专利名称：用于核酸恒温扩增反应中防止核酸污染和指示其反应结果的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域中核酸的分子生物学检测方法，特别是涉及一种用于核酸恒温扩增反应中防止核酸污染和指示反应结果的方法。
背景技术：
核酸恒温扩增方法目前主要包括以下几种环介导恒温扩增(loop -mediated isothermal amplification, LAMP)、切口酶核酸恒温扩增(nicking enzymemediated amplification, NEMA)、链替代扩增(strand displacement amplification,SDA)、滚环扩增(rolling circle amplification, RCA)、依赖解旋酶的恒温基因扩增(helicase — dependent isothermal DNA amplification, HAD)、转录依赖的扩增系统(transcription 一 based amplification system, TAS)、依赖核酸序列的扩增(NASBA)又称自主序列复制系统(self — sustained sequence replication, 3SR)、QB 复制酶扩增(Q —beta replicase — amplified assay)等。恒温扩增摆脱了热循环的限制,使其应用范围大大增加，而且目前应用的恒温扩增方法都有较高的敏感性和特异性，在核酸检测中应用范围非常广。但敏感性高会带来扩增物污染和假阳性的问题，从而导致反应结果判读不准确。其中，环介导恒温扩增技术(LAMP)是一种快速、特异、敏感的核酸检测方法，再加之其操作简单，不需要昂贵复杂的仪器，近十多年发展迅速，广泛应用于基因检测的各个领域。虽然LAMP技术已日趋成熟，但将其真正应用到病原微生物实际临床检测或检疫单位检测病原微生物的实例却少之又少，大多都局限于实验室内的基因筛查，究其主要原因，就是假阳性的问题，也就是扩增产物污染不可控。因为LAMP具有非常高的敏感性，任何一点扩增物的溢出都将给LAMP实验带来不可控的污染问题，因此，迫切需要一种用于环介导恒温扩增技术(LAMP)中防止核酸污染和指示反应结果的方法。
发明内容
为解决现有核酸恒温扩增反应中扩增物易污染和易产生假阳性导致结果判读不准确的问题，本发明的目的是提供一种用于核酸恒温扩增反应中防止核酸污染和指示反应结果的方法。本发明所提供的用于核酸恒温扩增反应中防止核酸污染的方法，是将熔点低于核酸恒温扩增反应温度0-25°C、直径与反应管管径相同的柱状全精炼固态石蜡块或半精炼固态石腊块加入到反应管中反应液的上方，然后盖上盖，将反应管置于恒温容器进行核酸恒温扩增反应，在反应温度下全精炼固态石蜡块或半精炼固态石蜡块融化成为液态石蜡覆盖在反应液上表面，使反应液在封闭状态下进行反应，反应结束后冷却至室温液态石蜡又恢复为固态，最后用浊度仪对反应液进行结果判读，在整个反应过程中反应液始终与外界隔离，可达到防止核酸污染和避免结果假阳性的目的。所述防止核酸污染的方法适用于所有恒温核酸扩增技术，主要包括环介导恒温扩增技术(LAMP)、切口酶核酸恒温扩增技术、链替代扩增技术、滚环扩增技术、依赖解旋酶的恒温基因扩增技术、转录依赖的扩增系统、依赖核酸序列的扩增技术(又称自主序列复制系统)、QB复制酶扩增技术等，尤其适用于环介导恒温扩增技术(LAMP)。