专利名称：基于生物芯片的检测核酸降解组mRNA的通用探针方法
技术领域：
本发明具体涉及一种用于核酸降解组检测的通用探针检测方法，属于核酸分子检测技术领域，
背景技术：
内源性非编码小RNA (small non-protein-coding RNA, 12_24nt,简称“小 RNA”)广泛存在于高等和低等生物体内，通过对靶基因mRNA直接切除或抑制其翻译在转录及转录后水平对基因表达起调节作用。已知的小RNA主要分为两大类:一类是微小RNAUiRNA，microRNA), 一类是小干扰 RNA (siRNA, small interfering RNA)。参阅图1,植物 miRNA、siRNA以及部分动物miRNA、siRNA主要通过与靶基因mRNA进行完全或近乎完全的配对形成沉默复合体RISC (RNA-1nduced silencing complex),从而降解祀基因mRNA并调控其表达，且大量实验数据表明小分子RNA介导的靶基因断裂发生在与mRNA的互补区，主要发生在对应小分子RNA序列5’端的第十、十一位之间。常规的靶基因查找主要采用生物信息学方法在全基因组水平上进行预测和筛选。由于预测方法无法区分预测靶基因的真伪，所有预测结果必须经实验证实，因此仍需采用各种体内外的实验手段,如Northern杂交、改良
5’RACE法(modified 5’-rapid amplification of cDNA ends),对预测的祀基因进行--
验证。这不仅费时耗力，还大大地影响了标靶基因的探索效率。近二十多年来,基于高通量分析的系统生物学(system biology)研究飞速发展，各种“组学(omics)”研究不断拓展。如今科学家们能够借助各种检测手段把传统的生物学研究从小规模、低效率模式提升至大规模并且精确高效的阶段。针对上述的小分子RNA靶基因检测，2008年出现了一种降解组测序(degradome sequencing)的检测方法,也被称之为RNA末端平行分析 法(parallel analysis of RNA ends)。它采用高通量测序技术,对小分子RNA介导的靶基因mRNA剪切降解片段进行深度测序分析，从结果中筛选小分子RNA作用的靶基因，并结合生物信息学分析，确定降解片段与小分子RNA精确的配对信息。该方法与其它传统实验方法相比，可信度和检测通量都得到了提高。但如今测序成本较高，由于不同组织中小分子RNA表达不一样，其靶基因mRNA的降解情况也不一样，如对多种样品进行检测则价格昂贵。另外，现在的高通量测序获得的片段较短，序列需进行多次拼接，容易引入错误。此外，已经发展出的多种小分子RNA靶基因预测方法，测序不能对这些方法的预测结果进行一一验证，容易造成靶基因检测的遗漏，大大降低了降解组测序的性价比。常规的mRNA表达谱芯片能够获得不同组织中各个基因mRNA的表达情况，因此也能获得生物信息学预测的小分子RNA靶基因的表达情况，并且也有一些实验室采用表达谱芯片来初步筛选小分子RNA的靶基因。但表达谱芯片获得的mRNA表达情况并不一定与小分子RNA介导的靶基因mRNA降解相关，其表达也可能受到其它途径的调控，因此通过表达谱芯片筛选的小分子RNA靶基因仍然无法区分真伪，仍需要采用低通量的实验手段进行验证，也不是高通量鉴定小分子RNA介导的靶基因mRNA降解的理想方法。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种基于生物芯片的检测核酸降解组mRNA的通用探针方法。为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案:
一种基于生物芯片的检测核酸降解组mRNA的通用探针方法，包括如下步骤:
1)采用生物信息学方法，预测可能被小分子RNA降解的目标核酸降解组mRNA；
2)提供检测探针，所述检测探针的一部分核酸序列与通用报告探针互补，另一部分核酸序列至少与所述目标核酸降解组mRNA断裂处部分的核酸序列互补；
3)将所述检测探针固定在生物芯片基质上，形成生物芯片；
4)将待检测样本的RNA和通用报告探针一起混入杂交液中与所述生物芯片杂交；
