专利名称：抗副猪嗜血杆菌外膜蛋白omp5的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫学领域，具体涉及一种抗副猪嗜血杆菌外膜蛋白0MP5的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用。
背景技术：
副猪嗜血杆菌Parasuis, HPS)属于巴斯德菌科,嗜血杆菌属，是一种没有运动性、小型、NAD依赖、多形态的革兰氏阴性杆菌。HPS是一种常在菌，通常定植在猪的上呼吸道，并常常可在鼻腔内、扁桃体内和气管前段分离到，而不见其引起任何临床症状。HPS也是猪格拉泽氏病(Glasser’ s diseas)的病原。在一定条件下，HPS可造成以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎为特征的全身感染。格拉泽氏病已在全球范围内成为影响猪业的主要细菌性疾病，给养猪业带来巨大损失。迄今已发现的HPS至少有15种不同 的血清型，不同血清型菌株之间缺乏有效的交叉免疫保护性，这增加了预防格拉泽氏病的难度。因此，及时、准确、快捷而方便的病原学诊断方法对于猪格拉泽氏病的防治具有重要意义。目前国内对副猪嗜血杆菌的诊断主要有传统的病原分离，生化鉴定和血清学等方法，以及基于PCR的检测方法等。免疫学方法如ELISA、胶体金试纸条等具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速、对仪器依赖性低等特点，因而常被用于疾病病原检测以及药物痕量分析等领域。目前国内尚未有基于抗体的HPS检测的可商品化诊断方法。HPS的外膜蛋白(Outer member protein,0MP)是其主要毒力因子之一，而且免疫原性强。0MP5是其中主要的一种，各血清型HPS菌株都有0MP5。因此0MP5可作为HPS的特异性诊断靶位。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分泌抗副猪嗜血杆菌外膜蛋白0MP5单克隆抗体的杂交瘤细胞株HPS 8D9，已于2012年9月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(CHINACENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION)，保藏编号为 CCTCC C2012135。本发明还提供了由上述保藏编号为CCTCC C2012135的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体。本发明还提供了上述单克隆抗体在检测副猪嗜血杆菌外膜蛋白0MP5上的应用。本发明所采用的技术方案是
一种分泌抗副猪嗜血杆菌外膜蛋白0MP5单克隆抗体的杂交瘤细胞株HPS 8D9，于2012年9月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C2012135。一种抗副猪嗜血杆菌外膜蛋白0MP5的单克隆抗体，由保藏编号为CCTCCC2012135的杂交瘤细胞株产生。所述单克隆抗体为IgG2b亚类。
一种检测副猪嗜血杆菌抗体的试剂盒，含有保藏编号为CCTCC C2012135的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。一种检测副猪嗜血杆菌的试剂盒，含有保藏编号为CCTCC C2012135的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。本发明的有益效果在于
本发明制备得到的单克隆抗体具有以下优点
(1)特异性好，与猪大肠杆菌、猪巴氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌和猪波氏杆菌均无交叉反应；
(2)效价高，纯化后的ELISA抗体效价可达I:204800 ；
(3)通用性强，对不同血清型副猪嗜血杆菌都能检测；
(4)可大量生产；
(5)可广泛用于副猪嗜血杆菌病的病原学诊断、血清学检测、免疫学检测及防治等。
图I为本发明的技术流程 图2为单克隆抗体的特异性检测结果(M :蛋白Marke ；P5 0MP5 ；1 :猪大肠杆菌；2 :猪链球菌2型菌株；3 :猪多杀性巴氏杆菌菌株A ；4 :猪多杀性巴氏杆菌菌株B ；5 :猪胸膜肺炎放线杆菌菌株；6 :猪波氏杆菌菌株)；
图3为单克隆抗体的通用性检测结果(M :蛋白Marker ；P5 =OMP5 ;I :I型HPS ;2 :3型HPS ；3 :4 型 HPS ；4 :5 型 HPS ；5 :10 型 HPS ；6 :11 型 HPS ；7 :12 型 HPS ；8 :14 型 HPS ；9 15 型HPS ；10 :未定血清型HPS)；
