一种高效花生根瘤固氮菌的分离培养基及其制备方法与流程

本发明属于分离培养基技术领域，尤其涉及一种高效花生根瘤固氮菌的分离培养基及其制备方法。

背景技术：

根瘤菌是一种能够与特定植物共生，形成根瘤共生体并固定空气中的氮气供植物营养的一类杆状细菌。在对根瘤固氮菌进行分离培养时，由于人工培养基不符合菌落的生长条件，导致菌落在培养基中生长不好，因此不能够保证所有花生根瘤固氮菌被全部分离出来，无法开展后续工作；且对根瘤固氮菌进行分离过程比较缓慢，分离效率较低，对根瘤固氮菌进行培养时，由于传统培养基成分受限，也影响根瘤固氮菌的生长繁殖。

综上所述，现有技术存在的问题是：由于人工培养基不符合菌落的生长条件，导致菌落在培养基中生长不好，因此不能够保证所有花生根瘤固氮菌被全部分离出来，无法开展后续工作；且对根瘤固氮菌进行分离过程比较缓慢，分离效率较低，对根瘤固氮菌进行培养时，由于传统培养基成分受限，也影响根瘤固氮菌的生长繁殖；培养液酸碱度中和时一般利用盐酸中和，但利用盐酸中和后，需再次灭菌，工序复杂。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种高效花生根瘤固氮菌的分离培养基及其制备方法。

本发明是这样实现的，一种适合酸性土壤的高效花生根瘤固氮菌的分离培养基，所述高效花生根瘤固氮菌的分离培养基由1.0g磷酸二氢钾、1.54g磷酸氢二钾、0.05g氯化钠、0.04g氯化钙、0.004g氯化铁、0.1g硫酸镁、0.8g酵母浸粉、15.0g琼脂、3.0g柠檬酸铁和1000ml蒸馏水组成。

本发明的另一目的在于提供一种适合酸性土壤的高效花生根瘤固氮菌的分离培养基的制备方法，所述适合酸性土壤的高效花生根瘤固氮菌的分离培养基的制备方法包括以下步骤：

第一步，对培养皿进行高温灭菌，

第二步，将磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、酵母浸粉、琼脂、柠檬酸铁、蒸馏水在无菌试管中进行混合，并摇匀，将混合溶液倒入培养皿中；

第三步，将培养基放置在30摄氏度的孵箱中，利用二氧化碳高温产生的碳酸将ph值调整为5.6时取出；

第四步，放入25摄氏度保温箱，完成分离培养基的配置。

进一步，所述适合酸性土壤的根瘤固氮菌的分离培养方法包括：

(1)选择酸性土壤中的花生根瘤，剪取一段根，并用清水洗净；

(2)对洗净后的花生根瘤进行表面灭菌；

(3)将花生根瘤放入高温消毒的试管中，并利用无菌镊子将根瘤压碎，加入1ml无菌水，混合均匀，得悬浮液；

(4)利用稀释法分离根瘤固氮菌得根瘤固氮菌菌落；

(5)将菌落放入分离培养基中，加入钴微量元素与乳酸钠溶液，对花生根瘤固氮菌进行培养。

进一步，所述花生根瘤表面灭菌处理包括：

花生根瘤在95％的酒精中浸泡与1分钟；

取出花生根瘤用无菌水冲洗2-3次；

将花生根瘤浸泡在0.1％的升汞溶液浸泡5分钟；

取出花生根瘤用无菌水再次冲洗3-4次。

进一步，所述稀释法包括：

准备4个无菌培养皿，取一环悬浮液加1ml无菌水放入第一个无菌培养皿中，搅拌均匀；取1环第一个无菌培养皿中的悬浮液加1ml无菌水放入第二个无菌培养皿中，搅拌均匀；取1环第二个无菌培养皿中的悬浮液加1ml无菌水放入第三个无菌培养皿中，搅拌均匀；以此类推，直至培养皿中出现3-4个单独菌落。

进一步，所述乳酸钠溶液制备方法包括：称取乳酸钠10g，加热溶解于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，得乳酸钠溶液。