以环介导恒温扩增技术(LAMP)为例，本发明防止核酸污染的方法包括以下步骤I)将熔点为40_60°C的全精炼固态石蜡或半精炼固态石蜡融化后导入模具后再降温使其凝固，将石蜡制成适用于反应管大小(直径与反应管管径相同)的柱状固态石蜡块；2)在反应管中将LAMP反应液混合好，将石蜡块加入到反应液的上方；3)盖上盖，将反应管置于60_65°C恒温容器中进行环介导恒温扩增反应，在反应温度下固态石腊块融化成为液态石腊覆盖在反应液上表面，使反应液在封闭状态下进行反应；4)反应结束后，冷却至室温，待液态石蜡恢复为固态后用浊度仪进行结果判读。 本发明所提供的用于核酸恒温扩增反应中指示反应结果的方法，具体为用于核酸恒温扩增反应中用指示剂进行结果判读并可避免指示剂抑制反应的方法，是将熔点高于核酸恒温扩增反应温度5-25°C的全精炼固态石蜡或半精炼固态石蜡融化后与指示剂混匀，降温后制成直径与反应管管径相同的柱状固态石蜡块，然后将石蜡块加入到反应管中反应液的上方，盖上盖，将反应管置于恒温容器进行核酸恒温扩增反应，在反应过程中固态石蜡覆盖在反应液上表面，使反应液在封闭状态下进行反应，反应结束后将温度升高至固态石腊的熔点以上使固态石蜡融化成液态石蜡，石蜡中的指示剂释放到反应液中，根据反应液的颜色变化进行结果判读。所述方法适用于所有恒温核酸扩增技术，主要包括环介导恒温扩增技术(LAMP)、切口酶核酸恒温扩增技术、链替代扩增技术、滚环扩增技术、依赖解旋酶的恒温基因扩增技术、转录依赖的扩增系统、依赖核酸序列的扩增技术(又称自主序列复制系统)、QB复制酶扩增技术等，尤其适用于环介导恒温扩增技术(LAMP)。所述指示剂包括钙黄绿素、羟基萘芬兰、溴化乙锭、GeneFinder核酸染料、Goldview核酸染料、YBER green I核酸染料、GelRed和GelGreen核酸染料。以环介导恒温扩增技术(LAMP)为例，所述用指示剂进行结果判读的方法包括以下步骤I)将熔点为70_85°C的全精炼固态石蜡或半精炼固态石蜡融化后与指示剂混匀，导入模具后再降温使其凝固，将石蜡制成适用于反应管大小(直径与反应管管径相同)的柱状固态石蜡块；2)在反应管中将LAMP反应液混合好，将石蜡块加入到反应液的上方；3)盖上盖，将反应管置于60_65°C恒温容器中进行环介导恒温扩增反应，在反应过程中固态石腊覆盖在反应液上表面，使反应液在封闭状态下进行反应；4)反应结束后，将温度升高至固态石蜡的熔点以上使固态石蜡融化成液态石蜡，石蜡中的指示剂释放到反应液中，根据反应液的颜色变化进行结果判读。环介导恒温扩增技术(LAMP)中，所述指示剂为钙黄绿素或羟基萘芬兰。本发明提供了一种用于核酸恒温扩增反应中防止核酸污染和指示反应结果的方法，并以LAMP反应为例进行了说明。用于LAMP反应中防止核酸污染的方法是采用熔点为40-600C的全精炼石蜡或半精炼石蜡，利用其在LAMP反应温度(60_65°C )时为液态，反应结束后冷却至室温又恢复为固态的原理来防止污染。如果通过浊度来判断结果则不需要加指示剂，如果通过指示剂来指示反应结果且使指示剂(例如钙黄绿素、羟基萘芬兰等)不抑制恒温扩增反应便可以将抑制LAMP反应的指示剂放入熔点为70°C _85°C的全精炼石蜡或半精炼石蜡中，待恒温扩增反应结束后再将温度升至石蜡熔点使石蜡融化，指示剂释放便可以指示恒温扩增反应结果。本发明具有以下优点I)特殊熔点蜡块容易配制，价格低廉；2)固态封闭效果好，可永久封闭，从而避免了扩增物受到污染，液 态封闭剂如果口打开后仍能造成污染；3)该方法可以有效防止核酸恒温扩增反应结果的假阳性；4)对核酸恒温扩增反应无任何影响；5)应用此方法可以不用严格的实验分区，反应区和加样区可以合二为一；6)应用范围广，本发明适用于所有核酸恒温扩增反应。