一种提高猪球虫卵囊分离效率和洁净度的方法与流程

本发明涉及生物分离
技术领域：
，特别涉及一种提高猪球虫卵囊分离效率和洁净度的方法。
背景技术：
：猪球虫病是寄生于猪肠道上皮细胞的艾美耳属球虫和等孢属球虫引起的，以腹泻和消瘦为主要症状。其中猪球虫对哺乳仔猪的危害最为严重，目前该病的预防和治疗主要使用妥曲珠利，但长期使用一种药物容易导致球虫产生耐药性，故需寻求新的防止措施。疫苗免疫被视为最理想的防控措施，无论是为了更好地研究猪球虫的生物学特征还是进行猪球虫疫苗研发，都需要将球虫卵囊从猪粪中分离出来。传统的卵囊分离纯化技术适合鸡球虫和兔球虫等粪便与卵囊能容易分离的混合物，由于仔猪粪内含有大量与球虫卵囊密度相近的脂肪或蛋白质等微小杂质，按常规卵囊分离方法，卵囊回收率和纯化效果不佳，目前急需一种更加高效、回收率和回收纯净度更高的分离方法。可见，现有技术还有待改进和提高。技术实现要素：鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种提高猪球虫卵囊分离效率和洁净度的方法，旨在解决现有技术中球虫卵囊的分离方法不适用于猪球虫卵囊的分离，纯净度和回收率不高的问题。为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：一种提高猪球虫卵囊分离效率和洁净度的方法，包括：s01.粪样处理：收集仔猪感染球虫后排出含有卵囊的粪便，加入粪便体积5～10倍的蒸馏水、自来水或饮用水，搅拌均匀，过筛，收集滤液；s02.洗涤：往上述收集的滤液中加入2～20份蒙脱石散和2～5份活性炭，400～800ｘg离心1～5min，弃去上清液，收集沉淀；s03.卵囊漂浮：加入沉淀体积2～5倍的1.16～1.18g/cm3的氯化钠饱和溶液或者1.16～1.18g/cm3的蔗糖溶液，充分搅拌至无可见块状物，1500～2500ｘg离心1～5min，收集上清液；s04.卵囊沉淀：加入步骤s03收集的上清液5~10倍体积的蒸馏水、自来水或饮用水，1500～2500ｘg离心3～5min，弃上清，收集沉淀，沉淀即为猪球虫卵囊。所述提高猪球虫卵囊分离效率和洁净度的方法中，所述方法在粪样处理前还包括仔猪饲养过程的处理，具体包括：仔猪感染卵囊后，逐步改变饲养配方，感染后第一天，将原来的全奶液饲喂改为饲喂4/5奶液加上1/5的猪用饲料；第二天饲喂3/5的奶液加上2/5的猪用饲料；第三天饲喂2/5的奶液加上3/5的猪用饲料，第四天饲喂1/5奶液加上4/5猪用饲料，第五天全部饲喂猪用饲料。所述提高猪球虫卵囊分离效率和洁净度的方法中，所述步骤s02中，往收集的滤液中加入20份蒙脱石散，400ｘg离心2min，弃去上清液，加入蒸馏水1800ｘg离心5min，弃去上清液，收集沉淀。所述提高猪球虫卵囊分离效率和洁净度的方法中，所述步骤s03中，加入沉淀体积2倍的1.16～1.18g/cm3的氯化钠溶液或者1.16～1.18g/cm3的蔗糖溶液，充分搅拌至无可见块状物，1800gｘg离心5min，收集上清液。所述提高猪球虫卵囊分离效率和洁净度的方法中，所述步骤s04中，加入步骤s03收集的上清液8倍体积的蒸馏水，1800ｘg离心3min，弃上清，收集沉淀，沉淀即为猪球虫卵囊。有益效果：本发明提供了一种提高猪球虫卵囊分离效率和洁净度的方法，能够有效地减少仔猪粪便中与球虫卵囊密度相近的脂肪或蛋白质等微小杂质，使球虫卵囊更容易地分离出来，提高了猪球虫卵囊的分离效率和回收纯净度，经本方法分离的球虫卵囊液杂质少，分离效率达80%以上，大大高于现有技术的分离方法。