热稳定性提升的角蛋白酶突变体及其应用的制作方法

本发明涉及热稳定性提升的角蛋白酶突变体及其应用，属于工业生物技术领域。

背景技术：

角蛋白是一类难降解的不溶性蛋白质，广泛存在于自然界，是继纤维素和壳聚糖之后的第三大类聚合物。在脊椎动物的皮肤、毛发、羽毛、角、指甲、喙及鱼的牙齿和粘液中含量丰富，作为一种结构蛋白，对动物体起保护作用，以使其能够应对自然界环境和其他生物的干扰。由于角蛋白富含二硫键、氢键和分子间疏水相互作用力，所以其结构致密、性质稳定，对许多化学品的作用不敏感，也难以被普通蛋白酶类降解。

角蛋白酶可以将不溶性角蛋白特异性降解为可溶性蛋白或者多肽。由于具备独特的底物特异性，角蛋白酶在制革、洗涤、角蛋白废弃物降解和饲料加工等领域中表现出良好的应用前景。

本发明的亲本酶副短短芽孢杆菌brevibacillusparabreviscgmccno.10798生产的角蛋白酶在较高温度下热稳定性较差，在60℃保温30min后，残余酶活仅为38％，限制了该酶在工业生产中的产品开发和推广，尤其在洗涤、角蛋白废弃物降解和饲料加工等领域的应用过程中通常需要涉及到较高温操作、酶容易失活。为进一步提高该角蛋白酶在工业生产中的应用潜力，提高该酶的稳定性，从而节约成本、提升应用效率将成为角蛋白酶研究的重要方向。

技术实现要素：

本发明所要解决的一个技术问题是提供一种角蛋白酶的突变体，所述突变体以副短短芽孢杆菌brevibacillusparabreviscgmccno.10798角蛋白酶为亲本蛋白酶，是将亲本角蛋白酶的第181位的天冬酰胺、第218位酪氨酸、第236位丝氨酸中的至少一处突变为其他氨基酸。

在本发明的一种实施方式中，是将第181位的天冬酰胺突变为天冬氨酸。

在本发明的一种实施方式中，是将第218位酪氨酸突变为丝氨酸。

在本发明的一种实施方式中，是将第236位的丝氨酸突变为半胱氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述亲本蛋白酶的氨基酸序列如seqidno.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体的氨基酸序列为seqidno.1～3中的任一种。

本发明的第二个目的是提供编码所述蛋白酶突变体的基因。

本发明的第三个目的是提供携带所述基因的载体。

在本发明的一种实施方式中，所述载体为pmd系列、pet系列中任意一种。

在本发明的一种实施方式中，所述载体为载体pet22b(+)。

本发明的第四个目的是提供表达所述角蛋白酶突变体的细胞系。

在本发明的一种实施方式中，宿主细胞可选自大肠杆菌(escherichiacoli)、芽孢杆菌(bacillus)、棒杆菌(corynebacterium)、酵母、丝状真菌(filamentousfungi)中的任意一种。

本发明的第五个目的是提供一种提高角蛋白酶热稳定性的突变体的方法，包括以下步骤：

(1)在brevibacillusparabreviscgmccno.10798角蛋白酶氨基酸序列的基础上，利用在线服务器tm-score分析角蛋白酶的立体结构中氨基酸的标准化b-factor值，选择不稳定的loop环结构区域氨基酸作为突变位点；或通过氨基酸序列比对寻找差异的特征氨基酸残基作为突变位点；

(2)设计突变处氨基酸定点突变的突变引物，以携带角蛋白酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含突变体的质粒载体；

(3)将突变体质粒转化进宿主细胞；

(4)挑选阳性克隆进行发酵培养，并纯化角蛋白酶突变体。

本发明还提供所述角蛋白酶突变体在生物、食品、化工领域的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括用于洗涤、角蛋白废弃物降解或饲料加工。

有益效果，本发明实现了角蛋白酶突变体的热稳定性的提高。与野生酶相比，t218s、s236c和n181d突变酶60℃的半衰期分别延长3.05倍、1.18倍和1倍，t50也分别提高5.4℃、2.8℃和2℃；双突变体n181d-t218s和n181d-s236c的比酶活分别提高58％和15％；t50分别提高5.1和2.9℃；60℃下的半衰期分别是wt的4.09倍和1.54倍；最适反应温度分别提高10℃和5℃，角蛋白酶突变体比亲本在工业应用中具有更好的应用前景。热稳定性的提升对于酶的应用价值促进作用主要体现在能使酶的操作稳定性提高、使酶的使用周期延长、减少酶用量及降低使用成本、并且能耐受较高温度操作条件。

附图说明

图1为野生酶和突变酶在60℃的失活曲线图；

图2为野生酶与单点突变酶的最适温度；

图3为野生酶与单点突变酶的最适ph；

图4为野生酶和突变酶对应的rmsd曲线；

图5为野生型wt与突变体n181d、t218s、s236c和n181d-t218s突变位点附近区域氢键比较.a0，wt的181位附近；a1，n181d附近；b0，wt的218位附近；b1，t218s的218位附近；c0，wt的236位附近；c1，s236c的236位附近；d0，wt的181和218位附近；d1，n181d-t218s的181和218位附近；