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图I为石蜡块及钙黄绿素FD对LAMP反应的影响图2为用两套不同的LAMP引物验证石蜡块封闭效果的检测结果图3为不同熔点石蜡对LAMP反应的影响图4A-图4C显示用于核酸恒温扩增反应中防止核酸污染的方法的过程示意图，图4A为准备加入石蜡块；图4B为将石蜡块加入到反应液的上方；图4C为用浊度仪进行结果判读；图5为抑制LAMP反应的指示剂与石蜡混合后对LAMP反应的影响图6A-图6C显示用于核酸恒温扩增反应中指示反应结果的方法的过程示意图，图6A为准备加入石腊块；图6B为将石腊块加入到反应液的上方；图6C为根据反应液的颜色变化进行结果判读。
具体实施例方式本发明提供了一种用于核酸恒温扩增反应中防止核酸污染和指示反应结果的方法。本发明所提供的用于核酸恒温扩增反应中防止核酸污染的方法，是将熔点低于核酸恒温扩增反应温度0-25°C、直径与反应管管径相同的柱状全精炼固态石蜡块或半精炼固态石腊块加入到反应管中反应液的上方，然后盖上盖，将反应管置于恒温容器进行核酸恒温扩增反应，在反应温度下全精炼固态石蜡块或半精炼固态石蜡块融化成为液态石蜡覆盖在反应液上表面，使反应液在封闭状态下进行反应，反应结束后冷却至室温液态石蜡又恢复为固态，最后用浊度仪对反应液进行结果判读，在整个反应过程中反应液始终与外界隔离，可达到防止核酸污染和避免结果假阳性的目的。本发明所提供的防止核酸污染的方法适用于所有恒温核酸扩增技术，主要包括环介导恒温扩增技术(LAMP)、切口酶核酸恒温扩增技术、链替代扩增技术、滚环扩增技术、依赖解旋酶的恒温基因扩增技术、转录依赖的扩增系统、依赖核酸序列的扩增技术(又称自主序列复制系统)、QB复制酶扩增技术等，尤其适用于环介导恒温扩增技术(LAMP)。以环介导恒温扩增技术(LAMP)为例，本发明防止核酸污染的方法可包括以下步骤I)将熔点为40_60°C的全精炼固态石蜡或半精炼固态石蜡融化后导入模具后再降温使其凝固，将石蜡制成适用于反应管大小(直径与反应管管径相同)的柱状固态石蜡块；2)在反应管中将LAMP反应液混合好，将石蜡块加入到反应液的上方；3)盖上盖，将反应管置于60_65°C恒温容器中进行环介导恒温扩增反应，在反应温度下固态石腊块融化成为液态石腊覆盖在反应液上表面，使反应液在封闭状态下进行反应；4)反应结束后,冷却至室温,待液态石腊恢复为固态后用浊度仪对反应液进行结果判读。上述核酸恒温扩增反应中用浊度仪进行结果判读，不需要添加指示剂。本发明还提供了一种方便观测的用指示剂进行结果判读并可避免指示剂抑制反应的方法。本发明所提供的用指示剂进行结果判读的核酸恒温扩增反应方法，是将熔点高于核酸恒温扩增反应温度5_25°C的全精炼固态石蜡或半精炼固态石蜡融化后与指示剂混匀，降温后制成直径与反应管管径相同的柱状固态石蜡块，然后将石蜡块加入到反应管中反应液的上方，盖上盖，将反应管置于恒温容器进行核酸恒温扩增反应，在反应过程中固态石蜡覆盖在反应液上表面，使反应液在封闭状态下进行反应，反应结束后将温度升高至固态石蜡的熔点以上使固态石蜡融化成液态石蜡，石蜡中的指示剂释放到反应液中，根据反应液的颜色变化进行结果判读。本发明所提供的用指示剂进行结果判读的方法适用于所有恒温核酸扩增技术，主要包括环介导恒温扩增技术(LAMP)、切口酶核酸恒温扩增技术、链替代扩增技术、滚环扩增技术、依赖解旋酶的恒温基因扩增技术、转录依赖的扩增系统、依赖核酸序列的扩增技术(又称自主序列复制系统)、QB复制酶扩增技术等，尤其适用于环介导恒温扩增技术(LAMP )。