5)洗涤杂交后的生物芯片，检测杂交结果。作为优选的方案之一，所述检测探针长度为18-42mer，其中与通用报告探针互补部分的核酸序列长度为3-12mer，与核酸降解组mRNA的断裂处互补部分的核酸序列长度为15_30mero作为优选的方案之一，所述检测探针中与通用报告探针互补的一部分核酸序列紧邻与所述目标核酸降解组mRNA的断裂处互补的另一部分核酸序列。进一步的，该方法中对应于每一目标核酸降解组mRNA设计有一组探针池，每一组探针池包括复数个检测探针，其中每个检测探针对应每一目标核酸降解组mRNA的一个可能的断裂位点。作为优选的方案之一,每一组探针池包括20个以上检测探针。进一步的，所述检测探针通过原位合成和/或化学键连接方式固定在生物芯片基质上，所述化学键连接方式至少选自氨基-醛基反应、静电吸附和共价交联中的任意一种。进一步的，所述检测探针与生物芯片基质连接的一端(3’或5’端)修饰有氨基、巯
基、羧基或生物素。进一步的，所述通用报告探针至少选自DNA、RNA、PNA (肽核酸)和LNA (lockednucleic acids)中的任意一种。进一步的，所述通用报告探针远离与检测探针互补一端修饰有用于指示通用报告探针与检测探针反应与否的标记分子，例如，本领域技术人员习知的生物素、地高辛、荧光标记、量子点、金颗粒、纳米颗粒等。进一步的，所述待检测样本RNA至少选自总RNA样品和富集小RNA样品中的任意一种。与现有技术相比，本发明的优点在于:能够高通量的检测小分子RNA介导的靶基因mRNA降解产物，可对已被生物信息学预测到的大量靶基因进行验证，且操作简便，非专业人员也可操作，利于推广，价格低廉，是一种高性价比的用于小分子RNA靶基因降解片段的检测方法。
图1是miRNA降解靶基因mRNA的原理 图2是本发明基于生物芯片的检测核酸降解组mRNA的通用探针方法的工艺流程图；图3是本发明实施例1中ptr-miR159f的靶基因XM_002297667的检测结果。
具体实施例方式本发明旨在提供一种高通量、低成本的用于小分子RNA靶基因降解片段检测的通用探针检测方法。进一步的讲，本发明的技术方案包括:提供一种基于碱基堆积杂交的用于核酸降解组检测的通用探针检测方法，其通过将被小分子RNA降解的核酸mRNA的可能断裂位点放在碱基堆积作用处，检测不同断裂位点的检测探针的荧光信号，只有当检测探针中的通用报告探针序列与断裂位点紧邻的情况下，通用报告探针才与该检测探针发生杂交，即能检测到降解核酸断裂位点的准确位置。前述的碱基堆积杂交(base stacking hybridization, BSH),也被称为临近堆积杂交(contiguous stacking hybridization, CSH),是指当一条短的寡核苷酸单链与互补的DNA/RNA长链杂交时，形成的双链结构是不稳定的；但如果有另一条与之相邻的寡核苷酸单链也与互补的DNA/RNA长链杂 交，那么由于这两条短寡核苷酸单链相邻碱基之间的堆积作用，这种双链结构的稳定性会极大的提高。当这两条相邻的短寡核苷酸单链之间出现碱基的冗余、缺失或者错配，碱基堆积作用就会受到阻碍，就无法形成稳定的双链结构。作为本发明的典型实施方案之一，参阅图2，该基于生物芯片的检测核酸降解组mRNA的通用探针方法包括如下步骤:
1)采用生物信息学方法，预测可能被小分子RNA降解的目标核酸降解组mRNA；
2)提供检测探针，所述检测探针的一部分核酸序列与通用报告探针互补，另一部分核酸序列至少与所述目标核酸降解组mRNA断裂处部分的核酸序列互补；
3)将所述检测探针固定在生物芯片基质上，形成生物芯片；
4)将待检测样本的RNA和通用报告探针一起混入杂交液中与所述生物芯片杂交；
5)洗涤杂交后的生物芯片，检测杂交结果。以下结合若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。实施例1利用本发明方法验证杨树不定根发育中ptr_miR159f的候选祀基因及与靶基因发生相互作用的断裂位点信息。进一步的讲，本实施例涉及利用本发明方法鉴定生物信息学预测的候选靶基因(杨树基因组数据库登录号:EF146531、XM_002297667、XM_002304786)在杨树不定根的发育中是否为ptr-miR159f (miRNA序列为，5’ -3，:参阅SEQ ID N0:65)的靶基因，并确定其作用的位点。具体检测方法包括以下步骤:
