专利名称：一种半乳糖凝集素-3结合蛋白及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种半乳糖凝集素-3结合蛋白及其制备和应用。
背景技术：
半乳糖凝集素_3结合蛋白(galectin-3 binding protein, G3BP)是一种分泌至胞外的糖蛋白，它能够结合半乳糖凝集素-3 (galectin-3)以及其它胞外蛋白，如胶原蛋白 (collagen)、纤维连接蛋白(fibronectin)、β I整合蛋白(β I integrins)等。目前研究最多的是人类G3BP,发现它在分子结构上含有一个清道夫受体(Scavenger receptor)功能域，该功能域与靶分子结合有关。人类G3BP在免疫组织和细胞中表达，并且在病毒感染以及某些癌症病人血清中表达上调，因此可能参与机体的免疫抵抗、炎症反应、肿瘤发生等过程。迄今G3BP只在两种鱼类(斑马鱼和大西洋鲑)中发现，但其功能则完全未知。发明内容
本发明目的在于提供一种半乳糖凝集素_3结合蛋白及其制备和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为
—种半乳糖凝集素_3结合蛋白，半乳糖凝集素-3结合蛋白为序列表SEQ ID No. I 中的氨基酸序列所示。
半乳糖凝集素_3结合蛋白的制备，
I)质粒 pETG3BP 的构建
以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物FI和Rl进行PCR扩增，PCR产物纯化后与 T-Simple连接,连接混合液转化大肠杆菌后在含安卡青霉素、Xgal、异丙基-β -D-硫代半乳糖苷的LB培养基上培养2 - 8h,筛选转化子提取质粒，得重组质粒pTSG3BP ；
将pTSG3BP用Sma I酶切，回收I. 6kb片段，连接于pET259，连接液转化入大肠杆菌，在含卡那霉素的LB培养基上培养18 - 24小时，筛选转化子提取质粒，即为pETG3BP ；
2)半乳糖凝集素-3结合蛋白的制备
将上述步骤I)的质粒pETG3BP转化BL21 (DE3)，在含有卡那霉素的LB培养基上培养，筛选转化子即为BL21/pETG3BP ;将BL21/pETG3BP用终浓度为ImM的异丙基-β -D-硫代半乳糖苷诱导表达后，采用亲和层析柱纯化重组蛋白，即为序列表SEQ ID No. I中的氨基酸序列所示的半乳糖凝集素_3结合蛋白。
所述步骤I)中 Fl 为 5’ -CCCGGGGCCACCATGGCTTTTACATTTGACCTGTTC -3’ ；R1 为 5 ，-CCCGGGGACTCGGACGTACACTGGTCT-3’。
半乳糖凝集素-3结合蛋白的应用，所述半乳糖凝集素-3结合蛋白能够结合细菌， 继而作为细囷的抑制剂。
所述半乳糖凝集素_3结合蛋白能够结合革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。
所述革兰氏阴性细菌为突光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、大肠杆菌(Escherichia coli)或獲弧菌(Vibrio anguillarum);革兰氏阳性细菌为海豚链球菌(Streptococcus iniae)或枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)。
本发明具有如下优点本发明的半乳糖凝集素_3结合蛋白能够与多种革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌显著性结合。本发明所得自半滑舌鳎中克隆获得了 G3BP，其与多种细菌具有显著性结合能力，本发明乳糖凝集素-3结合蛋白能够与多种革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌显著性结合；因此该蛋白具有在抗细菌感染中应用的潜能。
图I为本发明实施例提供的纯化得到的半乳糖凝集素_3结合蛋白电泳图谱(其中，纯化得到的半乳糖凝集素_3结合蛋白为泳道2 ;泳道I :分子量marker)。
图2为本发明实施例提供的半乳糖凝集素_3结合蛋白与各种细菌的结合能力检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法
I.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技 (北京)有限公司”的相应试剂盒。
2.大肠杆菌用 Hanahan 方法(Sambrook and Russell :Molecular Cloning: A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press2001)；酵母转化按 Invitrogen公司的方法(Catalog no. V175-20);聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS — PAGE)按照 Sambrook and Russell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press2001o
3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。
实施例I
本发明的半乳糖凝集素_3结合蛋白为序列表SEQ ID No. I中的氨基酸序列。