所述指示剂包括钙黄绿素、羟基萘芬兰、溴化乙锭、GeneFinder核酸染料、Goldview核酸染料、YBER green I核酸染料、GelRed和GelGreen核酸染料等。以环介导恒温扩增技术(LAMP)为例，本发明用指示剂进行结果判读的方法可包括以下步骤I)将熔点为70_85°C的全精炼固态石蜡或半精炼固态石蜡融化后与指示剂混匀，导入模具后再降温使其凝固，将石蜡制成适用于反应管大小(直径与反应管管径相同)的柱状固态石蜡块；2)在反应管中将LAMP反应液混合好，将石蜡块加入到反应液的上方；3)盖上盖，将反应管置于60_65°C恒温容器中进行环介导恒温扩增反应，在反应过程中固态石腊覆盖在反应液上表面，使反应液在封闭状态下进行反应；4)反应结束后，将温度升高至固态石蜡的熔点以上使固态石蜡融化成液态石蜡，石蜡中的指示剂释放到反应液中，根据反应液的颜色变化进行结果判读。在上述用指示剂进行结果判读的环介导恒温扩增技术(LAMP)中，所述指示剂优选为钙黄绿素或羟基萘芬兰。·
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。下述实验例和实施例适用于所有恒温核酸扩增技术，主要包括环介导恒温扩增技术(LAMP)、切口酶核酸恒温扩增技术、链替代扩增技术、滚环扩增技术、依赖解旋酶的恒温基因扩增技术、转录依赖的扩增系统、依赖核酸序列的扩增技术(又称自主序列复制系统)、QB复制酶扩增技术等，以环介导恒温扩增技术(LAMP)为例进行说明。实验例I、检测石蜡块及指示剂(钙黄绿素FD)是否抑制LAMP反应检测石蜡块是否抑制LAMP反应，具体实验方法包括以下步骤I)将熔点为42°C (40_60°C均可)的半精炼固态石蜡(或全精炼固态石蜡)融化后导入模具后再降温使其凝固，将石蜡制成适用于反应管大小(直径与反应管管径相同)的柱 状固态石蜡块；2)实验分为六组阴性对照组(石蜡及钙黄绿素均不加，阴性指LAMP反应的模板为双蒸水，为质量控制，保证操作过程和引物没有被污染)、加FD阳性组(添加钙黄绿素，阳性指LAMP反应的模板为靶基因片段)、不加FD阳性组(不添加钙黄绿素，阳性指LAMP反应的模板为靶基因片段)，阴性对照+石蜡组(添加石蜡，阴性指LAMP反应的模板为双蒸水)、加FD阳性+石蜡组(添加石蜡及钙黄绿素，阳性指LAMP反应的模板为靶基因片段)、无FD阳性+石蜡组(添加石蜡，阴性指LAMP反应的模板为双蒸水)；3)将反应液加入反应管中，反应液成分为含NDM-I的饱鲍曼不动杆菌的基因组 DNA2yl，20mM Tris · HCl (pH8. 8), IOmM KCl, IOmM (NH4)2SO4,0. I % Tween20,0. 8M甜菜喊(betaine),8mM MgSO4, I. 4mM dNTP each,8UBst DNA 聚合酶，弓丨物 2μ1 (引物序列为 NDM-FIP CTGGCGGTGGTGACTCACGTTTTGCATGCAGCGCGTCCA (序列表中序列 I);NDM-BIP CGCGACCGGCAGGTTGATCTTTTGGTCGATACCGCCTGGAC (序列表中序列 2) ；NDM-LF GCATCAGGACAAGATGGGC (序列表中序列 3);NDM_LB TCCAGTTGAGGATCTGGG (序列表中序列 4);NDM-F3 GCATAAGTCGCAATCCCCG (序列表中序列 5) ;NDM_B3 GGTTTGATCGTCAGGGATGG (序列表中序列6))，按上述实验分组添加或不添加石蜡和/或钙黄绿素，盖上盖，将反应管置于LA-320C浊度仪进行环介导恒温扩增反应；4)反应过程中用LA-320C浊度仪在400nm下进行实时检测结果判读(看反应时间和反应曲线有无变化)。