本发明的优点及积极效果为：该分离培养基能够对耐酸花生根瘤固氮菌进行高效、彻底的分离，通过根瘤固氮菌对培养基的选择性，使根瘤菌进行快速分离，同时加入的微量元素钴能够促进分离后的根瘤菌生长和繁殖，加快根瘤菌的繁殖速度；利用培养液高温处理时二氧化碳产生的碳酸降低ph值，温和且无需再次除菌；利用稀释法分离根瘤固氮菌，分离效果好。

附图说明

图1是本发明实施例提供的高效花生根瘤固氮菌的分离培养基的制备方法流程图；

图2是本发明实施例提供的高效花生根瘤固氮菌的分离培养方法流程图。

具体实施方式

为能进一步了解本发明的发明内容、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图详细说明如下。

下面结合附图对本发明的结构作详细的描述。

本发明实施例提供的高效花生根瘤固氮菌的分离培养基由1.0g磷酸二氢钾、1.54g磷酸氢二钾、0.05g氯化钠、0.04g氯化钙、0.004g氯化铁、0.1g硫酸镁、0.8g酵母浸粉、15.0g琼脂、3.0g柠檬酸铁和1000ml蒸馏水组成。

如图1所示，本发明实施例提供的高效花生根瘤固氮菌的分离培养基的制备方法包括以下步骤：

s101：对培养皿进行高温灭菌，

s102：将磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、酵母浸粉、琼脂、柠檬酸铁、蒸馏水在无菌试管中进行混合，并摇匀，将混合溶液倒入培养皿中；

s103：将培养基放置在30℃的孵箱中，利用二氧化碳高温产生的碳酸将ph值调整为5.6时取出；

s104：放入25℃保温箱，完成分离培养基的配置。

如图2所示，本发明实施例提供的根瘤固氮菌的分离培养方法包括：

s201：选择酸性土壤中的花生根瘤，剪取一段根，并用清水洗净；

s202：对洗净后的花生根瘤进行表面灭菌；

s203：将花生根瘤放入高温消毒的试管中，并利用无菌镊子将根瘤压碎，加入1ml无菌水，混合均匀，得悬浮液；

s204：利用稀释法分离根瘤固氮菌得根瘤固氮菌菌落；

s205：将菌落放入分离培养基中，加入适量浓度的钴微量元素与乳酸钠溶液，对花生根瘤固氮菌进行培养。

步骤s202中，本发明实施例提供的花生根瘤表面灭菌处理包括：

花生根瘤在95％的酒精中浸泡与1分钟；

取出花生根瘤用无菌水冲洗2-3次；

将花生根瘤浸泡在0.1％的升汞溶液浸泡5分钟；

取出花生根瘤用无菌水再次冲洗3-4次。

步骤s204中，本发明实施例提供的稀释法包括：

准备4个无菌培养皿，取一环悬浮液加1ml无菌水放入第一个无菌培养皿中，搅拌均匀；取1环第一个无菌培养皿中的悬浮液加1ml无菌水放入第二个无菌培养皿中，搅拌均匀；取1环第二个无菌培养皿中的悬浮液加1ml无菌水放入第三个无菌培养皿中，搅拌均匀；以此类推，直至培养皿中出现3-4个单独菌落。

步骤s205中，本发明实施例提供的乳酸钠溶液包括：

称取乳酸钠10g，加热溶解于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15分钟，得乳酸钠溶液。

本发明的工作原理：将1.0g磷酸二氢钾、1.54g磷酸氢二钾、0.05g氯化钠、0.04g氯化钙、0.004g氯化铁、0.1g硫酸镁、0.8g酵母浸粉、15.0g琼脂、3.0g柠檬酸铁、1000ml蒸馏水进行混合，通过酵母浸粉为菌落提供氮源，氯化钠维持均衡的渗透压，琼脂块为培养基的凝固剂，调节保温箱温度，称取一定量的培养基，将称量好的培养基放置在30℃的孵箱内，利用二氧化碳产生的碳源调节ph值，然后将培养基放置在25℃的保温箱内，使培养基环境温度符合菌落分离、繁殖的最适温度，利用稀释法分离根瘤固氮菌，将菌株放入分离培养基中，通过培养基的养料和微量元素钴维持根瘤固氮菌的生长，促进根瘤固氮菌的繁殖。

以上所述仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。