一种运动诱发骨骼肌细胞乳酸和甘油三酯堆积模型的建立方法与流程

本发明涉及一种运动诱发骨骼肌细胞乳酸和甘油三酯堆积模型的建立方法，属于生物技术和人体运动技术领域。

背景技术：

长时间耐力训练能够增加骨骼肌细胞中甘油三酯含量和线粒体氧化脂肪酸功能，尤其以马拉松运动员表现突出。但是耐力训练增加骨骼肌细胞中甘油三酯含量和线粒体功能的机制还不清楚。运动过程中骨骼肌组织中堆积乳酸，乳酸是否参与了运动训练诱导骨骼肌tg堆积和线粒体功能蛋白增加目前还不清楚。在细胞培养中，电脉冲(eps)刺激分化成功的骨骼肌细胞能够替代神经电信号激活骨骼肌纤维。目前大部分关于eps诱导细胞收缩模型能够用于研究训练骨骼肌一些适应性变化。另外，随着老龄化，老年人肌力下降现象增多，同时卧床病人往往出现肌萎缩下降。体外电脉冲方式来改善和恢复骨骼肌功能在临床上使用逐渐增多。但是目前改善肌萎缩和肌力下降的最佳电脉冲参数还不十分清楚。在过去的几年时间内，有关培养的骨骼肌细胞eps模型的报道越来越多，这表明学者们对建立一种骨骼肌细胞eps模型表现出浓厚兴趣，这种模型能够用来在体外进一步研究运动引起骨骼肌适应变化的分子机制和探究改善肌萎缩和肌力下降的较佳电脉冲参数。目前这一电脉冲参数较少同时关于eps诱发骨骼肌细胞乳酸增多和tg堆积模型尚未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种运动诱发骨骼肌细胞乳酸和甘油三酯堆积模型的建立方法。本发明发现了电脉冲刺激诱导成肌细胞收缩,进而诱发乳酸分泌增多的现象，同时建立了4天电脉冲刺激小鼠成肌细胞且在电脉冲刺激后36h能够诱发细胞中甘油三酯堆积模型，从而得出无氧代谢糖酵解产物乳酸在运动训练诱导骨骼肌细胞脂滴堆积和线粒体功能蛋白增加方面承担重要角色。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种运动诱发骨骼肌细胞乳酸和甘油三酯堆积模型的建立方法，包括如下步骤：

步骤1：细胞培养

将小鼠成肌细胞接种于细胞培养基中，培养后，加入消化液，进行细胞消化，然后，将消化后的细胞铺入6孔板，当6孔板中的细胞融合到90-95％时，将细胞培养基更换为细胞分化培养基，每24h更换一次细胞分化培养基，分化4-6天；

步骤2：电脉冲刺激

实验组：电脉冲刺激每天1次，共持续4天；其中，第1天和第2天：电压14v/10mm，单次脉冲时长2ms，频率1hz，每天总时长2h；第3天和第4天：电压30v/10mm，单次脉冲时长2ms，频率0.5-10hz，每天总时长3h；每次电脉冲刺激前1h，每孔更换2-3ml新鲜的细胞分化培养基；

在第3天电脉冲刺激后即刻收集细胞，分别测定乳酸和atp含量；同时在第3天电脉冲刺激后3h收集细胞，分别检测肌球蛋白重链亚型myhci、myhciia、myhciix和myhciib的mrna含量；分别在第4天电脉冲刺激后12h、24h和36h收集细胞，测定甘油三酯含量；

同时，设定对照组，即不进行电脉冲刺激，其余同实验组；

步骤3：模型的建立

与对照组相比，当步骤2测定的实验组的第3天电脉冲刺激后肌管细胞中乳酸含量显著升高，即独立样本t检验的显著性水平p值<0.05；且第3天电脉冲刺激后肌管细胞中atp含量显著降低，即独立样本t检验的显著性水平p值<0.05；且第3天电脉冲刺激后肌管细胞中肌球蛋白重链亚型出现显著改变时，即独立样本t检验的显著性水平p值<0.05；且第4天电脉冲刺激后12h、24h和36h的甘油三酯含量增加50％以上，即建立所述运动诱发骨骼肌细胞乳酸和甘油三酯堆积模型。

本发明的步骤2中，电脉冲电压范围为14v/10mm-30v/10mm，如果电压太小或过大均会出现肌管细胞不收缩问题。采用的频率为0.5hz-10hz，如果电脉冲频率过大，容易出现肌管细胞强直收缩，细胞膜和细胞器受损，细胞脱落死亡的问题。电脉冲每次时间为2-3小时，如果电脉冲刺激时间过短，细胞不出现收缩问题。采用4d电脉冲方案诱发脂滴堆积，是考虑细胞收缩后恢复的问题，采用长时间多次电脉冲刺激来诱发脂滴堆积。分化后肌管细胞存活时间有限问题，电脉冲时间过程不利于脂滴堆积。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，步骤1所述成肌细胞为c2c12肌管细胞。

