专利名称：一种鉴别金银花和山银花的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药材来源品种鉴定技术领域，具体涉及利用核糖体DNA的ITS2片段鉴别金银花和山银花药材的方法及其应用。
背景技术：
金银花(FlosLonicerae Japonica)为忍冬科植物忍冬 Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花。山银花(Flos Lonicerae)为忍冬科植物灰租毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.、红腺忍冬 Lonicera hypoglauca Miq.、华南忍冬Lonicera confusa DC.成黄褐毛忍冬 Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng 的干燥花蕾或带初开的花。金银花和山银花都是常用的名贵中药材，在临床上都有广泛的应用，具有清热解毒，疏散风热之功效，但两者在药效成分含量上不同，功效也各有侧重，而且它们的性状极为相似，用传统方法极难把二者区分开，药典中采用的性状鉴别的方法具有一定的主观性，而且必须要求药材外形完整，无损伤，可操作性不强，同时鉴别者需要有丰富的专业知识和鉴别经验。目前市场上出现了金银花和山银花混用的情况，在一定程度上影响了用药的质量和安全。针对这种情况，急需寻找一种稳定、可靠、简易地方法用于快速鉴别金银花和山银花药材或粉末。
发明内容
本发明目的是提供利用核糖体DNA的ITS2片段鉴别金银花和山银花药材的方法。由于金银花和山银花药材都是干燥的花蕾和初开的花，它们的DNA可能已经发生了一定的降解，而且金银花和山银花都含有较多的多糖，本发明提供的金银花和山银花药材DNA提取方法，可高效、快速提取金银花和山银花药材的DNA。具体包括以下步骤:取金银花、山银花药材，在基因组DNA提取前加入5%的PVP40粉末。本发明提供的金银花和山银花药材的核糖体DNA的ITS2快速PCR扩增方法主要针对其序列GC含量高的特点，可通过提高退火温度和加入5%的二甲基亚砜和2%的三甲基甘氨酸成功扩增金银花和山银花的ITS2序列。本发明提供的金银花和山银花的鉴定方法，包括PCR扩增ITS2基因。具体包括如下步骤:
(I)提取待测样品DNA，(2) PCR扩增含有核糖体DNA的ITS2序列的片段；(3)对扩增产物进行双向测序，拼接，去除序列两端的5.8S和28S基因区段，获得完整ITS2基因间隔区。本发明所用扩增引物序列为:ITS2-HF 5’ -ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’ITS2-HR 5’ -GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’
所述PCR扩增的体系为每25μ L:10 X PCR Buffer2.5 μ L, 25mmol/L Mg2+2 μ L, 2.5mmol/LdNTPs2 μ L, 2.5 μ mol/L 弓 I物各1.0 μ L，DNA模板30ng，Taq DNA聚合酶1.0U, 5%的二甲基亚砜1.0 μ L，2%的三甲基甘氨酸0.5 μ L,补灭菌双蒸水至25 μ L0所述PCR扩增的条件为94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸45s，40个循环。(4)基于K2P模型，构建待测样品的ITS2序列的NJ树，通过NJ树可以直观的鉴别金银花和山银花。本发明所述方法可应用于鉴定忍冬属植物。所述忍冬属植物优选为金银花、山银花。本发明的有益效果:(I)本发明提供的金银花药材核糖体DNA的ITS2片段制备方法可有效解决金银花药材的品种鉴定、品种改良、育种，以及种质资源的开发利用等问题。(2)本发明方法适用性广，操作简单，易于掌握，准确性高。能够成功实现对金银花和山银花药材或粉末的快速、准确鉴定。
图1为加入5%的二甲基亚砜1.0 μ L和2%的三甲基甘氨酸0.5 μ L的PCR反应体系中，金银花和山银花ITS2序列的PCR扩增电泳图；Μ为分子量标准；1、26为阴性对照；2-25为金银花；27-31为灰毡毛忍冬；32-36为黄褐毛忍冬；37_38为红腺忍冬；39_40为华南忍冬；图2为未加入5%的二甲基亚砜1.0 μ L和2%的三甲基甘氨酸0.5 μ L的PCR反应体系中，金银花和山银花ITS2序列的PCR扩增电泳图；Μ为分子量标准；1、26为阴性对照；2-25为金银花；27-31为灰毡毛忍冬；32-36为黄褐毛忍冬；37_38为红腺忍冬；39_40为华南忍冬；图3为金银花和山银花的NJ树鉴定结果图。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若为特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明所用仪器为台式高速离心机、PTC-100基因扩增仪、电泳仪、紫外凝胶成像分析系统、ΜΜ400球磨仪(德国Retsch)。本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分t匕，除另有规定外，是指溶液IOOml中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指20°C时容量的比例。实施例11、实验材料，如表I所示。表I金银花和山银花样品
权利要求
1.一种鉴别金银花和山银花的方法，包括PCR扩增ITS2核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，包括以下步骤: 1)提取样品DNA； 2)PCR扩增ITS2序列的片段； 3)对扩增产物进行拼接，获得ITS2基因间隔区； 4)构建样品的ITS2序列的NJ树。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述样品为金银花药材或山银花药材。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在提取DNA前加入样品量3%-5%的聚乙烯吡咯烷酮PVP-40粉末。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的引物为ITS2-HF5’ -ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’ ；ITS2-HR 5’ -GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的体系为每25μL:1OXPCR Buffer2.5μ L,25mmol/L Mg2+2 μ L, 2.5mmol/LdNTPs2 μ L，2.5 μ mol/L 引物各1.0 μ L，DNA模板30ng，Taq DNA聚合酶L 0U, 5%的二甲基亚砜L 0μ L，2%的三甲基甘氨酸0.5μ L，补 ddH20 至 25 μ L。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件为94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸45s，40个循环。
8.权利要求1-7任一项所述方法在鉴别忍冬属植物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述忍冬属植物为金银花、山银花。
全文摘要
本发明涉及一种鉴别金银花和山银花的方法及其应用。本发明方法包括PCR扩增ITS2核苷酸序列，包括1)提取样品DNA；2)PCR扩增含有核糖体DNA的ITS2序列的片段；3)对扩增产物进行拼接，获得完整ITS2基因间隔区；4)构建样品的ITS2序列的NJ树。本发明方法有效解决金银花药材的品种鉴定、品种改良、育种，以及种质资源的开发利用等问题；本发明方法适用性广，操作简单，易于掌握，准确性高，能够成功实现对金银花和山银花药材或粉末的快速、准确鉴定。
文档编号C12Q1/68GK103173532SQ20121037234
公开日2013年6月26日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者陈士林, 侯典云, 宋经元, 姚辉 申请人:中国医学科学院药用植物研究所, 河南科技大学