本发明涉及天然药化领域，具体为一种毕扣扣灵碱及原阿片碱的制备方法。
背景技术：
毕扣扣灵碱(+)-bicuculline分子式为c20h17no6，分子量367.36，cas号为485-49-4，为淡黄色粉末，溶于苯、氯仿、乙酸乙酯，微溶于乙醇和乙醚；原阿片碱protopine分子式为c20h19no5，分子量353.37，cas号为130-86-9，为白色粉末，溶于苯、氯仿、乙酸乙酯，微溶于乙醇和乙醚，此两种化合物皆为生物碱类物质，其结构式如下。
目前的技术中，尚无可以从植物中分离提纯毕扣扣灵碱的制备方法，针对原阿片碱的提取方法也存在收率低，难于工业化生产的问题。
技术实现要素：
本发明提供一种毕扣扣灵碱及原阿片碱的制备方法，使用该方法，毕扣扣灵碱及原阿片碱的收率均达到80％以上，并且纯度达到99％以上。
为解决以上技术问题，本发明提供一种毕扣扣灵碱与原阿片碱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取：取药材夏天无、延胡索或紫堇根茎中的一种或几种，粉碎，用酸性甲醇或乙醇溶液提取，得提取液a，合并提取液，减压浓缩至无醇，收集得浓缩液b。
2)分离富集：取浓缩液b，调ph为3-5，上反向聚合填料c进行吸附,先用水洗脱，得水洗液d，后用醇溶液e解析，收集解析液f，再用醇溶液g解析，得解析液h
3)纯化：取解析液h，减压浓缩，调ph为8-10，静置并过滤沉淀，沉淀用甲醇溶解后用硅胶拌样，得过柱原料i，将i上样，用二氯甲烷-甲醇体系洗脱，洗脱剂体积百分比从100:1-10:1，收集二氯甲烷-甲醇体积百分比为80:1-40:1的溶液j；解析液f，减压浓缩，调ph至9-10，析出沉淀k；水洗液d，调ph至9-10，析出沉淀l。
4)结晶干燥：溶液j减压浓缩得浸膏m，浸膏m结晶两次得毕扣扣灵碱纯品；沉淀k及沉淀l结晶一次得原阿片碱纯品，纯品真空鼓风干燥，得到该系列产品的纯品粉末。
优选的，步骤1)中，所述酸性甲醇或乙醇溶液含有体积百分比为0.1-2％的盐酸，以及体积百分比为50-100％的甲醇或乙醇。
优选的，步骤1)提取方法包括：回流提取、超声提取、渗漉提取。
优选的，步骤1)中减压浓缩的温度为50-70℃。
优选的，步骤2)中反向聚合填料c为任意一种选自ab-8大孔树脂、d-101大孔树脂、nm100-反向聚合物色谱填料。
优选的，步骤2)中醇溶液e为甲醇或乙醇溶液，所述醇溶液e中甲醇或乙醇的体积百分比为30-50％。
优选的，步骤2)中醇溶液g为甲醇或乙醇溶液，所述醇溶液g中甲醇或乙醇的体积百分比为80-95％。
优选的，步骤3)中解析液h和解析液f减压浓缩的温度为50-60℃。
优选的，步骤3)中使用氨水调整解析液h、解析液f及水洗液d的ph值。
更为优选的，步骤4)中浸膏l使用二氯甲烷-甲醇体系结晶，沉淀k使用二氯甲烷-无水乙醇体系结晶。
本发明中，将药材粉碎后，采用不同的方式进行提取，提取液通过反向填料柱吸附后用不同体积百分比的甲醇或乙醇溶液进行洗脱进行解析，解析液通过硅胶柱层析色谱及直接沉淀法得到目标产物的粗品，粗品经重结晶得纯品，本发明制得的毕扣扣灵碱及原阿片碱纯品，纯度可达99％以上，收率达80％，适合于工业化生产。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