序列表SEQ ID No. I 为:
MQTHQNFCRIWVLLLLLHVADGAFTFDLFENIAAPKE⑶VRLAGSRSSSEGRVEVYHDGRWGTVCDDGW DIAEAQVVCRQLRFSGAKGVQVGQPYGEATGPIWMDDMICQGTEKHLLNCAFKSWGVTDCTHKEDVGIICENNDNNS KNAIYSLDHSFSLSDELGQLFDSEVGCDFLIILRSPTGHRFEYETEEMICAHKMILLLVPRFNASQGVSNITVDISQ SCKPYFPTFLRYIYTRQIDVDLSSIHCLHWMASMFEVKHLMEGTARLFSEVLPEDTLFHTQVSIYNYAVETEDLVLQ ENCLQYLSffNFQNLTNSPAffPDISVKLLRAILVRSDLVVPNEYFVLQSVENWITDKDEAISLEDQALILNCLRFPMI PVEKLYVLETNSSLYNNHSKLYSEKILKAFQFNVLLFSDLLTNPKFDREERDYHPRLYVDYPWSVTISPSYSSRSLS TPSHNSLIFRSKTINWEANIYRSHYDCSNRRLQCKSLPMARLASHSHYHGNNIVYQNQLLLSCQGKYICHIQDFKSD LAYVTKNATHGLTYPCPDSQYTYQFVVRPVYVRV
(a)序列特征
长度565
类型氨基酸序列
籲链型单链
拓扑结构线性
(b)分子类型蛋白质
(C)假设否
(d)反义否
( e )最初来源半滑舌鳎
结构特点该蛋白含有一个清道夫受体功能域(由氨基酸40 - 140组成)。
实施例2
半乳糖凝集素-3结合蛋白G3BP的制备方法
I)质粒 pETG3BP 的构建
以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增。PCR条件为 94 V 60s预变性模板DNA，然后94 °C 40s, 60 V 60s, 72 V 60s, 5个循环后改为 940C 40s, 650C 60s, 72°C 60s, 30个循环后再在72°C延伸反应7 — IOmin0 PCR产物用天根的PCR产物纯化试剂盒纯化后与质粒T-Simple (购于北京全式金生物技术有限公司) 于室温连接2 - 8小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5 α后在含安卡青霉素(100ug/ml)、 Xgal (40ug/ml)、异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(24ug/ml)的LB培养基上培养18 — 24小时，筛选转化子提取质粒，得重组质粒PTSG3BP。
将pTSG3BP用Sma I酶切，回收L 6kb片段。将表达载体pET259(pET259构建过程 #JAL Zheng, ff. J. , Hu, Y. H. , Sun, L. , 2010. Cloning and analysis of a ferritin subunit from turbot(Scophthalmus maximus). Fish. Shellfish. Immunol. 28，829-836)用Swa I酶切后回收5. 4kb片段，将其与回收的I. 6kb片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌DH5 α，在含卡那霉素(30ug/ml)的LB培养基上培养18 — 24小时，筛选转化子提取质粒，即为pETG3BP。
所述LB组成成分按重量百分比计1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，I. O %氯化钠，97. 5%蒸馏水。所述 Fl 为 5’ -CCCGGGGCCACCATGGCTTTTACATTTGACCTGTTC-3’ ；R1 为 5’ -CCCGGGGACTCGGACGTACACTGGTCT-3，。
2)重组半乳糖凝集素_3结合蛋白G3BP的表达和制备
将步骤I)的质粒pETG3BP转化BL21 (DE3)(购于“天根生化科技(北京)有限公司”)，在含有卡那霉素(30ug/ml)的LB培养基上培养，筛选转化子即为BL21/pETG3BP。 将BL21/pETG3BP在含有卡那霉素的LB培养基中于37 °C培养至OD6tltl为0. 6，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷使其终浓度达到lmM，37°C继续摇动培养4-5小时，而后用GE Healthcare (美国)公司的 Ni-NTA 金属亲和层析填料(nickel-nitrilotriacetic acid) 亲和层析柱纯化重组蛋白(层析条件用4 - 5ml洗涤液洗柱两次，随后用0. 5 - Iml洗脱缓冲液洗柱，收集所有洗脱液)。将重组蛋白用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS - PAGE)分析，发现其分子量与表SEQ ID No. I中序列的G3BP分子量一致(参见图I)。
上述洗涤液成分为50mMNaH2PO4, 300mM NaCl, 20mM imidazole, pH8. 0;上述洗脱缓冲液成分为50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 250mM imidazole, pH8. 0.