图4为单克隆抗体用于检测HPS在PK15细胞上的粘附(激光共聚焦显微镜观察)(A 单克隆抗体HPS8D9 ；B -M 0MP5阳性血清对照；C :抗5型HPS全菌阳性血清对照；D 阴性血清对照)。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。主要实验材料和来源
猪胸膜肺炎放线杆菌I型(APP259，购自中国兽药监察所)；HPS 3型菌株(SW114，澳大利亚昆士兰州动物健康研究所Pat Blackall博士惠赠);HPS 11型(H456，澳大利亚昆士兰州动物健康研究所Pat Blackall博士惠赠)；猪大肠杆菌、猪多杀性巴氏杆菌2株菌株、猪链球菌2型菌株、猪波氏杆菌、HPS I型菌株、HPS 4型菌株、HPS 5型菌株、HPS 10型菌株、HPS 12型菌株、HPS 14型菌株、HPS 15型菌株及I株未定型HPS菌株均由本实验室从广东地区病猪中分离、鉴定并保藏。一、免疫原的制备
将HPS 5型菌株在TSA平板上培养18 24h后，挑取单菌落接种于5mL TSB培养基中150rpm振荡培养10 12h，然后按照1% 4% (v/v)的比例接种于IOOmL TSB培养基中培养10h，梯度稀释，细菌计数，同时进行污染检查。6000r/min,离心IOmin后，用pH7. 4的PBS洗涤并制成IO9 CFU/ml浓度的悬液，加入O. 1% O. 4%的甲醛，37°C灭活24h，备用。二、动物免疫
选取体重在20g左右的雌性Balab/c小鼠。首次免疫，将灭活的HPS菌液与弗氏完全佐剂按I: I的比例进行混合乳化，剂量为O. I O. 5mL/只，注射方法为背部皮内多点注射。首免后每隔2 3周加强免疫一次，佐剂改用弗氏不完全佐剂。三免后I周左右，剪尾采血，收集血清；用表达纯化的HPS 5型菌株外膜蛋白0MP5 (制备方法详见文献陈善真，李春玲等，副猪嗜血杆菌0MP5基因的克隆、表达及间接ELISA检测方法的建立，中国农业科学，2011,44(14) :3036-3044)对血清中的抗体进行ELISA检测。免疫进行至抗体效价不再升高。选择抗体效价高的小鼠，在细胞融合前进3天腹腔注射灭活菌液O. I O. 5mL/只行一次加强免疫。三、杂交瘤细胞的融合、筛选与扩大培养
取效价较高免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞，按常规PEG融合法制备杂交瘤细胞；抗体用重组表达的OMP5进行间接ELISA检测，筛选阳性克隆并扩大培养；同时采用有限稀释法对阳性克隆进行亚克隆，至少进行3次，以保证能得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。筛选出高分泌特异性的杂交瘤细胞株HPS 8D9保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年9月25日，保藏编号为CCTCC C2012135。将其分泌的单克隆抗体命名为 HPS 8D9。ELISA所用溶液的配制
包被缓冲液(O. 05mol/L 碳酸盐缓冲液 pH9. 6) :1. 59g Na2CO3, 2. 93g Na2HCO3 溶于800mL双蒸水中，调节pH值至9. 6，并定容至1000mL。封闭液牛血清白蛋白(BSA) Ig加入IOOmL的包被液中，混匀，现配现用。洗涤缓冲液(pH7.4 PBST) 0. 2g KH2PO4, 2. 9g Na2HPO4 · 12H20，8. Og NaCl，0.2gKC1,0. 5mL Tween-20 (0. 05% V/V)以上各物质准确称量后，加双蒸水完全溶解后，调pH值至7. 4，定容至IOOOmL0抗体稀释液0. 5g BSA溶于IOOmL PBST中。底物缓冲液Na2HP04 · 12H20 3. 8g ;梓檬酸O. 98g，准确称量后，溶于80mL双蒸水，调PH值至5. 0，用蒸馏水定容到100mL。TMB底物显色液A液TMB 50mg溶于IOmL DMSO中4°C避光保存。B液(ρΗ5· 0)
0.2 mol/L Na2HPO4. 12H20 51. 4mL,0. I mol/L柠檬酸48. 6mL，IOOmL超纯水，再加入 30% H2O2112 μ L于棕色瓶中4°C避光保存。用前A液和B液按I : 50比例混合。终止液(2mol/L H2SO4):双蒸水 178. 3mL，逐滴加入浓硫酸(98%) 21. 7mL。间接ELISA具体操作如下
I)包被用包被液稀释重组HPS外膜蛋白OMP5至浓度为3. 475 μ g /mL, 100 μ L/孔，加入96孔聚苯乙烯酶联反应板，4°C包被过夜；弃去包被液，每孔加250 μ L PBST洗涤液，静置3min，弃洗涤液，将ELISA板在吸水纸上用力拍干，重复三次。2)封闭加封闭液，10(^17孔，37°〇条件下封闭211，弃去封闭液，在每孔加2501^PBST,静置3min，在吸水纸上用力拍干，重复三次。