结果如图I所示，可以看出加石蜡组和不加石蜡组发生反应的时间相同，表明石腊不抑制LAMP反应；加指示剂组相对于不加指示剂组反应时间推迟,表明指示剂(I丐黄绿素FD)抑制LAMP反应。实验例2、用两套不同的LAMP弓丨物验证石蜡块的封闭效果用两套不同的LAMP引物验证石蜡块的封闭效果，具体实验方法包括以下步骤I)将熔点为42°C (40_60°C均可)的半精炼固态石蜡(或全精炼固态石蜡)融化后导入模具后再降温使其凝固，将石蜡制成适用于反应管大小(直径与反应管管径相同)的柱状固态石蜡块；2)实验分为四组引物I加石蜡组(添加引物I和石蜡)、引物I不加石蜡组(添加引物I和石蜡)、引物2加石蜡组(添加引物2和石蜡)、引物2不加石蜡组(添加引物2和石蜡)；
3)将反应液加入反应管中，反应液成分为含NDM-I的饱鲍曼不动杆菌(适用于引物I)和结核杆菌(适用于引物2)的基因组DNA2y l，20mM Tri s · HCl (pH8. 8)，IOmMKC1，IOmM(NH4)2SO4,0. 1% Tween20，0. 8M 甜菜碱(betaine)，8mM MgSO4,1. 4mM dNTP each,8U Bst DNA聚合酶，引物2μ I (引物I序列为引物序列如下NDM-FIP CTGGCGGTGGTGACTCACGTTTTGCATGCAGCGCGTCCA (序列表中序列 I) ；NDM-BIP CGCGACCGGCAGGTTGATCTTTTGGTCGATACCGCCTGGAC (序列表中序列 2) ；NDM-LF GCATCAGGACAAGATGGGC (序列表中序列 3)；NDM-LB TCCAGTTGAGGATCTGGG (序列表中序列 4) ；NDM-F3 GCATAAGTCGCAATCCCCG (序列表中序列5) ；NDM-B3 GGTTTGATCGTCAGGGATGG (序列表中序列6)。引物2序列为JH_F3 TCGGACCACCAGCACC (序列表中序列 7) ；JH-B3 GCGGGTCCAGATGGCTTG (序列表中序列 8)； JH-FIP ACGTAGGCGAACCCTGCCCTTTTTAACCGGCTGTGGGTAGC (序列表中序列 9);JH_BIP =CGACGCCTACGCTCTTTTTCGCGTCGAGGACCATG (序列表中序列 10);JH_LF AGGTCGACACATAGGTGAGG (序列表中序列11) ； JH-LB CGGGTCGCTTCCACGAT (序列表中序列12))，按上述实验分组添加或不添加石蜡，盖上盖，将反应管置于60-65°C恒温容器中进行环介导恒温扩增反应，在离反应区域I米、5米、10米、15米、20米的五个不同方向分别各取4个位点加样重复两组引物，比较假阳性率；4)反应过程中用LA-320C浊度仪在400nm下进行结果判读。结果如图2所示，可以看出添加蜡块组并没有发现假阳性，而未添加蜡块组有假阳性，表明添加蜡块后可以有效的防止扩增物的污染，可避免结果出现假阳性。实验例3、不同熔点石蜡对LAMP反应的影响检测不同熔点石蜡对LAMP反应的影响，具体实验方法包括以下步骤I)将不同熔点(36°C、44°C、52°C、60°C、64°C)的半精炼固态石蜡融化后分别导入模具后再降温使其凝固，将石蜡制成适用于反应管大小(直径与反应管管径相同)的柱状固态石蜡块；2)实验按石蜡的熔点不同分为五组36°C石蜡组(添加熔点为36°C的石蜡)、44°C石蜡组(添加熔点为44 V的石蜡)>52 0C石蜡组(添加熔点为52V的石蜡)、60 V石蜡组(添加熔点为60°C的石蜡)、64°C石蜡组(添加熔点为64°C的石蜡)；3)将反应液加入反应管中，反应液成分为含NDM-I的饱鲍曼不动杆菌的基因组 DNA2yl，20mM Tris · HCl (pH8. 