附图说明图1为本发明提供的实施例1～3和现有的球虫卵囊分离方法分离的猪球虫卵囊液在显微镜下观察的结果图。具体实施方式本发明提供一种提高猪球虫卵囊分离效率和洁净度的方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明提供一种提高猪球虫卵囊分离效率和洁净度的方法，包括：s01.粪样处理：收集仔猪感染球虫后排出含有卵囊的粪便，加入粪便体积5～10倍的蒸馏水、自来水或饮用水，搅拌均匀，过筛，收集滤液；优选地，收集的粪便加入蒸馏水搅拌均匀后依次过40目和80目网筛。两次过筛能够提高过筛的效率，第一次先去除颗粒度比较大的杂质，第二次再筛去颗粒度较小的杂质；通过80目网筛后的粪便颗粒度比较小，在后续处理中能够很好地将球虫卵囊分离出来；颗粒度过小，增加搅拌的时间，且溶解的水量要相对增加，不利于后续的沉淀、离心等操作；颗粒度过大，球虫卵囊难以与粪便杂质分离，降低了球虫卵囊的分离效率和纯度。s02.洗涤：往上述收集的滤液中加入2～10份蒙脱石散，400～800ｘg离心1～5min，弃去上清液，加入蒸馏水，1500～2500ｘg离心1～5min，弃去上清液，收集沉淀；优选地，所述加入滤液中的蒙脱石散的大小为400目。蒙脱石具有胶体分散特性，在洗涤过程中可以使粪便混合液处于混悬状态，让粪便里球虫卵囊快速彻底分离，提高卵囊的分离效率；此外，在卵囊漂浮过程，蒙脱石起到了固着大颗粒和其他杂质的作用，从而使得分离出来的卵囊更加纯净。优选地，往收集的滤液中加入15份蒙脱石散，650ｘg离心2min，弃去上清液，加入蒸馏水1800ｘg离心5min，弃去上清液，收集沉淀。s03.卵囊漂浮：加入沉淀体积2～5倍的1.16～1.18g/cm3的氯化钠溶液或者1.16～1.18g/cm3的蔗糖溶液，充分搅拌至无可见块状物，1600～1800ｘg离心3～5min，收集上清液；优选地，加入沉淀体积2倍的1.16～1.18g/cm3的氯化钠溶液或者1.16～1.18g/cm3的蔗糖溶液，充分搅拌至无可见块状物，1800ｘg离心5min，收集上清液。s04.卵囊沉淀：加入步骤s03收集的上清液5~10倍体积的蒸馏水、自来水或饮用水，1600～1800ｘg离心3～5min，弃上清，收集沉淀，沉淀即为猪球虫卵囊。优选地，加入步骤s03收集的上清液8倍体积的蒸馏水，1800ｘg离心3min，弃上清，收集沉淀，沉淀即为猪球虫卵囊。具体地，所述方法在粪样处理前还包括仔猪饲养过程的处理，具体包括：仔猪感染卵囊后，逐步改变饲养配方，感染后第一天，将原来的全奶液饲喂改为饲喂4/5奶液加上1/5的猪用饲料；第二天饲喂3/5的奶液加上2/5的猪用饲料；第三天饲喂2/5的奶液加上3/5的猪用饲料，第四天饲喂1/5奶液加上4/5猪用饲料，第五天全部饲喂猪用饲料。饲养配方的调整，能有效降低粪便中蛋白质和脂肪的含量，使粪便的内容物更加均一，卵囊更容易被分离出来。实施例1一种提高猪球虫卵囊分离效率和洁净度的方法，包括：饲养过程的处理：仔猪感染卵囊后，逐步改变饲养配方，感染后第一天，将原来的全奶液饲喂改为饲喂4/5奶液加上1/5的猪用饲料；第二天饲喂3/5的奶液加上2/5的猪用饲料；第三天饲喂2/5的奶液加上3/5的猪用饲料，第四天饲喂1/5奶液加上4/5猪用饲料，第五天全部饲喂猪用饲料。