专利名称：一种检测m BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域的荧光定量PCR技术，具体涉及一种检测m BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒。
背景技术：
急性淋巴细胞性白血病(Acute lymphoblastic leukemia, ALL)是一种淋巴细胞系造血干细胞增殖异常的恶性疾病。在ALL中，Ph染色体可在20°/Γ40%成年患者和2 5%儿童患者中被检测到，该染色体是由9号染色体ABL基因5’端和22号染色体BCR基因3’端相互易位后融合形成。ALL患者BCR基因中的断裂点主要集中于BCR基因5’端上游约30kb处，即第一内含子3’端序列上，这一区域确定为两个片段一bcr2和bcr3，统称为mBCR融合基因，融合方式为ela2连接，转录成7. 5kb或7. Okb的mRNA，翻译成一种嵌合蛋白 P190。该蛋白具有较高的酪氨酸蛋白激酶活性，可以使一系列底物蛋白发生磷酸化后激活多条信号传导途径，导致细胞在无细胞因子的情况下发生过度增殖、分化和凋亡异常。ALL患者在急性起病初期，体内白血病细胞总数可达IO12以上，化疗后大部分成年患者可得到完全缓解，但在缓解初期，骨髓及外周血中均探查不到明显白细胞的存在，此时体内白血病细胞总数仍有IO7 IO9个，我们将其称为MRD (Minimal Residual Desease，微小残留病灶)。若这些MRD不能被完全清除，最终将导致白血病的复发，这也是白血病复发的根源。因此，MRD水平是判断治疗效果的关键指标，该指标的升高可作为提前预示恶性血液疾病的全面复发。过去，对ALL患者的诊断完全依赖于形态学标准，但由于细胞涂片和染色技术的优劣会直接影响对其形态的观察，观察时使用镜头倍率对细胞形态的判断也存在很大影响，而且检验人员的水平受限于经验，不可能对正常和异常细胞作出完全准确的判断，这不可避免的造成了实验室漏检、误检，因此近来已逐渐演变为依靠分子水平方法学技术作出判断。虽然采用RT-PCR (Real Time PCR，实时荧光定量聚合酶链式反应)检测m BCR融合基因能更灵敏、更特异地辅助我们做出判断，但是目前尚未有关实时荧光定量PCR方法检测m BCR融合基因的相关报道。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种检测m BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒。所述技术方案如下本发明实施例提供了一种检测m BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒，包括检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，所述检测用引物、荧光探针包括m BCR融合基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针，其中m BCR融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: I所示；m BCR融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:2所示；
m BCR融合基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO: 3所示；ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所示；ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:5所不；ABL基因Taqman突光探针如序列表中SEQ ID NO:6所示；所述cDNA第一链合成试剂含有MgCl2、逆转录酶缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、Oligo (dT) 15、AMV逆转录酶和无RNase去离子水；所述荧光定量PCR混合液含有PCR预混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、UNG 酶和无 RNase 去离子水。进一步地，所述试剂盒还包括内部阳性控制序列、内部阳性控制序列的引物和Taqman荧光探针，其中内部阳性控制序列如序列表中SEQ ID NO: 7所示；内部阳性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID N0:8所示；内部阳性控制序列的下游引物如序列表中SEQIDNO:9所示；内部阳性控制序列的Taqman突光探针如序列表中SEQ ID NO: 10所示。 进一步地，所述m BCR融合基因的Taqman荧光探针和ABL基因的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端均连接有荧光淬灭基团TAMRA，内部阳性控制序列的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团TET，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。