实施例3
半乳糖凝集素-3结合蛋白G3BP的细菌结合作用
I)细菌悬液制备。在LB培养基中分别培养革兰氏阴性细菌荧光假单胞菌 (Pseudomonas fluorescens)(保存于 CGMCC，保藏日期 2008 年 I 月 9 日，编号为 CGMCC 2329)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)(保存于CGMCC，保藏日期2008年I月9日， 编号为CGMCC 2330)、大肠杆菌(Escherichia coli) (DH5a ,购于“天根生化科技(北京) 有限公司”)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)(保存于CGMCC，保藏日期2012年6月21日，编号为CGMCC 6250，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号)以及革兰氏阳性细菌海豚链球菌(Str印tococcus iniae)(保存于CGMCC，编号为CGMCC1984，保藏日2007年3月22)和枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)(购买自 CGMCC，编号为 CGMCC I. 460)至 0D_ 为 0. 8，离心(5000g， 4° C离心IOmin)收集菌体，重新悬于包被液(包被液为O. 159% Na2CO3, 0. 293% NaHCO3, pH9.6)至 108CFU/ml。
2)酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)。将 96 孔 ELISA板用包被液处理lh，随后用PBS洗三次。将上述步骤I)的各种细菌悬液加入ELISA 板(每孔100ul)。将ELISA板于4°C保温15h，每孔加入200ul3%(重量/体积比)的脱脂奶粉，于37°C保温lh。将ELISA板用PBS洗三次，随后每孔加入IOOul上述实施例2步骤2) 制备的半乳糖凝集素-3结合蛋白G3BP或者PBS (对照)。将ELISA板用PBS洗三次，随后每孔加入IOOul鼠抗His抗体(购于“天根生化科技(北京)有限公司”)，于37°C保温lh。 将ELISA板用PBS洗三次，随后每孔加入IOOul羊抗鼠IgG — HRP抗体(购于“天根生化科技(北京)有限公司”)，于37°C保温lh。将ELISA板用PBS洗三次，用TMB试剂盒(购于北京“天根生化科技有限公司”)显色，随后在450nm测定吸光值。半乳糖凝集素_3结合蛋白 G3BP与细菌的结合指数(Binding index)计算如下=ELISA反应中含有G3BP的细菌的吸光值/含有PBS的细菌的吸光值。通常Binding index大于2即被认为是有意义的(positive reading)。
结果表明，半乳糖凝集素_3结合蛋白G3BP与所检测的细菌的Binding index皆大于5(参见图2)，说明G3BP能够与多种革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌发生显著结合。 因此G3BP可望在细菌性疾病的防控中应用。
所述PBS组成成分按重量百分比计0. 8 % NaCl, 0. 02 % KCl, 0. 358 % Na2HPO4. 12H20, 0. 024% NaH2PO4,余量为水。
权利要求
1.一种半乳糖凝集素-3结合蛋白，其特征在于半乳糖凝集素-3结合蛋白为序列表 SEQ ID No. I中的氨基酸序列所示。
2.—种权利要求I所述半乳糖凝集素_3结合蛋白的制备，其特征在于1)质粒PETG3BP的构建以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增，PCR产物纯化后与T-Simple 连接，连接混合液转化大肠杆菌后在含安卡青霉素、Xgal、异丙基-β -D-硫代半乳糖苷的 LB培养基上培养2 - 8h,筛选转化子提取质粒，得重组质粒pTSG3BP ；将pTSG3BP用Sma I酶切，回收I. 6kb片段，连接于pET259，连接液转化入大肠杆菌，在含卡那霉素的LB培养基上培养18 - 24小时，筛选转化子提取质粒，即为pETG3BP ；2)半乳糖凝集素_3结合蛋白的制备将上述步骤I)的质粒PETG3BP转化BL21 (DE3)，在含有卡那霉素的LB培养基上培养， 筛选转化子即为BL21/pETG3BP ;将BL21/pETG3BP用终浓度为ImM的异丙基-β -D-硫代半乳糖苷诱导表达后，采用亲和层析柱纯化重组蛋白，即为序列表SEQ ID No. I中的氨基酸序列所示的半乳糖凝集素_3结合蛋白。
3.按权利要求2所述的半乳糖凝集素-3结合蛋白的制备，其特征在于所述步骤I)中 Fl 为 5’-CCCGGGGCCACCATGGCTTTTACATTTGACCTGTTC-3’；R1 为 5’-CCCGGGGACTCGGACGTACAC TGGTCT 3，。
4.一种权利要求I所述的半乳糖凝集素_3结合蛋白的应用，其特征在于所述半乳糖凝集素_3结合蛋白能够结合细菌，继而作为细菌的抑制剂。
5.按权利要求4所述的半乳糖凝集素-3结合蛋白的应用，其特征在于所述半乳糖凝集素_3结合蛋白能够结合革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。
6.按权利要求5所述的半乳糖凝集素-3结合蛋白的应用，其特征在于所述革兰氏阴性细菌为突光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、大肠杆菌(Escherichia coli)或鳗弧菌(Vibrio anguillarum);革兰氏阳性细菌为海豚链球菌(Streptococcus iniae)或枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)。
全文摘要
本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种半乳糖凝集素-3结合蛋白及其制备和应用。半乳糖凝集素-3结合蛋白为序列表SEQ I D No.1中的氨基酸序列所示。制备方法以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，PCR产物连接表达载体后得质粒pETG3BP，将其转化BL21DE3)，获得转化子BL21/pETG3BP，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导后，利用亲和层析柱纯化重组蛋白，即为半乳糖凝集素-3结合蛋白。所述半乳糖凝集素-3结合蛋白具有显著的结合多种细菌的能力。
文档编号C12N15/70GK102942624SQ201210371948
公开日2013年2月27日 申请日期2012年9月28日 优先权日2012年9月28日
发明者孙黎, 陈骋 申请人:中国科学院海洋研究所