荧光如图10所示，收毒。-80℃冻融3次，4℃8000转/min离心10min后收取上清，接marc-145细胞上，12小时后可观察到出现荧光，48小时在荧光显微镜下分别用荧光和白光观察改造毒株和亲本毒株的cpe(图11a)随着时间增加荧光量明显增加(图11b)。收取此毒，测tcid50。分别在marc-145细胞上和pam细胞上和原毒xh-gd进行传代，后测得egfp-xh-gd和xh-gd株生长曲线如图12所示。得到的egfp-xh-gd株具有和亲本毒较为一致的生物学特性(如图12)。所用的bhk细胞、marc-145细胞和pam细胞均购自atcc细胞库。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>华南农业大学<120>一株具有绿色荧光标记的prrsvxh-gd毒株及其构建方法<160>10<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>40<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>trs6<400>1gttccgtggcaacccctttaaccagagtttcagcggaaca40<210>2<211>720<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>egfp基因<400>2atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggac60ggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctac120ggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccacc180ctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaag240cagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttc300ttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctg360gtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcac420aagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaac480ggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgcc540gaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccac600tacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtc660ctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaa720<210>3<211>46<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>egfp-trs6-1-2-f<400>3ggacgagctgtacaagtaagttccgtggcaacccctttaaccagag46<210>4<211>45<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>trs6-2-orf2-f<400>4ctttaaccagagtttcagcggaacaatgaaatggggtccatgcaa45<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>14-11f<400>5ggtgctggaaagtgatgttgg21<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>14-11r<400>6aaagcgggcataccgtgtaat21<210>7<211>49<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>trs2-egfp-f<400>7ttgaaccaactttaggcctgaattgaaatggtgagcaagggcgaggagc49<210>8<211>31<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>egfp-orf2a-fus-r<400>8tggaccccatttcatttacttgtacagctcg31<210>9<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>pok-xh-nsp12r<400>9tcaattcaggcctaaagttggttc24<210>10<211>2095<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>目的片段6<400>10ggtgctggaaagtgatgttggactttaaggaggttcgactgatggtatggaaagacaaga60cggcctattttcaacttgaaggccgccattttacctggtatcaacttgcaagctacgcct120catacatccgagttcctgttaattctactgtgtacttggacccctgcatgggccctgctc180tttgcaacagaagggttgtcgggtccacccattggggagctgacctcgcagtcacccctt240atgattacggtgccaaaattattctgtctagtgcatatcatggtgaaatgcctccaggtt300acaaaattctggcgtgcgcggagttctcgcttgatgatccagtaaggtacaaacacacct360ggggatttgaatcggatacagcgtatctgtacgagtttactggaaatggtgaggactggg420aggattacaatgatgcgtttcgggcgcgccagaaagggaaaatttataaagctaatgcca480ccagcatgaggtttcattttcccccgggccctgtcattgaaccaactttaggcctgaatt540gaaatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctg600gacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacc660tacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggccc720accctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatg780aagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatc840ttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacacc900ctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctgggg960cacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaag1020aacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctc1080gccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaac1140cactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatg1200gtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaag1260taagttccgtggcaacccctttaaccagagtttcagcggaacaatgaaatggggtccatg1320caaagcctctttgacaaaattggccaactttttgtggatgctttcacggaatttctggtg1380tccattgttgatatcatcatatttttggccattttgtttggcttcacaatcgccggttgg1440ctggtggtcttatgcatcagactggtttgctccgcggcactccgtgcgcgctctaccgtt1500caccctgagcaattacagaagatcttatgaggcctttctttctcagtgtcaggtagacat1560tcccacctggggcgtcaaacaccctttgggggtgctttggcaccataaggtgtcaaccct1620gattgatgaaatggtgtcgcgtcgaatgtaccgcgtcatggaaaaagcagggcaggctgc1680ctggaaacaggtggtgagcgaggctacattgtctcgcattagtggtttggatgtggtggc1740tcactttcaacatcttgccgctattgaagccgagacttgtaaatatttggcttcccggct1800acccatgctgcataacctgcgcttgacagggtcaaatgtaaccatagtgtataatagtac1860tttggatcaggtgtttgccattttcccaacccctggttcccggccaaagcttcatgattt1920tcagcaatggctaatagctgtacattcctccatattttcctccgttgcagcttcttgtac1980tctttttgttgtgctgtggttgcgaattccaatgctacgttctgtttttggtttccgctg2040gttaggggcaacttttcttttgaactcatggtgaattacacggtatgcccgcttt2095当前第1页12