一种从山银花中制备8种单体的方法与流程

本发明涉及中药提取分离技术领域，尤其涉及一种从山银花中制备8种单体的方法。

背景技术：

山银花(flosloniceraeconfusae)是忍冬科植物灰毡毛忍冬、红腺忍冬、华南忍冬或黄褐毛忍冬的干燥花蕾或带初开的花。山银花花味甘微苦、性寒、无毒。归肺心胃经。内服凉肠凉血解毒，通络利湿。外用消肿。主治感冒、暑热、积热便秘、痢疾、便血、解煤炭烟毒、风湿酸痛、牙龈肿痛、胆囊炎等。

绿原酸类化合物是山银花的主要有效成分，提取物也以绿原酸为指标。现有研究中，几乎没有从山银花中提取、分离制备多个单体的报道。中国专利(申请号201410332285.9)公开了将山银花粉碎后经提取罐提取，提取液经大孔树脂纯化后再利用工业色谱分离，最后采用喷雾干燥技术制备绿原酸含量为49.13％的样品，该方法存在生产周期长、纯度较低以及制备目标成分单一等问题。中国专利(201510379045.9)公开了金银花经过提取后浓缩，浓缩液再用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩后采用动态轴向压缩柱分离制备新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、断氧马钱子4个成分，4个成分的纯度大于90％，该方法存在有机试剂用量大、样品纯度较低、制备单体成分较少等问题。

技术实现要素：

为了克服现有技术山银花提取方法存在有机试剂用量大、样品纯度较低、制备单体成分较少等问题，本发明提供一种从山银花中大量制备多种高纯度的单体的制备方法，为充分开发利用山银花植物资源、制备标准物质以及新药开发提供研究基础。

本发明的目的通过以下技术方案实现：一种从山银花中制备8种单体的方法，所述方法包括如下步骤：

步骤一，药材粉碎：取山银花药材，用粉碎机粉碎；

步骤二，超声波辅助提取：山银花药材粉末加入纯化水，超声提取，提取完成后，过滤，得提取液；

步骤三，大孔树脂分离纯化：将提取液上大孔树脂柱，先用水洗脱，再用乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液在50～70℃下减压浓缩得粗品；

步骤四，动态轴向压缩柱填装：将色谱填料用无水乙醇匀浆，调整填装压力，将匀浆液倒入动态轴向压缩柱，排除匀浆液后压实填料，完成动态轴向压缩柱填装；

步骤五，动态轴向压缩柱分离：待动态轴向压缩柱填装完成后采用流动相平衡至色谱基线平稳，粗品用流动相溶解后过滤，得进样液，进样液通过工业型制备色谱分离，检测波长为230nm，根据不同保留时间收集目标成分，收集液经50～70℃减压浓缩、冷冻干燥即得各单体化合物。

优选的，所述的一种从山银花中制备8种单体的方法，所述步骤一中，山银花药材粉碎至10～60目粉末。

优选的，所述的一种从山银花中制备8种单体的方法，所述步骤二中，山银花药材粉末与纯化水的料液比为1：10～40(g/ml)，提取的时间为0.5～2.5h。

优选的，所述的一种从山银花中制备8种单体的方法，所述步骤三中，大孔树脂为d101、hpd-100、ab-8、d301、ads-7、jd-1中的一种。

优选的，所述的一种从山银花中制备8种单体的方法，所述步骤三中，乙醇溶液的体积分数为10％～40％。

优选的，所述的一种从山银花中制备8种单体的方法，所述步骤四中，动态轴向压缩柱的填装规格为50mm×250mm。

优选的，所述的一种从山银花中制备8种单体的方法，所述步骤五中，工业型制备色谱柱填料为c18-100、unips10-300、unisilnh210-120、unisilc18-100、unisilc8-100中的一种。

优选的，所述的一种从山银花中制备8种单体的方法，所述步骤五中，进样液浓度为50～150mg/ml。

优选的，所述的一种从山银花中制备8种单体的方法，所述步骤五中，流动相为体积分数为10％～45％的甲醇。

优选的，所述的一种从山银花中制备8种单体的方法，所述步骤五中，流动相流速为10ml/min～40ml/min。

与现有技术相比，本发明具有如下的优益效果：本发明首次采用超声波辅助提取——大孔树脂纯化——动态轴向压缩柱分离为核心的整套技术从山银花中同时提取分离5-咖啡酰奎宁酸、四乙酰开联番木鳖苷、开联番木鳖苷酸、绿原酸、獐牙菜苷、断氧化马钱子、裂环马钱素以及4，5-二咖啡酰奎宁酸的方法，建立了一条从山银花中提取、纯化、分离8种单体的工艺路线，该工艺合理、可行，过程简单，溶剂方便回收，纯度高并且可以大批量工业化生产，具有很强的实用价值。

附图说明

图1是本实施例1中动态轴向压缩柱分离山银花进样液色谱图；

图2是本实施例1中5-咖啡酰奎宁酸单体高效液相色谱图；

图3是本实施例1中四乙酰开联番木鳖苷单体高效液相色谱图；

图4是本实施例1中开联番木鳖苷酸单体高效液相色谱图；

图5是本实施例1中绿原酸单体高效液相色谱图；

图6是本实施例1中獐牙菜苷单体高效液相色谱图；

图7是本实施例1中断氧化马钱子单体高效液相色谱图；

图8是本实施例1中裂环马钱素单体高效液相色谱图；

图9是本实施例1中4，5-二咖啡酰奎宁酸单体高效液相色谱图。

图中：15-咖啡酰奎宁酸；2四乙酰开联番木鳖苷、3开联番木鳖苷酸；4绿原酸；5獐牙菜苷；6断氧化马钱子；7裂环马钱素；84，5-二咖啡酰奎宁酸。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面将通过实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种从山银花中制备8种单体的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)药材粉碎：取山银花药材，用粉碎机粉碎至40目；