8), IOmM KCl, IOmM(NH4)2S04,0. I % Tween20,0. 8M甜菜喊(betaine),8mM MgS04,1. 4mM dNTP each,8U Bst DNA 聚合酶，弓丨物 2μ1 (引物序列为 NDM-FIP CTGGCGGTGGTGACTCACGTTTTGCATGCAGCGCGTCCA (序列表中序列 I);NDM-BIP CGCGACCGGCAGGTTGATCTTTTGGTCGATACCGCCTGGAC (序列表中序列 2)；NDM-LF GCATCAGGACAAGATGGGC (序列表中序列 3);NDM_LB TCCAGTTGAGGATCTGGG (序列表中序列 4);NDM-F3 GCATAAGTCGCAATCCCCG (序列表中序列 5) ;NDM_B3 GGTTTGATCGTCAGGGATGG (序列表中序列6)，按上述实验分组添加不同熔点的石蜡，盖上盖，将反应管置于60-65°C恒温容器中进行环介导恒温扩增反应；4)反应过程中用LA-320c池度仪在400nm下进行结果判读(看反应时间和反应曲线有无变化)。结果如图3所示，可以看出不同熔点的石蜡发生LAMP反应的时间是相同的，表明不同熔点蜡块对LAMP反应没有影响，因为蜡块不溶于LAMP反应液，所以不会对LAMP反应本身造成影响。但是，如果蜡块的熔点低于室温，那么便会存在不易保存的问题；如果蜡块熔点高于63°C，便会存在不防污染的问题，所以蜡块的熔点要在40°C -60°C范围之间，针对其他恒温扩增反应技术，蜡块的熔点要低于核酸恒温扩增反应温度0-25°C。基于实验例1-3， 本发明用于恒温扩增反应中防止核酸污染的方法可包括以下步骤I)将熔点低于核酸恒温扩增反应温度0_25°C (环介导恒温扩增反应中采用熔点为40_60°C的石蜡)的全精炼固态石蜡或半精炼固态石蜡融化后导入模具后再降温使其凝固，将石蜡制成适用于反应管大小(直径与反应管管径相同)的柱状固态石蜡块；2)在反应管中将恒温扩增反应液混合好，准备加入石蜡块(见图4A)，将石蜡块加入到反应液的上方(见图4B)；3)盖上盖，将反应管置于恒温容器中进行环介导恒温扩增反应(环介导恒温扩增反应置于60-65°C恒温容器中进行反应),在反应温度下固态石腊块融化成为液态石腊覆盖在反应液上表面，使反应液在封闭状态下进行反应；4)反应过程中用浊度仪进行结果判读(见图4C)。实验例4、抑制LAMP反应的指示剂与石蜡混合后对LAMP反应的影响检测抑制LAMP反应的指示剂(钙黄绿素FD)与石蜡混合后对LAMP反应的影响，具体实验方法包括以下步骤I)将将熔点为76°C (70_85°C均可)的半精炼固态石蜡(或全精炼固态石蜡)融化后与指示剂(钙黄绿素FD)混匀，导入模具后再降温使其凝固，将石蜡制成适用于反应管大小(直径与反应管管径相同)的柱状固态石蜡块；2)实验分为三组空白对照组(不添加石蜡及钙黄绿素)、无染料石蜡组(添加石蜡，不添加钙黄绿素)、含染料石蜡组(添加混有钙黄绿素的石蜡)；3)将反应液加入反应管中，反应液成分为含NDM-I的饱鲍曼不动杆菌的基因组 DNA2yl，20mM Tris · HCl (pH8. 8), IOmM KCl, IOmM (NH4)2SO4,0. I % Tween20,0. 8M甜菜喊(betaine),8mM MgSO4,1. 