采用上述进一步方案的有益效果是：上述细胞容易获得，且能够很好的反映电脉冲刺激后骨骼肌细胞产生的变化。

进一步，步骤1所述细胞培养基为含有体积百分数10％胎牛血清、体积百分数1％青链霉素的高糖dmem培养基。其中，高糖dmem，品牌为hyclone，货号sh30022.01，购自美国犹他州洛根市；10％胎牛血清，品牌ausvin，货号vs500t，购自澳大利亚；1％青链霉素，货号kgy0023，购自江苏凯基生物技术有限公司。

进一步，步骤1所述培养的条件为37℃、5％co2恒温培养8-10天，所述消化液为0.25％胰蛋白酶-edta消化液。

进一步，步骤1和步骤2所述细胞分化培养基均为含有体积百分数2％马血清、体积百分数1％青链霉素的高糖dmem培养基。其中，高糖dmem，品牌为hyclone，货号sh30022.01，购自为美国犹他州洛根市；1％青链霉素，货号kgy0023，购自江苏凯基生物技术有限公司。

进一步，步骤2采用rt-pcr方法检测所述肌球蛋白重链亚型的myhci、myhciia、myhciix和myhciib的mrna含量。

本发明的有益效果：

(1)本发明发现了电脉冲刺激诱导成肌细胞收缩,进而诱发乳酸分泌增多的现象，同时建立了4天电脉冲刺激小鼠成肌细胞且在电脉冲刺激后36h能够诱发细胞中甘油三酯堆积模型，从而得出无氧代谢糖酵解产物乳酸在运动训练诱导骨骼肌细胞脂滴堆积和线粒体功能蛋白增加方面承担重要角色。

(2)本发明建立的体外电脉冲刺激肌细胞收缩诱发能源物质脂滴堆积和线粒体功能增强，将有助于基础研究和临床上老年人肌力下降和卧床病人肌萎缩的骨骼肌功能恢复。

(3)本发明的方法简单，操作容易，适合规模化应用。

附图说明

图1为一次性电脉冲刺激(电压30v/10mm，频率0.5hz，单次时长2ms，共3h)对c2c12肌管细胞中乳酸含量的影响图。结果以平均值±标准误方式表示，样本数n＝3。与对照组相比，*p<0.05,**p<0.01。

图2为一次性为电脉冲刺激(电压30v/10mm，频率1hz，单次时长2ms，共3h)对c2c12肌管细胞中乳酸含量的影响图。结果以平均值±标准误方式表示，样本数n＝3。与对照组相比，*p<0.05,**p<0.01。

图3为一次性电脉冲刺激(电压30v/10mm，频率5hz，单次时长2ms，共3h)对c2c12肌管细胞中乳酸含量的影响图。结果以平均值±标准误方式表示，样本数n＝3。与对照组相比，*p<0.05,**p<0.01。

图4为一次性电脉冲刺激(电压30v/10mm，频率10hz，单次时长2ms，共3h)对c2c12肌管细胞中乳酸含量的影响图。结果以平均值±标准误方式表示，样本数n＝3。与对照组相比，*p<0.05,**p<0.01。

图5为一次性电脉冲刺激(电压30v/10mm，频率0.5hz，单次时长2ms，共3h)对c2c12肌管细胞中atp含量的影响图。结果以平均值±标准误方式表示，样本数n＝3。与对照组相比，*p<0.05,**p<0.01。

图6为一次性电脉冲刺激(电压30v/10mm，频率1hz，单次时长2ms，共3h)对c2c12肌管细胞中atp含量的影响图。结果以平均值±标准误方式表示，样本数n＝3。与对照组相比，*p<0.05,**p<0.01。

图7为一次性电脉冲刺激(电压30v/10mm，频率5hz，单次时长2ms，共3h)对c2c12肌管细胞中atp含量的影响图。结果以平均值±标准误方式表示，样本数n＝3。与对照组相比，*p<0.05,**p<0.01。

图8为一次性电脉冲刺激(电压30v/10mm，频率10hz，单次时长2ms，共3h)对c2c12肌管细胞中atp含量的影响图。结果以平均值±标准误方式表示，样本数n＝3。与对照组相比，*p<0.05,**p<0.01。

图9为一次性电脉冲刺激(电压30v/10mm，频率0.5-10hz，单次时长2ms，共3h)后c2c12肌管细胞中myhcimrna含量变化图。结果以平均值±标准误方式表示，样本数n＝3。与对照组相比，*p<0.05,**p<0.01。

图10为一次性电脉冲刺激(电压30v/10mm，频率0.5-10hz，单次时长2ms，共3h)后c2c12肌管细胞中myhciiamrna含量变化图。结果以平均值±标准误方式表示，样本数n＝3。与对照组相比，*p<0.05,**p<0.01。