图6为野生型wt与突变体n181d、s236c、n181d-t218s在181位、236和181-218位氨基酸的表面电荷比较.左侧：a0、b0和c0，wt；右侧：a1，n181d；b1，s236c；c1，n181d-t218s。

具体实施方式

角蛋白酶酶活测定方法：以1％角蛋白为底物，采用紫外比色法测定酶活性。取稀释适当倍数的酶液0.5ml，加入1.5ml的底物，在40℃条件下保温15min后，加入2ml的0.4mtca溶液，静置10min后将样品于12000r·min^-1条件下离心5min，取上清500μl，加入2500μl的0.4mna2co3和500μl的福林酚试剂，混合均匀后在40℃保温条件下反应20min显色后，检测od660。

酶活定义：在上述反应体系中，波长660nm下的吸光度每增加0.01为1个酶单位(u·ml^-1)。

角蛋白酶的半衰期测定：将适量亲本和各突变体酶液置于60℃保温，间隔10min取样测定其残余酶活。以时间为恒坐标，拟合相对酶活为纵坐标，根据公式t＝ln2/k求得酶在60℃下的半衰期(t(1/2，60℃))；

角蛋白酶t50的测定：将亲本酶和各突变体酶液置不同温度保温(40-65℃)，间隔取样后迅速冰浴处理，测定残余酶活；以冰浴相同时间的角蛋白酶活力定义为100％。

实施例1角蛋白酶定点单突变体的制备

根据brevibacillusparabreviscgmccno.10798角蛋白酶的氨基酸序列(seqidno.4所示)，分别设计引入t218s、n181d和s236c突变的引物，将亲本角蛋白酶(wt)的第181位的天冬酰胺(asn)突变为天冬氨酸(asp)、氨基酸序列为seqidno.1；将第218位酪氨酸(tyr)突变为丝氨酸、其氨基酸序列为seqidno.2；将第236位的丝氨酸(ser)突变为半胱氨酸(cys)、氨基酸序列为seqidno.3，对角蛋白酶基因进行定点突变，测定其dna编码序列，分别将突变体基因置于表达载体并导入表达宿主大肠杆菌中进行表达，得到单点突变角蛋白酶，单突变体t218s、n181d和s236c利用pcr技术，以表达载体pet22b-bpker为模板，

引入n181d定点突变的引物为：

n181d-f：5’-ttgccaatgta(gat)agtaacaa-3’(括号内为突变碱基)

n181d-r：5’-tgacattgttact(atc)tacattgg-3’(括号内为突变碱基)

引入t218s定点突变的引物为：

t218s-f：5’-ggatacacttcttat(agc)ggaaca-3’(括号内为突变碱基)

t218s-r：5’-ccatagatgttcc(gct)ataagaag-3’(括号内为突变碱基)

引入s236c定点突变的引物为：

s236c-f：5’-cagcgcttattctt(tgc)aaaaacc-3’(括号内为突变碱基)

s236c-r：5’-ttcgggttttt(gca)aagaataag-3’(括号内为突变碱基)

pcr扩增程序设定为：95℃预变性6min；然后进入30个循环：95℃变性10s，退火5s，72℃延伸6min30s；之后72℃延伸60min，4℃保温。pcr产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

pcr产物经dpni核酸内切酶在37℃下处理2-3h，消化掉甲基化的模板质粒后，转化e.colijm109，挑取克隆接种于lb液体培养基(含100μg/mlamp)中培养约10h后提取质粒，将测序正确的突变质粒转化e.colibl21(de3)感受态细胞，得到突变体的重组菌株。

实施例2角蛋白酶定点双突变体的制备

将单突变体酶t218s基因中的第218位酪氨酸(tyr)突变为丝氨酸，或者将单突变酶的n181d的第236位的丝氨酸(ser)突变为半胱氨酸(cys)，分别命名为n181d-t218s、n181d-s236c。将突变体基因置于适当表达载体并导入表达宿主大肠杆菌中进行表达，得到单点突变角蛋白酶，得到发生双突变角蛋白酶的突变体。

双突变n181d-t218s、n181d-s236c的定点突变：利用快速pcr技术，分别以表达载体pet22b(+)-t218s、pet22b(+)-s236c为模板，

引入n181d突变的定点突变引物为：

n181d-f：5’-ttgccaatgta(gat)agtaacaa-3’(括号内为突变碱基)

n181d-r：5’-tgacattgttact(atc)tacattgg-3’(括号内为突变碱基)