4mM dNTP each,8U Bst DNA 聚合酶，引物 2μ I (引物序列为 NDM-FIP CTGGCGGTGGTGACTCACGTTTTGCATGCAGCGCGTCCA (序列表中序列 I);NDM-BIP CGCGACCGGCAGGTTGATCTTTTGGTCGATACCGCCTGGAC (序列表中序列 2) ；NDM-LF GCATCAGGACAAGATGGGC (序列表中序列 3) ；NDM-LB TCCAGTTGAGGATCTGGG (序列表中序列4)；NDM-F3 GCATAAGTCGCAATCCCCG (序列表中序列 5);NDM_B3 GGTTTGATCGTCAGGGATGG (序列表中序列6)，按上述实验分组添加或不添加石蜡和/或钙黄绿素，盖上盖，将反应管置于60-65°C恒温容器中进行环介导恒温扩增反应；4)反应结束后，将温度升高至固态石蜡的熔点以上(76°C以上)使固态石蜡融化成液态石蜡，石蜡中的指示剂释放到反应液中，根据反应液的颜色变化进行结果判读，并用LA-320C浊度仪在400nm下对结果进行精确判读(看反应时间和反应曲线有无变化)。结果如图5所示，可以看出石蜡及指示剂对LAMP反应均无影响，表明将指示剂混入高熔点的石蜡后可消除指示剂对LAMP反应的抑制作用。基于实验例4，本发明用于恒温扩增反应中用指示剂进行结果判读的方法可包括以下步骤I)将熔点高于核酸恒温扩增反应温度5_25°C (环介导恒温扩增反应中采用熔点为70-85°C的石蜡)的全精炼固态石蜡或半精炼固态石蜡融化后与指示剂混匀，导入模具后再降温使其凝固，将石蜡制成适用于反应管大小(直径与反应管管径相同)的柱状固态石蜡块；2)在反应管中将恒温扩增反应液混合好，准备加入石蜡快(见图6A)，将石蜡块加入到反应液的上方(见图6B)；3)盖上盖，将反应管置于恒温容器中进行环介导恒温扩增反应(环介导恒温扩增反应置于60-65°C恒温容器中进行反应)，在反应过程中固态石蜡覆盖在反应液上表面，使反应液在封闭状态下进行反应；4)反应结束后，将温度升高至固态石蜡的熔点以上使固态石蜡融化成液态石蜡， 石蜡中的指示剂释放到反应液中，根据反应液的颜色变化进行结果判读(见图6C)。
权利要求
1.一种用于核酸恒温扩增反应中防止核酸污染的方法，是将熔点低于核酸恒温扩增反应温度0-25°C、直径与反应管管径相同的柱状全精炼固态石蜡块或半精炼固态石蜡块加入到反应管中反应液的上方，然后盖上盖，将反应管置于恒温容器进行核酸恒温扩增反应，在反应温度下全精炼固态石蜡块或半精炼固态石蜡块融化成为液态石蜡覆盖在反应液上表面，使反应液在封闭状态下进行反应，反应结束后冷却至室温液态石蜡又恢复为固态，最后用浊度仪对反应液进行结果判读，在整个反应过程中反应液始终与外界隔离，可达到防止核酸污染和避免结果假阳性的目的。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述防止核酸污染的方法适用于所有恒温核酸扩增技术，主要包括环介导恒温扩增技术(LAMP)、切口酶核酸恒温扩增技术、链替代扩增技术、滚环扩增技术、依赖解旋酶的恒温基因扩增技术、转录依赖的扩增系统、依赖核酸序列的扩增技术(又称自主序列复制系统)、QB复制酶扩增技术等，尤其适用于环介导恒温扩增技术(LAMP)。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于以环介导恒温扩增技术(LAMP)为例，本发明防止核酸污染的方法包括以下步骤 1)将熔点为40-60°C的全精炼固态石蜡或半精炼固态石蜡融化后导入模具后再降温使其凝固，将石蜡制成适用于反应管大小(直径与反应管管径相同)的柱状固态石蜡块； 2)在反应管中将LAMP反应液混合好，将石蜡块加入到反应液的上方； 3)盖上盖，将反应管置于60-65°C恒温容器中进行环介导恒温扩增反应，在反应温度下固态石腊块融化成为液态石腊覆盖在反应液上表面，使反应液在封闭状态下进行反应； 4)反应结束后，冷却至室温，待液态石蜡恢复为固态后用浊度仪进行结果判读。
