本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种新型川贝母内生真菌及其应用。
背景技术：
川贝母为百合科贝母属植物，历年药典均将其收录为川贝母药材的基源种之一。其以鳞茎入药，主要功效为清热润肺，化痰止咳。由于其生长年限长，产量相对较低，多生长在海拔3000～4000m的川西高原。由于市场需求的快速增长加速了川贝母资源濒危，已成为我国三级保护物种。贝母鳞茎的主要活性成分是生物碱，而川贝母中已经分离并确定结构的生物碱主要有西贝碱、贝母辛、贝母素甲、贝母素乙、云贝酮、异梭砂贝母碱等。如果寻找到可以产生此类生物碱的微生物，既能缓解市场上对川贝母等药材的供需矛盾，又在一定程度上保护了川贝母的野生资源。
内生真菌广义指一直生活在植物体内或其生活史的一定阶段处于植物体内的真菌；狭义指存在于健康植株的组织器官中，对宿主不形成明显浸染的真菌。内生真菌的代谢物能刺激植物的生长发育，并且能够提高宿主植物对外胁迫抵抗能力。近年来，对葱、蕨类植物、杨树、油樟、龙血树等许多经济、药用植物内生真菌的研究发现，内生真菌能产生与宿主相同或相似的具有生理活性的代谢产物。
对于一些濒危的药用植物来说，通过筛选可以产生与其宿主相同或相似的活性成分的内生真菌，并通过人工改造达到高产高效的生物活性成分，无疑对这些药用植物的野生资源的保护和其微生物资源的开发利用有着重要的理论和现实意义。更值得的注意的是本课题组曾从瓦布贝母内生真菌中获得可以产贝母类生物碱的菌株wbs007。所以，从内生真菌中获取与宿主植物相同或相似的活性成分具有现实可行性。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种新型川贝母内生真菌及其应用，以有效克服上述现有技术的不足。
本发明解决技术问题的方案是：一种新型川贝母内生真菌，是镰刀菌中的三线镰刀菌，其保藏登记号为cgmccno.9719，菌株编号为cby4。
在pda固体培养基上28℃培养，菌丝绒毛状，边缘初期光滑，随后呈波状，菌落呈圆形，新生菌丝呈白色，向外生长，并渐变为桃红色，第3天时在边缘白色菌丝和菌落中央桃红色菌丝间出现淡黄色同心圆状菌丝，生长到第10天，菌落由内到外呈现桃红色、淡黄色、桃红色、白色相间同心圆，培养第十天其菌落直径为3.9±0.1cm，菌落厚度为0.2～0.5cm。
它的液体培养为：1)pdb培养基：250ml摇瓶中含发酵液100ml，接种6mm菌饼5块，摇瓶培养4天，培养温度28±1℃，震荡速率130r/min，暗室培养，作为扩大培养的种子液；然后再以pdb为培养基，250ml摇瓶中含发酵液150ml，接种量为1％，培养7天；2)发酵培养特征：培养第1～3天有成棉花状菌丝出现，培养液澄清；培养第4天，棉花状菌丝增加增大，且棉花状条带出现成圆球局部膨大，发酵液澄清；第5～6天，发酵液有两种不同大小的球状菌丝，大球状菌丝直径为5～15mm，小球状菌丝直接为0.7～2mm，发酵液变浑浊；第7～8天，球状菌丝变大0.1～1mm；整个生长过程菌丝呈白色，发酵液由亮黄色变为淡黄色。
它的显微形态为：菌丝有隔；大型分生孢子镰刀形、纺锤形、宽镰刀形，为3隔～5隔，着生于分生孢子梗顶端，大小为28～40×3～4μm；小型分生孢子棒状或卵圆形，单孢、棒状孢子的大小为6～10×2～3μm，卵圆形孢子直径为2.2～4.1μm；厚垣孢子呈球形，壁光滑，间生或顶生，5～15个成串，直径为5～10×5～8.5μm。