I) DNA检测探针的设计与制备:三种候选靶基因的DNA检测探针序列分别如下(5， -3，):
权利要求
1.一种基于生物芯片的检测核酸降解组mRNA的通用探针方法，其特征在于，它包括如下步骤: 1)采用生物信息学方法，预测可能被小分子RNA降解的目标核酸降解组mRNA； 2)提供检测探针，所述检测探针的一部分核酸序列与通用报告探针互补，另一部分核酸序列至少与所述目标核酸降解组mRNA断裂处的核酸序列互补； 3)将所述检测探针固定在生物芯片基质上，形成生物芯片； 4)将待检测样本的RNA和通用报告探针一起混入杂交液中与所述生物芯片杂交； 5)洗涤杂交后的生物芯片，检测杂交结果。
2.根据权利要求1所述的基于生物芯片的检测核酸降解组mRNA的通用探针方法，其特征在于，所述检测探针长度为18-42mer，其中与通用报告探针互补部分的核酸序列长度为3-12mer,与核酸降解组mRNA的断裂处互补部分的核酸序列长度为15_30mer。
3.根据权利要求1所述的基于生物芯片的检测核酸降解组mRNA的通用探针方法，其特征在于，所述检测探针中与通用报告探针互补的一部分核酸序列紧邻与所述目标核酸降解组mRNA的断裂处互补的另一部分核酸序列。
4.根据权利要求1所述的基于生物芯片的检测核酸降解组mRNA的通用探针方法，其特征在于，该方法中对应于每一目标核酸降解组mRNA设计有一组探针池，每一组探针池包括数个检测探针，其中每个检测探针对应每一目标核酸降解组mRNA的一个可能的断裂位点。
5.根据权利要求4所述的基于生物芯片的检测核酸降解组mRNA的通用探针方法，其特征在于，每一组探针池包括20个以上检测探针。
6.根据权利要求1所述的基于生物芯片的检测核酸降解组mRNA的通用探针方法，其特征在于，所述检测探针通过原位合成和/或化学键连接方式固定在生物芯片基质上，所述化学键连接方式至少选自氨基-醛基反应、静电吸附、共价交联中的任意一种。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的基于生物芯片的检测核酸降解组mRNA的通用探针方法，其特征在于，所述检测探针与生物芯片基质连接的一端修饰有氨基、巯基、羧基或生物素。
8.根据权利要求1-2中任一项所述的基于生物芯片的检测核酸降解组mRNA的通用探针方法，其特征在于，所述通用报告探针至少选自DNA、RNA、PNA和LNA中的任意一种。
9.根据权利要求1-2中任一项所述的基于生物芯片的检测核酸降解组mRNA的通用探针方法，其特征在于，所述通用报告探针远离与检测探针互补一端修饰有用于指示通用报告探针与检测探针反应与否的标记分子。
10.根据权利要求1所述的基于生物芯片的检测核酸降解组mRNA的通用探针方法，其特征在于，所述待检测样本RNA至少选自总RNA样品和富集小RNA样品中的任意一种。
全文摘要
本发明公开了一种基于生物芯片的检测核酸降解组mRNA的通用探针方法，包括如下步骤1)采用生物信息学方法，预测可能被小分子RNA降解的目标核酸降解组mRNA；2)提供检测探针，所述检测探针的一部分核酸序列与通用报告探针互补，另一部分核酸序列至少与所述目标核酸降解组mRNA断裂处的核酸序列互补；3)将所述检测探针固定在生物芯片基质上形成生物芯片；4)将待检测样本的RNA和通用报告探针一起混入杂交液中与生物芯片杂交；5)洗涤杂交后的生物芯片，检测杂交结果。本发明能够高通量的检测小分子RNA介导的靶基因mRNA降解产物，可对已被生物信息学预测到的大量靶基因进行验证，且操作简便，利于推广，价格低廉，具有高性价比。
文档编号C12Q1/68GK103074419SQ20121037157
公开日2013年5月1日 申请日期2012年9月27日 优先权日2012年9月27日
发明者李炯, 沈叶, 郑克孝, 赵转 申请人:中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所