具体地，所述内参基因ABL的核酸序列如序列表中SEQ ID NO: 11所示。具体地，所述阴性对照为去离子水；所述阳性对照为含有m BCR融合基因的总RNA样品。具体地，所述cDNA第一链合成试剂为25mmol/L MgCl24yL, IOX逆转录酶缓冲液2μ L, IOmmoI/L dNTP2 μ L，RNA 酶抑制剂 O. 5 μ L，Oligo (dT) 150· 5 μ g，AMV 逆转录酶 I. 5U 和无RNase去离子水,总体积11 μ L。具体地，所述荧光定量PCR的混合液(以反应体系终浓度表示)为1Χ的PCR预混合液(原液为 2XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、
O.2U/ μ L的Taq酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶以及无RNase去离子水。本发明试剂盒的优点和效果如下(I)敏感性高可重复敏感度为O. 01%，即10000个细胞中有一个含m BCR融合基因就可以被检测出。(2)特异性强使用特异性探针对定量分子进行识别，准确性高，同时，靶序列由引物和探针双重控制，特异性好且假阳性低。(3)简便安全操作简单、安全、自动化程度高而且防止污染。扩增和检测可以在同一管内检测，不需要开盖，不易被污染，同时扩增和检测一步完成，不需要后期处理，无需要担心放射性污染。(4)全程监控本发明实施例提供的试剂盒引入了内部阳性控制质量控制体系，对检测过程进行全程质量监控，有效避免假阳性或者假阴性。(5)快速速度快并且高通量，检测实验可在3-4小时完成。本发明的试剂盒能快速、准确的定量检测m BCR融合基因mRNA水平，有效杜绝了假阳性和假阴性的发生，用于急性淋巴细胞性白血病的诊断及治疗过程中微小残留病的监测，为急性淋巴细胞性白血病的诊断、制定治疗方案及疗效评价和预后提供了重要的检测手段。
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图IA是本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增I. OxlO6-L OxlO3拷贝的内部阳性控制序列标准品的荧光曲线图；图IB是由本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增I. OxlO6-L OxlO3拷贝的内部阳性控制序列标准品的荧光曲线图得到的标准曲线图；图2A是本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增I. OxlO6-L OxlO3拷贝的ABL标准品的荧光曲线图； 图2B是由本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增
I.OxlO6-L OxlO3拷贝的ABL标准品荧光曲线图得到的标准曲线图。
具体实施例方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。实施例I.本发明试剂盒的制备I、特异性的引物和荧光探针的设计根据基因序列(ABL基因序列、BCR基因序列来源于美国国家生物技术信息中心核酸数据库，其中ABL基因ID分别为25，参考序列号为NM005157. 4 ;BCR基因ID分别为613，参考序列号为NG009244. I)分别设计对上述各基因序列特异的引物和荧光探针。2、按照下列试剂盒的组成配制试剂盒的各组分本发明试剂盒组成如下①RNA 提取试剂Trizol 试剂(Invitrogen 公司，产品货号15596_026/100ml)，每Iml骨髓组织加入ImlTrizol快速提取白血病患者骨髓组织RNA。②cDNA 第一链合成试剂盒(RT-PCR)(Fermentas 公司，产品货号K1622):25mmol/LMgCl24 μ L，IOX 逆转录酶缓冲液 2 μ L，IOmmoI/L dNTP2 μ L, RNA 酶抑制剂(RNasin，一种酸性糖蛋白)O. 5 μ L, Oligo (dT) 150. 5 μ g, AMV逆转录酶I. 