本发明公开了一种毕扣扣灵碱与原阿片碱的制备方法，包括1)提取：取药材粉碎，用酸性甲醇或乙醇溶液提取，得提取液a，减压浓缩得浓缩液b。2)分离富集：取浓缩液b，调ph上反向聚合填料c进行吸附，先用水洗脱，得水洗液d，后用醇溶液e解析，收集解析液f，再用醇溶液g解析，得解析液h。3)纯化：取解析液h，减压浓缩调ph，静置并过滤沉淀，沉淀拌样，通过硅胶柱层析色谱得溶液j；解析液f，减压浓缩，调ph至9-10，析出沉淀k；水洗液d，调ph至9-10，析出沉淀l。4)结晶干燥：溶液j减压浓缩结晶干燥后得毕扣扣灵碱纯品；沉淀k及沉淀l结晶干燥，得原阿片碱纯品。使用该方法，收率高，纯度高，可工业化生产。
上述为本发明的详细阐述，下面为本发明实施例。
实施例一
1)提取：取药材夏天无、延胡索或紫堇根茎中的一种或几种，粉碎，用酸性甲醇或乙醇溶液提取，所述酸性甲醇或乙醇溶液含有体积百分比为0.1-2％的盐酸，以及体积百分比为50-100％的甲醇或乙醇，回流提取，得提取液a，每次提取1-2小时，提取3-6次，合并提取液，50-70℃减压浓缩至无醇，收集得浓缩液b。
2)分离富集：取浓缩液b，用0.1％-2％盐酸溶液调ph为3-5，上反向聚合填料c进行吸附,反向聚合填料c为ab-8大孔树脂，先用3个柱体积水洗脱，得水洗液d，后用3倍柱体积的醇溶液e解析，醇溶液e为30-50％的甲醇或乙醇，收集解析液f，再用醇溶液g解析，醇溶液g为80-95％甲醇或乙醇，解析得解析液h。
3)纯化：取解析液h，50-60℃减压浓缩至无醇，氨水调ph为8-10，静置2小时，过滤沉淀，沉淀用甲醇溶解后用60-80目硅胶拌样，得过柱原料i，i为黄色分散颗粒，将i上样，用二氯甲烷-甲醇体系洗脱，洗脱剂体积百分比从100:1-80:1-10:1，收集洗脱剂二氯甲烷-甲醇体积百分比为80:1-40:1的区间溶液j，在洗脱过程中，产品出现棕色、灰黑色和黑色三个色带，黑色色带主要为毕扣扣灵碱，收集该色带的洗脱液，用tlc进行跟踪检测，tlc检测条件为二氯甲烷：甲醇(60:1)；解析液f，50-60℃减压浓缩，氨水调ph至9-10，析出沉淀k，过滤待进一步纯化；水洗液d，氨水调ph至9-10，析出沉淀l，过滤待进一步纯化。
4)结晶干燥：溶液j减压浓缩得浸膏m，浸膏m用二氯甲烷-甲醇体系结晶两次得毕扣扣灵碱纯品，纯品于40-50℃真空鼓风干燥，得到该系列产品的纯品粉末；沉淀k及沉淀l用二氯甲烷-无水乙醇体系结晶一次得原阿片碱纯品，纯品于40-50℃真空鼓风干燥，得到该系列产品的纯品粉末。
分组：按步骤1)使用药材不同，将实验分为3组，a组为夏天无，b组为延胡索，c组为紫堇。通过hplc法检测每组毕扣扣灵碱与原阿片碱的收率和产品纯度，其结果如表1所示
表1，实施例一不同分组的实验结果
上述实验结果表明，药材夏天无为本发明的优选实施方式。
实施例二
1)提取：取药材夏天无，粉碎，用酸性甲醇或乙醇溶液提取，所述酸性甲醇或乙醇溶液含有体积百分比为0.1-2％的盐酸，回流提取，得提取液a，每次提取1-2小时，提取3-6次，合并提取液，50-70℃减压浓缩至无醇，收集得浓缩液b。
2)分离富集：取浓缩液b，用0.1％-2％盐酸溶液调ph为3-5，上反向聚合填料c进行吸附,反向聚合填料c为ab-8大孔树脂，先用3个柱体积水洗脱，得水洗液d，后用3倍柱体积的醇溶液e解析，醇溶液e为30-50％的甲醇或乙醇，收集解析液f，再用醇溶液g解析，醇溶液g为80-95％甲醇或乙醇，解析得解析液h。