本新型川贝母内生真菌用于制备贝母辛和贝母素乙生物碱。
用于制备贝母辛和贝母素乙生物碱的制备方法包括下列步骤：
1)将川贝母内生真菌cby4于pda培养基活化4天后，取直径为6mm的菌块接种到pdb培养液中，置于28℃恒温摇床中130r/min培养4天；在将此发酵液接种到另一个pdb培养液中扩大培养，其接种量为1％；
2)发酵完毕，收集培养物过滤后，利用浓氨水将发酵液的ph调到9～11，然后用二氯甲烷萃取2～3次，每次加入二氯甲烷体积为发酵液体积的1/4；收集二氯甲烷，并置于水浴锅上用蒸发皿挥干，再用甲醇复溶残留物并用0.22μm的有机滤膜过滤即得贝母辛和贝母素乙生物碱。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的新型川贝母内生真菌，通过菌株液体发酵能够产生贝母辛和贝母素乙化合物，是寻找贝母类生物碱新资源的重要微生物，具有较大的应用价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明：
实施例：
本发明的新型川贝母内生真菌，是镰刀菌中的三线镰刀菌，其保藏登记号为cgmccno.9719，菌株编号为cby4。
在pda固体培养基上28℃培养，菌丝绒毛状，边缘初期光滑，随后呈波状，菌落呈圆形，新生菌丝呈白色，向外生长，并渐变为桃红色，第3天时在边缘白色菌丝和菌落中央桃红色菌丝间出现淡黄色同心圆状菌丝，生长到第10天，菌落由内到外呈现桃红色、淡黄色、桃红色、白色相间同心圆，培养第十天其菌落直径为3.9±0.1cm，菌落厚度为0.4cm。
它的液体培养为：1)pdb培养基：250ml摇瓶中含发酵液100ml，接种6mm菌饼5块，摇瓶培养4天，培养温度28±1℃，震荡速率130r/min，暗室培养，作为扩大培养的种子液；然后再以pdb为培养基，250ml摇瓶中含发酵液150ml，接种量为1％，培养7天；2)发酵培养特征：培养第2天有成棉花状菌丝出现，培养液澄清；培养第4天，棉花状菌丝增加增大，且棉花状条带出现成圆球局部膨大，发酵液澄清；第6天，发酵液有两种不同大小的球状菌丝，大球状菌丝直径为10mm，小球状菌丝直接为1.6mm，发酵液变浑浊；第8天，球状菌丝变大0.6mm；整个生长过程菌丝呈白色，发酵液由亮黄色变为淡黄色。
它的显微形态为：菌丝有隔；大型分生孢子镰刀形、纺锤形、宽镰刀形，为4隔，着生于分生孢子梗顶端，大小为28×4μm；小型分生孢子棒状或卵圆形，单孢、棒状孢子的大小为6×2μm，卵圆形孢子直径为2.2μm；厚垣孢子呈球形，壁光滑，间生或顶生，10个成串，直径为5×5μm。
本新型川贝母内生真菌用于制备贝母辛和贝母素乙生物碱；其制备方法包括下列步骤：
1)将川贝母内生真菌cby4于pda培养基活化4天后，取直径为6mm的菌块接种到pdb培养液中，置于28℃恒温摇床中130r/min培养4天；在将此发酵液接种到另一个pdb培养液中扩大培养，其接种量为1％；
2)发酵完毕，收集培养物过滤后，利用浓氨水将发酵液的ph调到9，然后用二氯甲烷萃取2次，每次加入二氯甲烷体积为发酵液体积的1/4；收集二氯甲烷，并置于水浴锅上用蒸发皿挥干，再用甲醇复溶残留物并用0.22μm的有机滤膜过滤即得贝母辛和贝母素乙生物碱。
本发明的新型川贝母内生真菌，通过菌株液体发酵能够产生贝母辛和贝母素乙化合物，是寻找贝母类生物碱新资源的重要微生物，具有较大的应用价值。