5U和无RNase去离子水,总体积11 μ Lo③引物、探针和标准品包括m BCR融合基因引物、内部阳性控制序列引物、内参基因ABL引物以及与引物对应的Taqman荧光探针，具体如下m BCR融合基因上游引物序列为5’ -CGCAAGACCGGGCAGAT-3’(序列表中序列I)；mBCR融合基因下游引物序列为5’ -AACGAGCGGCTTCACTCAGA-3’(序列表中序列2)；m BCR 融合基因 Taqman 荧光探针FAM5’ -ACGATGGCGAGGGC-TAMRA3’ TAMRA (序列表中序列3)；内部阳性控制序列为5’ -CGCAAGACCGGGGACAUCUGGCCCAACGAUGCGGAGGGCGCCUUCCAUGGAGACGCAGAAGCCCUUCAGCGGCCAGUAGCAUCUGACUUUGAGCCUCAGG ⑶⑶ CA ⑶ GAAGCCGCUC ⑶ U-3’(序列表中序列7)；内部阳性控制序列上游引物序列为5’ -CGCAAGACCGGGGACAT-3’(序列表中序列8)；内部阳性控制序列下游引物序列为5’ -AACGAGCGGCTTCACTGACA-3’(序列表中序列9)；内部阳性控制序列Taqman荧光探针TET5’ -ACGATGCGGAGGGC-3’ TAMRA (序列表中序列10)；ABL 基因序列为5，-CAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATCACGCCAGTCAACAGTCTGGAGAAACACTCCTGGTACCATGGGCCTGTGTCC CGCAATGCCGCTGAGTATCTGCTGAGCAGCGGGATCAATGGCAGCTTCTTGGTGCGTGAGAGTGAGAGCAGTCCTGGC-3’(序列表中序列11);ABL基因上游引物序列为5’ -CCGGGTCTTAGGCTATAATCACA-3，(序列表中序列4)；ABL基因下游引物序列为5’ -GCCTTGGCCATTTTTGGTT-3’(序列表中序列5)；ABL 基因 Taqman 荧光探针FAM5’ -TGGTGTGAAGCCC-3’ TAMRA (序列表中序列 6)；其中，内部阳性控制序列为人工合成序列，包含一部分已知的mBCR融合基因序列和一部分人工合成序列；内部阳性控制序列和ABL基因序列分别用作标准品。上述引物序列、控制序列、基因序列和Taqman荧光探针序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。④阴性对照和阳性对照以去离子水为阴性对照，以含有mBCR融合基因的总RNA样品为阳性对照，采用上述实施例I中提供的本发明试剂盒组成①RNA提取试剂=Trizol试剂(Invitrogen公司，产品货号15596-026/100ml),按每Iml骨髓组织加入Iml Trizol试剂的比例，快速提取已经确诊的含有m BCR融合基因的急性淋巴细胞性白血病患者的骨髓组织RNA，作为阳性对照。⑤m BCR融合基因荧光定量PCR反应液由荧光定量PCR混合液和检测m BCR融合基因的引物、探针组成I X的PCR预混合液(Qiagen公司，产品货号210212，2 XPCRPremix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/μ L的Taq酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶、O. 25pmol/μ L的m BCR融合基因上游引物(序列表中序列1)、0· 25pmol/y L的m BCR融合基因下游引物(序列表中序列2)、0· 3pmol/y L的m BCR融合基因Taqman荧光探针(序列表中序列3)、0. 25pmol/yL的内部阳性控制序列上游引物(序列表中序列8)、0. 25pmol/yL的内部阳性控制序列下游引物(序列表中序列9)、O. 3pmol/yL的内部阳性控制序列Taqman荧光探针(序列表中序列10)(以上所有的浓度都是指PCR反应体系的终浓度)。通常取1-2 μ L的模板(包括被测样品RNA反转录合成的cDNA和内部阳性控制序列RNA反转录合成的cDNA)，其余为无RNase去离子水，反应总体积通常为20 μ L0⑥ABL内参基因荧光定量PCR反应液由荧光定量PCR混合液和检测ABL内参基因的引物、探针组成=IX的PCR预混合液(Qiagen公司，产品货号210212, 2XPCRPremix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/μ L 的 Taq 酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶、O. 25pmol/y L的ABL内参基因上游引物(序列表中序列4)、O. 25pmol/ μ L的ABL内参基因下游引物(序列表中序列5)、0· 3pmol/ μ L的ABL基因Taqman荧光探针(序列表中序列6)(以上所有的浓度都是指PCR反应体系的终浓度)。检测时，力口入ABL基因标准品模板2 μ L,其余为无RNase去离子水,反应总体积通常为20 μ L。⑦内部阳性控制序列荧光定量PCR反应液由荧光定量PCR混合液和检测内部阳性控制序列的引物、探针组成ix的PCR预混合液(Qiagen公司，产品货号=210212,2 XPCRPremix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的Taq酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶、O. 25pmol/yL的内部阳性控制序列上游引物(序列表中序列8)、0· 25pmol/yL的内部阳性控制序列下游引物(序列表中序列9)、0· 3pmol/yL的内部阳性控制序列Taqman荧光探针(序列表中序列10)(以上所有的浓度都是指PCR反应体系的终浓度)。