3)纯化：取解析液h，50-60℃减压浓缩至无醇，氨水调ph为8-10，静置2小时，过滤沉淀，沉淀用甲醇溶解后用60-80目硅胶拌样，得过柱原料i，i为黄色分散颗粒，将i上样，用二氯甲烷-甲醇体系洗脱，洗脱剂体积百分比从100:1-80:1-10:1，收集洗脱剂二氯甲烷-甲醇体积百分比为80:1-40:1的区间溶液j，在洗脱过程中，产品出现棕色、灰黑色和黑色三个色带，黑色色带主要为毕扣扣灵碱，收集该色带的洗脱液，用tlc进行跟踪检测，tlc检测条件为二氯甲烷：甲醇(60:1)；解析液f，50-60℃减压浓缩，氨水调ph至9-10，析出沉淀k，过滤待进一步纯化；水洗液d，氨水调ph至9-10，析出沉淀l，过滤待进一步纯化。
4)结晶干燥：溶液j减压浓缩得浸膏m，浸膏m用二氯甲烷-甲醇体系结晶两次得毕扣扣灵碱纯品，纯品于40-50℃真空鼓风干燥，得到该系列产品的纯品粉末；沉淀k及沉淀l用二氯甲烷-无水乙醇体系结晶一次得原阿片碱纯品，纯品于40-50℃真空鼓风干燥，得到该系列产品的纯品粉末。
分组：按步骤1)中酸性甲醇或乙醇中甲醇或乙醇百分比的不同，将实验分为4组，d组为甲醇体积百分比1-50％的酸性甲醇，e甲醇体积百分比50-100％的酸性甲醇，f组乙醇体积百分比1-50％的酸性乙醇，g组乙醇体积百分比50-100％的酸性乙醇。通过hplc法检测每组毕扣扣灵碱与原阿片碱的收率和产品纯度，其结果如表2所示
表2，实施例二不同分组的实验结果
上述实验结果表明，酸性甲醇或乙醇中甲醇或乙醇百分比为50-100％是优选方式。
实施例三
1)提取：取药材夏天无，粉碎，用酸性甲醇或乙醇溶液提取，所述酸性甲醇或乙醇溶液含有体积百分比为0.1-2％的盐酸，以及体积百分比为50-100％的甲醇或乙醇。提取方式任意一种选自回流提取、超声提取或渗漉提取，得提取液a，每次提取1-2小时，提取3-6次，合并提取液，50-70℃减压浓缩至无醇，收集得浓缩液b。
2)分离富集：取浓缩液b，用0.1％-2％盐酸溶液调ph为3-5，上反向聚合填料c进行吸附,反向聚合填料c为ab-8大孔树脂，先用3个柱体积水洗脱，得水洗液d，后用3倍柱体积的醇溶液e解析，醇溶液e为30-50％的甲醇或乙醇，收集解析液f，再用醇溶液g解析，醇溶液g为80-95％甲醇或乙醇，解析得解析液h。
3)纯化：取解析液h，50-60℃减压浓缩至无醇，氨水调ph为8-10，静置2小时，过滤沉淀，沉淀用甲醇溶解后用60-80目硅胶拌样，得过柱原料i，i为黄色分散颗粒，将i上样，用二氯甲烷-甲醇体系洗脱，洗脱剂体积百分比从100:1-80:1-10:1，收集洗脱剂二氯甲烷-甲醇体积百分比为80:1-40:1的区间溶液j，在洗脱过程中，产品出现棕色、灰黑色和黑色三个色带，黑色色带主要为毕扣扣灵碱，收集该色带的洗脱液，用tlc进行跟踪检测，tlc检测条件为二氯甲烷：甲醇(60:1)；解析液f，50-60℃减压浓缩，氨水调ph至9-10，析出沉淀k，过滤待进一步纯化；水洗液d，氨水调ph至9-10，析出沉淀l，过滤待进一步纯化。
4)结晶干燥：溶液j减压浓缩得浸膏m，浸膏m用二氯甲烷-甲醇体系结晶两次得毕扣扣灵碱纯品，纯品于40-50℃真空鼓风干燥，得到该系列产品的纯品粉末；沉淀k及沉淀l用二氯甲烷-无水乙醇体系结晶一次得原阿片碱纯品，纯品于40-50℃真空鼓风干燥，得到该系列产品的纯品粉末。
分组：按步骤1)中提取方式的不同，将实验分为h、i、j三组，h采用回流提取的方式，i采用超声提取的方式，j采用渗漉提取的方式。通过hplc法检测每组毕扣扣灵碱与原阿片碱的收率和产品纯度，其结果如表3所示
表3，实施例三的分组实验结果
上述实验结果表明，回流提取、超声提取、渗漉提取收率均在80％以上，纯度均在99％以上，结果之间无显著性差异，故该三种提取方式均为本发明的优选方式。