4.一种用于核酸恒温扩增反应中用指示剂进行结果判读并可避免指示剂抑制反应的方法，是将熔点高于核酸恒温扩增反应温度5-25°C的全精炼固态石蜡或半精炼固态石蜡融化后与指示剂混匀，降温后制成直径与反应管管径相同的柱状固态石蜡块，然后将石蜡块加入到反应管中反应液的上方，盖上盖，将反应管置于恒温容器进行核酸恒温扩增反应，在反应过程中固态石腊覆盖在反应液上表面，使反应液在封闭状态下进行反应，反应结束后将温度升高至固态石蜡的熔点以上使固态石蜡融化成液态石蜡，石蜡中的指示剂释放到反应液中，根据反应液的颜色变化进行结果判读。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述方法适用于所有恒温核酸扩增技术，主要包括环介导恒温扩增技术(LAMP)、切口酶核酸恒温扩增技术、链替代扩增技术、滚环扩增技术、依赖解旋酶的恒温基因扩增技术、转录依赖的扩增系统、依赖核酸序列的扩增技术(又称自主序列复制系统)、QB复制酶扩增技术等，尤其适用于环介导恒温扩增技术(LAMP )。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述指示剂包括钙黄绿素、羟基萘芬兰、溴化乙淀、GeneFinder核酸染料、Goldview核酸染料、YBER green I核酸染料、GelRed和GelGreen核酸染料。
7.根据权利要求4或5或6所述的方法，其特征在于以环介导恒温扩增技术(LAMP)为例，所述用指示剂进行结果判读的方法包括以下步骤 I)将熔点为70-85°C的全精炼固态石蜡或半精炼固态石蜡融化后与指示剂混匀，导入模具后再降温使其凝固，将石蜡制成适用于反应管大小(直径与反应管管径相同)的柱状固态石蜡块；2)在反应管中将LAMP反应液混合好，将石蜡块加入到反应液的上方； 3)盖上盖，将反应管置于60-65°C恒温容器中进行环介导恒温扩增反应，在反应过程中固态石腊覆盖在反应液上表面，使反应液在封闭状态下进行反应； 4)反应结束后，将温度升高至固态石蜡的熔点以上使固态石蜡融化成液态石蜡，石蜡中的指示剂释放到反应液中，根据反应液的颜色变化进行结果判读。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述指示剂为钙黄绿素或羟基萘芬兰。
全文摘要
本发明提供了一种用于核酸恒温扩增反应中防止核酸污染和指示反应结果的方法。以LAMP反应为例，用熔点为40-60℃的全精炼石蜡或半精炼石蜡，利用其在LAMP反应温度(60-65℃)时为液态，反应结束后冷却至室温又恢复为固态的原理来防止污染。可通过浊度来判断结果，或通过指示剂来指示恒温扩增反应结果。本发明采用容易配制的特殊熔点蜡块，价格低廉，固态封闭效果好，可永久封闭，从而避免了扩增物受到污染，有效防止核酸恒温扩增反应结果的假阳性，适用于所有核酸恒温扩增反应。
文档编号C12Q1/68GK102936623SQ201210371448
公开日2013年2月20日 申请日期2012年9月28日 优先权日2012年9月28日
发明者袁静, 刘威, 黄留玉 申请人:中国人民解放军疾病预防控制所