检测时，通常取1-2 μ L的模板(内部阳性控制序列RNA反转录合成的cDNA)，其余为无RNase去离子水,反应总体积通常为20 μ L。3、PCR扩增程序的设定在Iightcycler仪器上先经过50°C 10s, 95°C IOmin,然后再经过95°C 15s，60°C lmin，共40个循环。实施例2.用实施例I制备的试剂盒检测m BCR融合基因mRNA的表达量以检测30例急性淋巴细胞性白血病患者骨髓组织标本结果为例。用实施例I提供的本发明的试剂盒检测m BCR融合基因mRNA表达量的检测流程为首先根据基因序列设计特异性的引物和荧光探针。其次获取临床白血病患者骨髓组织样本，快速提取组织RNA，进行逆转录PCR合成cDNA第一链；先配制ABL内参基因和内部阳性控制序列的荧光定量PCR反应液，将内部阳性控制序列标准品和ABL标准品分别稀释至拷贝数/mL为I. OxlO3U. OxlO4U. OxlO5和I. OxlO6，分别制作内部阳性控制序列标准品标准曲线(如图IA和图IB所不)和ABL基因标准品标准曲线(如图2A和图2B所不)，然后再配制m BCR融合基因荧光定量PCR反应液，进行荧光定量PCR检测样品，在荧光定量PCR仪数据分析系统中读出CT值结果。PCR扩增结束后，首先分析内部阳性控制序列扩增结果，如果其Ct值小于33，提示整个检测过程有效，如果其Ct值大于35，提示检测失败，则需要重新进行检测，如果其Ct值位于33 35之间，需要重复检测。当内部阳性控制序列Ct值小于33时，将实时荧光定量PCR所得数据进行计算，分别计算m BCR融合基因及ABL基因的Ct值，两者之差即为ACt值。最后，荧光定量PCR结果采用软件分析，并标化计算样本数据。具体步骤如下·
①急性淋巴细胞性白血病骨髓组织总RNA的抽提按RNA抽提纯化的方法抽提急性淋巴细胞性白血病骨髓组织样品的总RNA。提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，通过紫外分光光度计测定260nm与280nm光密度值计算RNA的纯度与浓度，用O. 1% DEPC处理的水调节抽提的各样品RNA至相同浓度。②反转录合成cDNA :取2 μ L上述RNA提取液，在70°C保温lOmin，随后加入实施例I提供的本发明试剂盒组成②cDNA第一链合成试剂盒，即25mmol/L MgCl24yL, IOX逆转录酶缓冲液 2 μ L，IOmmoI/L dNTPs2 μ L, RNA 酶抑制剂 O. 5 μ L, Oligo (dT) 150· 5 μ g 和 AMV逆转录酶I. 5U,补加无RNase去离子水至总体积20 μ L,于42°C保温15min,进行逆转录反应，合成cDNA第一链。反应结束后，加热至99°C，5min以灭活逆转录酶，加20 μ L无菌水混匀置冰箱_20°C保存。
取I μ L浓度为2 μ g/ml内部阳性控制序列RNA(序列表中序列7)，在70°C保温IOmin,随后加入实施例I提供的本发明试剂盒组成②cDNA第一链合成试剂盒，即25mmol/L MgCl24y L，IOX 逆转录酶缓冲液 2μ L，10mmol/L dNTPs2 μ L，RNA 酶抑制剂 O. 5 μ L，Oligo (dT) 150· 5 μ g和AMV逆转录酶I. 5U，补加无RNase去离子水至总体积20 μ L，于42°C保温15min,进行逆转录反应,合成cDNA。反应结束后,加热至99°C, 5min以灭活逆转录酶，加20 μ L无菌水混匀置冰箱_20°C保存。取I μ L浓度为2 μ g/ml的阳性对照RNA，在70°C保温lOmin，随后加入实施例I提供的本发明试剂盒组成②cDNA第一链合成试剂盒，即25mmol/L MgCl24 μ L, 10 X逆转录酶缓冲液 2 μ L，IOmmoI/L dNTPs2 μ L, RNA 酶抑制剂 O. 5 μ L, Oligo (dT) 150· 5 μ g 和 AMV 逆转录酶I. 5U,补加无RNase去离子水至总体积20 μ L,于42°C保温15min,进行逆转录反应,合成cDNA。反应结束后，加热至99°C，5min以灭活逆转录酶，加20 μ L无菌水混匀置冰箱_20°C保存。③将内部阳性控制基因序列标准品和ABL标准品分别稀释至拷贝数/mL为I. OxlO3U. OxlO4U. OxlO5和l.OxlO6，用实施例I提供的内部阳性控制序列和ABL内参基·因的荧光定量PCR反应液，分别制作内部阳性控制序列标准品标准曲线(如图IA和图IB所示)和ABL标准品标准曲线(如图2A和图2B所示)。④m BCR融合基因荧光定量PCR扩增PCR反应体系为20 μ L :含I X PCR预混合液(Qiagen 公司，产品货号:210212, 2 XPCR Premix) 10. O μ L, 2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，m BCR融合基因上、下游引物终浓度均为0.2 μ mol/L，m BCR融合基因Taqman荧光探针终浓度0. 