实施例四
1)提取：取药材夏天无，粉碎，用酸性甲醇或乙醇溶液提取，所述酸性甲醇或乙醇溶液含有体积百分比为0.1-2％的盐酸，以及体积百分比为50-100％的甲醇或乙醇。回流提取，得提取液a，每次提取1-2小时，提取3-6次，合并提取液，50-70℃减压浓缩至无醇，收集得浓缩液b。
2)分离富集：取浓缩液b，用0.1％-2％盐酸溶液调ph为3-5，上反向聚合填料c进行吸附,反向聚合填料c为任意一种选自ab-8大孔树脂、d-101大孔树脂、nm100-反向聚合物色谱填料，先用3个柱体积水洗脱，得水洗液d，后用3倍柱体积的醇溶液e解析，醇溶液e为30-50％的甲醇或乙醇，收集解析液f，再用醇溶液g解析，醇溶液g为80-95％甲醇或乙醇，解析得解析液h。
3)纯化：取解析液h，50-60℃减压浓缩至无醇，氨水调ph为8-10，静置2小时，过滤沉淀，沉淀用甲醇溶解后用60-80目硅胶拌样，得过柱原料i，i为黄色分散颗粒，将i上样，用二氯甲烷-甲醇体系洗脱，洗脱剂体积百分比从100:1-80:1-10:1，收集洗脱剂二氯甲烷-甲醇体积百分比为80:1-40:1的区间溶液j，在洗脱过程中，产品出现棕色、灰黑色和黑色三个色带，黑色色带主要为毕扣扣灵碱，收集该色带的洗脱液，用tlc进行跟踪检测，tlc检测条件为二氯甲烷：甲醇(60:1)；解析液f，50-60℃减压浓缩，氨水调ph至9-10，析出沉淀k，过滤待进一步纯化；水洗液d，氨水调ph至9-10，析出沉淀l，过滤待进一步纯化。
4)结晶干燥：溶液j减压浓缩得浸膏m，浸膏m用二氯甲烷-甲醇体系结晶两次得毕扣扣灵碱纯品，纯品于40-50℃真空鼓风干燥，得到该系列产品的纯品粉末；沉淀k及沉淀l用二氯甲烷-无水乙醇体系结晶一次得原阿片碱纯品，纯品于40-50℃真空鼓风干燥，得到该系列产品的纯品粉末。
分组：按步骤2)中反向聚合填料c的不同，将实验分为k、l、m三组，k采用ab-8大孔树脂，l采用d-101大孔树脂，m采用nm100-反向聚合物色谱填料。通过hplc法检测每组毕扣扣灵碱与原阿片碱的收率和产品纯度，其结果如表4所示
表4，实施例四的分组实验结果
上述实验结果表明，反向聚合填料c采用ab-8大孔树脂，l采用d-101大孔树脂，m采用nm100-反向聚合物色谱填料的收率均在80％以上，纯度均在99％以上，结果之间无显著性差异，故该三种提取方式均为本发明的优选方式。
实施例五
1)提取：取药材夏天无，粉碎，用酸性甲醇或乙醇溶液提取，所述酸性甲醇或乙醇溶液含有体积百分比为0.1-2％的盐酸，以及体积百分比为50-100％的甲醇或乙醇。回流提取，得提取液a，每次提取1-2小时，提取3-6次，合并提取液，50-70℃减压浓缩至无醇，收集得浓缩液b。
2)分离富集：取浓缩液b，用0.1％-2％盐酸溶液调ph为3-5，上反向聚合填料c进行吸附,反向聚合填料c为ab-8大孔树脂，先用3个柱体积水洗脱，得水洗液d，后用3倍柱体积的醇溶液e解析，收集解析液f，再用醇溶液g解析，醇溶液g为80-95％甲醇或乙醇，解析得解析液h。
3)纯化：取解析液h，50-60℃减压浓缩至无醇，氨水调ph为8-10，静置2小时，过滤沉淀，沉淀用甲醇溶解后用60-80目硅胶拌样，得过柱原料i，i为黄色分散颗粒，将i上样，用二氯甲烷-甲醇体系洗脱，洗脱剂体积百分比从100:1-80:1-10:1，收集洗脱剂二氯甲烷-甲醇体积百分比为80:1-40:1的区间溶液j，在洗脱过程中，产品出现棕色、灰黑色和黑色三个色带，黑色色带主要为毕扣扣灵碱，收集该色带的洗脱液，用tlc进行跟踪检测，tlc检测条件为二氯甲烷：甲醇(60:1)；解析液f，50-60℃减压浓缩，氨水调ph至9-10，析出沉淀k，过滤待进一步纯化；水洗液d，氨水调ph至9-10，析出沉淀l，过滤待进一步纯化。