引入s236c定点突变的引物为：

s236c-f：5’-cagcgcttattctt(tgc)aaaaacc-3’(括号内为突变碱基)

s236c-r：5’-ttcgggttttt(gca)aagaataag-3’(括号内为突变碱基)

pcr反应条件及突变基因的测序方法同单点突变体的方法。

(3)突变体酶的发酵产酶与纯化

将重组角蛋白酶宿主菌经过诱导表达后，12000rmin-1、4℃条件下离心，收集发酵液上清。利用70％饱和度的硫酸铵对发酵液中蛋白质进行浓缩，高速低温离心去除上清液，然后用适量的缓冲液将所得的沉淀物进行复溶之后，低温高速离心去除沉淀，再采用0.22μm微孔滤膜对其过滤除杂。利用akta蛋白纯化仪采用镍离子亲和柱(histrapff)对带有his-tag的重组角蛋白酶进行纯化。

实施例3

ph对酶活性的影响：配制不同ph的缓冲体系：柠檬酸盐缓冲液(ph5.0-6.0)、tris-hcl缓冲液(ph7.0-9.0)、甘氨酸-naoh缓冲液(ph10.0)和kcl-naoh(ph11.0-12.0)。用ph为6～12的缓冲液体系分别配制1％的角蛋白底物，并用不同的缓冲液体系对酶液进行适当倍数的稀释，然后在40℃条件下，测定角蛋白酶的活性，确定其最适反应ph。角蛋白酶ph稳定性的测定：将角蛋白酶分别用不同ph缓冲液适当稀释室温孵育1.0h后，在40℃反应条件下，分别测定其残余酶活。

温度对酶活性的影响：分别取适量角蛋白酶置于30～70℃下测定酶活，以最高酶活对应的温度为最适温度。重组角蛋白酶温度稳定性测定的条件：将酶在各温度下处理30min，测定其残余酶活。

与wt相比，突变株n181d、t218s和s236c的稳定性有显著提高，其中t218s提高的幅度最高，60℃的半衰期延长3.05倍，t50提高5.4℃；其次，突变体n181d和s236c的t(1/2,60℃)是wt的两倍，t50也比wt提高了2℃和2.8℃(表1和图1)。而突变体t218s和s236c的最适反应ph与wt相同(图2)；这些突变酶中t218s和s236c的最适温度分别比wt高出10℃和5℃(图3)。

表1野生酶与突变酶稳定性参数

组合突变对酶学特征的影响如表2所示，与wt相比，n181d-t218s比酶活提高58％；t50分别提高5.1；最适反应温度分别提高10℃；60℃下的半衰期也有明显延长，是wt的4.09倍。组合突变酶的最适反应ph均为8.0。

表2组合突变酶的催化性质

实施例4

n181d、t218s及n181d-t218s突变酶的km值都低于wt，而kcat/km则都高于wt，其中t218s的kcat/km是wt的提高37％；而s236c的则相反，km高于wt而kcat/km略低。这说明n181d、t218s及n181d-t218s突变酶与底物的亲和力和催化效率都高于wt，酶的催化性能得到了改善。

表3野生酶和突变酶的动力学参数

实施例5野生酶和突变酶的三维立体结构分析

1.柔性分析

rmsd值是分子动力学中高温模拟过程中，每个时刻的所有原子的结构构象与目标构象的偏差统计，反应出在高温下的整体结构柔性，是衡量蛋白质体系稳定性的重要参数。由图4看出，在分子动力学模拟达到平衡后，wt的平均rmsd高于t218s、s236c和t218s-s236c突变酶，因此，这些位点的突变降低了角蛋白酶整体构象的柔性，从而酶在高温下更稳定。

2.结构分析

(1)氢键形成情况

通过分子动力学模拟计算出野生酶和突变酶在以突变位点为圆心、半径的球状区域内氨基酸之间和与周围氨基酸内部的氢键的数目(表4)。

表4野生酶和突变酶局部区域形成氢键数目表

注：^*其中有一个盐桥的形成。

通过对突变体的分子模拟计算可以看出(图5)，与wt相比，n181d突变酶在突变位点附近有两个氢键形成，asn184(n)-asp181(od1)和ser182(ca)-gln10(oe1)；与wt相比，t218s突变酶位于213-218的片层结构的218-thr替换为ser，能够促进转角的gly-219与位于220thr-237lys的α螺旋中的ala-223形成氢键，促从而促使片层与螺旋更加贴近，增强蛋白质刚性结构；而突变体s236c的lys-237末尾氨基与ser-274的羧基相互靠近形成盐桥lys237(nz)-ser274(oxt)，此外s236c突变体的ala-88与gly-23、pro-239与cys-236之间各形成了一个氢键(ala88(ca)-gly23(o)、pro239(cd)-cys236(o))，这对蛋白质结构的热稳定性有着极其重要的作用。

热稳定性对于酶的研究具有重要意义。在蛋白质折叠过程中，临近位点携带相反电荷，可以有助于传统氢键和盐桥的形成；而传统氢键和盐桥则对蛋白质的结构和功能上有着密切联系。

(2)蛋白质表面电荷

wt和突变酶蛋白质立体结构的表面电荷如图6所示，与wt相比，n181d、s236c和n181d-t218s蛋白质表面电荷明显减少，除了这些区域，wt和突变酶的其他区域表面电荷分布较为一致。这说明突变体的表面电荷较少，结构更加致密，因此在高温下，则蛋白质构象更加稳定。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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<110>江南大学

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