3ymol/L，被测样品RNA反转录合成的cDNAl. 0μ L，同时加入内部阳性控制序列的引物终浓度为0. 2 μ mol/L,内部阳性控制序列的Taqman荧光探针终浓度0. 3 μ mol/L,终浓度为0. 2ymol/L的内部阳性控制序列RNA反转录合成的cDNA (②中反转录合成的cDNA)，加入超纯水至总体积20 μ L。在Iightcycler荧光定量PCR仪上反应扩增条件95°C IOmin预变性，然后95°C 15s,60°C Imin扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号。⑤ABL内参基因荧光定量PCR扩增PCR反应体系为20 μ L :含2XPCR混合液(Qiagen 公司，产品货号:210212, 2XPCR Premix) 10. O μ L, 2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，ABL 基因上、下游引物终浓度均为0. 2 μ mol/L, ABL基因的Taqman荧光探针终浓度0. 2 μ mol/L, ABL基因cDNAl. O μ L,加入无RNase去离子水补至总体积20 μ L。在Iightcycler突光定量PCR仪上反应扩增条件为95°C IOmin预变性，然后95°C 15s, 60°C Imin扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号。⑥阳性对照、阴性对照荧光定量PCR扩增PCR反应体系为20 μ L :含2XPCR混合液(Qiagen公司，产品货号:210212, 2XPCR Premix)10. O μ L, 2. 5-4. OmM的Mg2+、0. 2-0. 4mM的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，m BCR融合基因上、下游引物终浓度均为0.2 μ mol/L，m BCR融合基因Taqman荧光探针终浓度0. 3 μ mol/L,阳性对照RNA反转录合成的cDNAl. OyL或者阴性对照去离子水I. O μ L，加入无RNase去离子水补至总体积20 μ L。在Iightcycler荧光定量PCR仪上反应扩增条件为95°C IOmin预变性，然后95°C 15s，60°C Imin扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集突光信号。⑦数据收集处理和分析PCR扩增结束后，首先分析内部阳性控制序列扩增结果，如果其Ct值小于33，提示整个检测过程有效，如果其Ct值大于35，则需要重新进行检测。当内部阳性控制序列Ct值小于33时，将实时荧光定量PCR所得数据进行计算，得出m BCR融合基因相对于ABL内参基因的相对表达量后再进行统计分析，以比值大于或等于O. 0001为阳性表达，小于O. 0001为阴性表达(具体参见表I)表I为荧光定量PCR分析m BCR融合基因在急性淋巴细胞性白血病患者骨髓中的表达
样品m BCR模板ABL模板m BCR/ABL
急性淋巴细胞性白血病 77589913188234770.02434
急性淋巴细胞性白血病 77182841515002300.05095
急性淋巴细胞性白血病 9127882785574990.00328
急性淋巴细胞性白血病 280222781246650.00010
急性淋巴细胞性白血病 5512432167557740.00254
急性淋巴细胞性白血病 277483166570720.00009
急性淋巴细胞性白血病 670133126655020.00021
急性淋巴细胞性白血病 145512172547520.00007
急性淋巴细胞性白血病 917243317255480.00028
急性淋巴细胞性白血病 6125413132543640.00196
急性淋巴细胞性白血病 1525142447182750.00062
急性淋巴细胞性白血病 71954623017276410.02385
急性淋巴细胞性白血病 66127452124856130.03112
急性淋巴细胞性白血病 126648613018285910.04196
急性淋巴细胞性白血病 2646613018577800.00088
急性淋巴细胞性白血病 277126353077641860.09005
急性淋巴细胞性白血病 1273562081775830.0006权利要求