粪样处理：收集仔猪感染球虫后排出含有卵囊的粪便，加入粪便体积5倍的蒸馏水，搅拌均匀，依次过40目、80目筛，收集滤液；洗涤：往上述收集的滤液中加入2份蒙脱石散和2份活性炭，400ｘg离心5min，弃去上清液，收集沉淀；卵囊漂浮：加入沉淀体积5倍的1.16～1.18g/cm3的蔗糖溶液，充分搅拌至无可见块状物，1500ｘg离心1min，收集上清液；卵囊沉淀：加入上述收集的上清液5倍体积的蒸馏水，1500ｘg离心5min，弃上清，收集沉淀，沉淀即为猪球虫卵囊。实施例2一种提高猪球虫卵囊分离效率和洁净度的方法，包括：饲养过程的处理：仔猪感染卵囊后，逐步改变饲养配方，感染后第一天，将原来的全奶液饲喂改为饲喂4/5奶液加上1/5的猪用饲料；第二天饲喂3/5的奶液加上2/5的猪用饲料；第三天饲喂2/5的奶液加上3/5的猪用饲料，第四天饲喂1/5奶液加上4/5猪用饲料，第五天全部饲喂猪用饲料。粪样处理：收集仔猪感染球虫后排出含有卵囊的粪便，加入粪便体积10倍的自来水，搅拌均匀，依次过40目、80目筛，收集滤液；洗涤：往上述收集的滤液中加入15份蒙脱石散和3份活性炭，650ｘg离心2min，弃去上清液，加入自来水，1800ｘg离心3min，弃去上清液，收集沉淀；卵囊漂浮：加入沉淀体积3倍的1.16～1.18g/cm3的氯化钠溶液，充分搅拌至无可见块状物，1800ｘg离心5min，收集上清液；卵囊沉淀：加入上述收集的上清液8倍体积的自来水，1800ｘg离心3min，弃上清，收集沉淀，沉淀即为猪球虫卵囊。实施例3一种提高猪球虫卵囊分离效率和洁净度的方法，包括：饲养过程的处理：仔猪感染卵囊后，逐步改变饲养配方，感染后第一天，将原来的全奶液饲喂改为饲喂4/5奶液加上1/5的猪用饲料；第二天饲喂3/5的奶液加上2/5的猪用饲料；第三天饲喂2/5的奶液加上3/5的猪用饲料，第四天饲喂1/5奶液加上4/5猪用饲料，第五天全部饲喂猪用饲料。粪样处理：收集仔猪感染球虫后排出含有卵囊的粪便，加入粪便体积10倍的饮用水，搅拌均匀，依次过40目、80目筛，收集滤液；洗涤：往上述收集的滤液中加入20份蒙脱石散和5份活性炭，800ｘg离心1min，弃去上清液，收集沉淀；卵囊漂浮：加入沉淀体积5倍的1.16～1.18g/cm3的氯化钠溶液，充分搅拌至无可见块状物，2500ｘg离心5min，收集上清液；卵囊沉淀：加入上述收集的上清液10倍体积的饮用水，2500ｘg离心1min，弃上清，收集沉淀，沉淀即为猪球虫卵囊。将上述实施例1～3分离的猪球虫卵囊和使用现有的球虫卵囊的分离方法分离的球虫卵囊放在显微镜下观察，结果如图1所示。表1实施例1～3分离猪球虫卵囊和使用现有的球虫卵囊的分离方法分离球虫卵囊的分离效率和纯净度组别分离效率（%）纯净度实施例182卵囊液澄清透亮，显微镜下观察到部分杂质实施例288卵囊液澄清透亮，显微镜下观察到少量杂质实施例384卵囊液澄清透亮，显微镜下观察到少量杂质现有技术58卵囊液浑浊有沉淀，显微镜下观察到大量杂质由图1和表1可得，实施例1～3所述的方法球虫卵囊的分离效率均达80%以上，杂质少，纯净度高；而现有技术的分离效率仅为58%，比本方法低40%多，分离得到的球虫卵囊中杂质多，不利于后续利用。可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。当前第1页12