3)加样每孔加入100μ L细胞培养上清\腹水\纯化后的抗体，用PBST按1:1000稀释抗HPS阳性小鼠血清，作为阳性对照，取SP2/0培养上清为阴性对照，37°C作用lh，作用完毕后弃去样品。每孔加250 μ L PBST静置3min，在吸水纸上用力拍干，重复三次。4)加酶标二抗每孔加50μ L用PBST 1:4000稀释的辣根过氧化物标记山羊抗小鼠抗体，37°C作用30min，作用完毕后弃去二抗，每孔加250 μ L PBST静置3min，在吸水纸上用力拍干，重复三次。5)加显色液每孔加入100 μ L显色液，显色液要用新鲜配制的，室温条件下避光显色lOmin。6)加入终止液显色完毕后,立即加入终止液终止反应,每孔100 μ L。7)测OD值用酶标仪测定0D450nm处吸光值。
四、杂交瘤细胞株上清与腹水单抗(HPS 8D9)效价的测定
将杂交瘤细胞培养上清和制备的腹水，连续倍比稀释，然后用间接ELISA (操作方法同三)测定其效价，并设阳性、阴性血清以及SP2/0细胞培养上清作阴性对照。结果显示，杂交瘤细胞培养上清的效价为1:2560，腹水效价为I :51200，纯化后的抗体效价为I: 204800。五、单克隆抗体HPS 8D9腹水的大量制备
取10周龄雌性健康Balb/c小鼠，O. 5ml/只腹腔注射降植烷；I周后，O. 2 O. 5 ml/只腹腔注射浓度为5X IOVml的杂交瘤细胞；待小鼠腹部明显胀大，用手触摸皮肤时有紧致感时，收集腹水并以2000rpm离心5min，上清液即为含单克隆抗体的腹水。将腹水从1:100进行倍比稀释，然后用间接ELISA (操作方法同四)测定其效价，结果显示，腹水的效价为1:51200。所获得的腹水可于一 80°C或液氮中保存。六、单克隆抗体HPS 8D9的纯化
用Roche公司的蛋白A亲和层析试剂盒将单克隆抗体从筛选到的杂交瘤细胞培养液或腹水中纯化出来，具体步骤按试剂盒的说明书操作。纯化后的效价为I : 204800。七、单克隆抗体IgG亚类鉴定
参照 Sigma 公司的 Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents 使用说明，运用捕捉ELISA法测定HPS 8D9杂交瘤细胞分泌的免疫球蛋白的亚类类型，结果表明HPS 8D9为IgG2b亚类。八、杂交瘤细胞分泌抗体HPS 8D9的稳定性分析
将杂交瘤细胞在液氮中冻存I个月后复苏，以OMP5为抗原用间接ELISA法测定细胞培养上清液中的抗体效价，然后再次放入液氮中冻存；1个月后再次取出复苏，如此连续重复冻融三次。比较分析几次杂交瘤细胞培养上清的抗体效价的测定值。结果表明，杂交瘤细胞经过三次反复冻融，其细胞培养上清液抗体效价恒定，说明分泌的单抗具有良好的稳定性。
权利要求
1.一种分泌抗副猪嗜血杆菌外膜蛋白0MP5单克隆抗体的杂交瘤细胞株HPS 8D9，于2012年9月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C2012135。
2.一种抗副猪嗜血杆菌外膜蛋白OMP5的单克隆抗体，由权利要求I所述的杂交瘤细胞株产生。
3.根据权利要求2所述的抗副猪嗜血杆菌外膜蛋白OMP5的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为IgG2b亚类。
4.一种检测副猪嗜血杆菌抗体的试剂盒,含有权利要求2或3所述的单克隆抗体。
5.一种检测副猪嗜血杆菌的试剂盒，含有权利要求2或3所述的单克隆抗体。
全文摘要
本发明公开了一种抗副猪嗜血杆菌外膜蛋白OMP5的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用。所述杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCC2012135。由其制备的单克隆抗体特异性好，与猪大肠杆菌、猪巴氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌和猪波氏杆菌均无交叉反应；效价高，纯化后的ELISA抗体效价可达1204800；通用性强，对不同血清型副猪嗜血杆菌都能检测；可广泛用于副猪嗜血杆菌病的病原学诊断、血清学检测、免疫学检测及防治等。
文档编号C12N5/20GK102876635SQ201210371720
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月28日 优先权日2012年9月28日
发明者李春玲 申请人:广东省农业科学院兽医研究所