1.一种检测m BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒，包括检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，其特征在于，所述检测用引物、荧光探针包括m BCR融合基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针，其中 m BCR融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: I所示； m BCR融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:2所示； m BCR融合基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO: 3所示； ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所不； ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 5所不； ABL基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:6所示； 所述cDNA第一链合成试剂含有MgCl2、逆转录酶缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、Oligo (dT) 15、AMV逆转录酶和无RNase去离子水；所述荧光定量PCR混合液含有PCR预混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、UNG 酶和无 RNase 去离子水。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内部阳性控制序列、内部阳性控制序列的引物和Taqman荧光探针，其中内部阳性控制序列如序列表中SEQ IDN0:7所示；内部阳性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID N0:8所示；内部阳性控制序列的下游引物如序列表中SEQ ID N0:9所示；内部阳性控制序列的Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO: 10所示。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述mBCR融合基因的Taqman荧光探针和ABL基因的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端均连接有荧光淬灭基团TAMRA，内部阳性控制序列的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团TET，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。
4.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述内参基因ABL的核酸序列如序列表中 SEQ ID NO: 11 所示。
5.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为去离子水；所述阳性对照为含有m BCR融合基因的总RNA样品。
6.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述cDNA第一链合成试剂为25mmol/LMgC 124 μ L，10 X 逆转录酶缓冲液 2 μ L，IOmmoI/L dNTP2 μ L, RNA 酶抑制剂 O. 5 μ L,Oligo (dT) 150. 5 μ g, AMV逆转录酶I. 5U和无RNase去离子水,总体积11 μ L。
7.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR的混合液为1X的PCR 预混合液、2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq酶、O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶和无RNase去离子水。
全文摘要
本发明涉及一种检测m BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒，属于生物技术领域。所述试剂盒包括检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，所述检测用引物、荧光探针包括m BCR融合基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针。m BCR融合基因是急性淋巴细胞性白血病(ALL)的分子标志物，其定量mRNA的表达量是目前诊断ALL最为敏感的方法，通过对治疗前该基因的检测，可以对该疾病预后作出判断。因此，采用敏感性及特异性均较高的荧光定量PCR检测m BCRmRNA水平，其检测结果的特异性和敏感度均显著提高，为临床ALL患者制定治疗方案以及预测预后提供了一种全新的快速简便的基因诊断技术。
文档编号C12Q1/68GK102925556SQ201210372120
公开日2013年2月13日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者童永清, 李艳 申请人:童永清, 李艳