(2)超声波辅助提取：山银花药材粉末加入25倍量纯化水(g/ml)，超声提取1.5h，提取完成后，过滤，得提取液；

(3)大孔树脂分离纯化：将提取液上预处理过的d101大孔树脂柱，先用水洗脱，再用体积分数为20％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液在50～70℃下减压浓缩得粗品；

(4)动态轴向压缩柱填装：取色谱填料c18-100400g，用无水乙醇匀浆，调整填装压力，将匀浆液倒入动态轴向压缩柱，排除匀浆液后压实填料至填装规格为50mm×250mm，完成动态轴向压缩柱填装；

(5)动态轴向压缩柱分离：完成动态轴向压缩柱填装后用流动相平衡至色谱基线平稳，粗品用流动相溶解配置成100mg/ml，过滤即得进样液，进样液通过工业型制备色谱分离，以体积分数30％的甲醇为流动相，流速为25ml/min，检测波长为230nm，根据不同保留时间收集目标成分，收集液经50～70℃减压浓缩、冷冻干燥即得各单体化合物。

单体化合物经hplc检测，其高效液相色谱图如图1所示，5-咖啡酰奎宁酸纯度为96.77％，四乙酰开联番木鳖苷纯度为97.38％，开联番木鳖苷酸纯度为97.55％，绿原酸纯度为99.07％，獐牙菜苷纯度为95.82％，断氧化马钱子纯度为96.35％，裂环马钱素纯度为97.47％，4，5-二咖啡酰奎宁酸纯度为98.63％，各化合物纯度均大于95％，各化合物的高效液相色谱图如图2～9所示。

实施例2

一种从山银花中制备8种单体的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)药材粉碎：取山银花药材，用粉碎机粉碎至10目；

(2)超声波辅助提取：山银花药材粉末加入10倍量纯化水(g/ml)，超声提取2.5h，提取完成后，过滤，得提取液；

(3)大孔树脂分离纯化：将提取液上预处理过的jd-1大孔树脂柱，先用水洗脱，再用体积分数为10％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液50～70℃减压浓缩得粗品；

(4)动态轴向压缩柱填装：取色谱填料unisilc8-100400g，用无水乙醇匀浆，调整填装压力，将匀浆液倒入动态轴向压缩柱，排除匀浆液后压实填料至填装规格为50mm×250mm，完成动态轴向压缩柱填装；

(5)动态轴向压缩柱分离：完成动态轴向压缩柱填装后采用流动相平衡至色谱基线平稳，粗品用流动相溶解配置成50mg/ml，过滤即得进样液，进样液通过工业型制备色谱分离，以体积分数10％的甲醇为流动相，流速为40ml/min，检测波长为230nm，根据不同保留时间收集目标成分，收集液经50～70℃减压浓缩、冷冻干燥即得各单体化合物。

单体化合物经hplc检测，5-咖啡酰奎宁酸纯度为96.13％，四乙酰开联番木鳖苷纯度为96.97％，开联番木鳖苷酸纯度为97.02％，绿原酸纯度为98.87％，獐牙菜苷纯度为95.70％，断氧化马钱子纯度为96.13％，裂环马钱素纯度为97.15％，4，5-二咖啡酰奎宁酸纯度为98.14％，各化合物纯度均大于95％。

实施例3

一种从山银花中制备8种单体的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)药材粉碎：取山银花药材，用粉碎机粉碎至60目；

(2)超声波辅助提取：山银花药材粉末加入40倍量纯化水(g/ml)，超声提取0.5h，提取完成后，过滤，得提取液；

(3)大孔树脂分离纯化：将提取液上预处理过的hpd-100大孔树脂柱，先用水洗脱，再用体积分数为40％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液50～70℃减压浓缩得粗品；

(4)动态轴向压缩柱填装：取色谱填料unisilnh210-120400g，用无水乙醇匀浆，调整填装压力，将匀浆液倒入动态轴向压缩柱，排除匀浆液后压实填料至填装规格为50mm×250mm，完成动态轴向压缩柱填装；

(5)动态轴向压缩柱分离：完成动态轴向压缩柱填装后用流动相平衡至色谱基线平稳，粗品用流动相溶解配置成150mg/ml，过滤即得进样液，进样液通过工业型制备色谱分离，以体积分数45％的甲醇为流动相，流速为10ml/min，检测波长为230nm，根据不同保留时间收集目标成分，收集液经50～70℃减压浓缩、冷冻干燥即得各单体化合物。

单体化合物经hplc检测，5-咖啡酰奎宁酸纯度为96.25％，四乙酰开联番木鳖苷纯度为97.03％，开联番木鳖苷酸纯度为96.95％，绿原酸纯度为98.95％，獐牙菜苷纯度为95.56％，断氧化马钱子纯度为95.99％，裂环马钱素纯度为97.20％，4，5-二咖啡酰奎宁酸纯度为97.95％，各化合物纯度均大于95％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。