4)结晶干燥：溶液j减压浓缩得浸膏m，浸膏m用二氯甲烷-甲醇体系结晶两次得毕扣扣灵碱纯品，纯品于40-50℃真空鼓风干燥，得到该系列产品的纯品粉末；沉淀k及沉淀l用二氯甲烷-无水乙醇体系结晶一次得原阿片碱纯品，纯品于40-50℃真空鼓风干燥，得到该系列产品的纯品粉末。
分组：按步骤2)中按醇溶液e中甲醇或乙醇体积百分比的不同，将实验分为n、o、p、q、r、s组。n组为10-30％甲醇，o组为30-50％甲醇，p组为50-70％甲醇，q组10-30％乙醇，r组为30-50％乙醇，s组为50-70％乙醇。通过hplc法检测每组毕扣扣灵碱与原阿片碱的收率和产品纯度，其结果如表5所示
表5，实施例五的分组实验结果
上述实验结果表明，醇e溶液中甲醇或乙醇体积百分比为30-50％时为本发明的优选实施方式。
实施例六
1)提取：取药材夏天无，粉碎，用酸性甲醇或乙醇溶液提取，所述酸性甲醇或乙醇溶液含有体积百分比为0.1-2％的盐酸，以及体积百分比为50-100％的甲醇或乙醇。回流提取，得提取液a，每次提取1-2小时，提取3-6次，合并提取液，50-70℃减压浓缩至无醇，收集得浓缩液b。
2)分离富集：取浓缩液b，用0.1％-2％盐酸溶液调ph为3-5，上反向聚合填料c进行吸附,反向聚合填料c为ab-8大孔树脂，先用3个柱体积水洗脱，得水洗液d，后用3倍柱体积的醇溶液e解析，醇溶液e为30-50％的甲醇或乙醇，收集解析液f，再用醇溶液g解析，解析得解析液h。
3)纯化：取解析液h，50-60℃减压浓缩至无醇，氨水调ph为8-10，静置2小时，过滤沉淀，沉淀用甲醇溶解后用60-80目硅胶拌样，得过柱原料i，i为黄色分散颗粒，将i上样，用二氯甲烷-甲醇体系洗脱，洗脱剂体积百分比从100:1-80:1-10:1，收集洗脱剂二氯甲烷-甲醇体积百分比为80:1-40:1的区间溶液j，在洗脱过程中，产品出现棕色、灰黑色和黑色三个色带，黑色色带主要为毕扣扣灵碱，收集该色带的洗脱液，用tlc进行跟踪检测，tlc检测条件为二氯甲烷：甲醇(60:1)；解析液f，50-60℃减压浓缩，氨水调ph至9-10，析出沉淀k，过滤待进一步纯化；水洗液d，氨水调ph至9-10，析出沉淀l，过滤待进一步纯化。
4)结晶干燥：溶液j减压浓缩得浸膏m，浸膏m用二氯甲烷-甲醇体系结晶两次得毕扣扣灵碱纯品，纯品于40-50℃真空鼓风干燥，得到该系列产品的纯品粉末；沉淀k及沉淀l用二氯甲烷-无水乙醇体系结晶一次得原阿片碱纯品，纯品于40-50℃真空鼓风干燥，得到该系列产品的纯品粉末。
分组：按步骤2)中按醇溶液g中甲醇或乙醇体积百分比的不同，将实验分为t、u、v、w组。t组为65-80％甲醇，u组为80-95％甲醇，v组为65-80％乙醇，w组为80-95％乙醇。通过hplc法检测每组毕扣扣灵碱与原阿片碱的收率和产品纯度，其结果如表6所示
表6，实施例六的分组实验结果
上述实验结果表明，醇g溶液中甲醇或乙醇体积百分比为80-95％时为本发明的优选实施方式。
上述实施例中毕扣扣灵碱、原阿片碱的检测条件如下：
流动相：乙腈：三乙胺醋酸溶液(水500ml+醋酸15ml+三乙胺4ml)＝25:75；
波长：289nm。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。