图11为一次性电脉冲刺激(电压30v/10mm，频率0.5-10hz，单次时长2ms，共3h)后c2c12肌管细胞中myhciibmrna含量变化图。结果以平均值±标准误方式表示，样本数n＝3。与对照组相比，*p<0.05,**p<0.01。

图12为电脉冲刺激(电压30v/10mm，频率0.5-10hz，单次时长2ms，共3h)后c2c12肌管细胞中myhcllxmrna含量变化图。结果以平均值±标准误方式表示，样本数n＝3。与对照组相比，*p<0.05,**p<0.01。

图13为4种电脉冲刺激(共4天)对c2c12肌管细胞刺激后不同时间点细胞中甘油三酯含量的影响图。结果以平均值±标准误方式表示，样本数n＝6。与对照组相比，*p<0.05,**p<0.01。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1：细胞培养

小鼠成肌c2c12肌管细胞接种于含细胞培养基的100mm培养皿中，在37℃、5％co2恒温培养箱中培养1-2天。加入0.25％胰蛋白酶-edta消化液，进行细胞消化。然后，将消化后的细胞铺入6孔板(corning公司,纽约,美国)。当6孔板中细胞融合到90-95％时，将细胞培养基更换为细胞分化培养基，每24h更换一次细胞分化培养基，分化4-6天，得到肌管细胞。

其中，细胞培养基为含有体积百分数为10％胎牛血清、体积百分数为1％青链霉素的高糖dmem培养基。其中，高糖dmem，品牌为hyclone，货号sh30022.01，购自美国犹他州洛根市；10％胎牛血清，品牌ausvin，货号vs500t，购自澳大利亚；1％青链霉素，货号kgy0023，购自江苏凯基生物技术有限公司。

细胞分化培养基为含有体积百分数为2％马血清、体积百分数为1％青链霉素的高糖dmem培养基。其中，高糖dmem，品牌为hyclone，货号sh30022.01，购自为美国犹他州洛根市；1％青链霉素，货号kgy0023，购自江苏凯基生物技术有限公司。

0.25％胰蛋白酶-edta消化液，货号kgy0012，购自江苏凯基生物技术有限公司。

实施例2：电脉冲刺激

采用仪器c-paceepculturepacer(ionoptix公司,都柏林,爱尔兰)产生电脉冲刺激，使肌管细胞收缩。上述仪器能够发出双极性脉冲到悬挂在分化培养基中的c-dish碳电极上。

实验组：电脉冲刺激每天1次，共持续4天；其中，第1天和第2天：电压14v/10mm，单次脉冲时长2ms，频率1hz，每天总时长2h；第3天和第4天：电压30v/10mm，单次脉冲时长2ms，频率0.5-10hz，每天总时长3h(详见表1)；电脉冲刺激前1h，每孔更换2-3ml新鲜的细胞分化培养基。

表1实验组电脉冲刺激的具体参数

在第3天电脉冲刺激后即刻收集细胞，分别测定乳酸和atp含量；同时在第3天电脉冲刺激后3h收集细胞，采用rt-pcr方法分别检测肌球蛋白重链亚型myhci、myhciia、myhciix和myhciib的mrna含量；分别在第4天电脉冲刺激后12h、24h和36h收集细胞，测定甘油三酯含量；

同时，设定对照组，即不进行电脉冲刺激，其余同实验组。

实施例3：具体测定方法

细胞中乳酸含量测定、细胞中atp含量测定、实时荧光定量rt-pcr测定、总rna浓度测定、细胞中甘油三酯含量测定的具体方法，分别如下：

(1)细胞中乳酸含量测定

细胞中乳酸含量测定，使用乳酸比色法测定试剂盒(货号：#k607-100,biovision,milpitasca,usa)，测定方法依照说明书进行。

方法简单概括为：吸除培养液，按照6孔板每孔加入200μl乳酸试剂缓冲液的比例裂解细胞，置于冰上，用移液器反复吹吸细胞沉淀，8-10次，以充分裂解细胞；裂解后4℃、12,000g离心5min，收集上清液；将乳酸标准品(100nmol/μl)和乳酸试剂缓冲液按照体积比1:99混合，配制成1nmol/μl标准稀释液，然后依次取0μl、2μl、4μl、6μl、8μl和10μl加入96孔板中，然后用乳酸试剂缓冲液将每孔液体量调整到50μl，从而将标准品依次配制成0nmol/孔、2nmol/孔、4nmol/孔、6nmol/孔、8nmol/孔和10nmol/孔,以此来制作标准曲线；配制反应混合液，按照乳酸试剂缓冲液46μl、乳酸酶混合液2μl和探针2μl配方配制反应混合液，50μl/孔，根据样品总数配制适量反应混合液；抽取50μl/孔样品，然后依次加入50μl/孔反应混合液，室温下孵育30min，避光。最后，使用酶标仪(benchmarkplusmicroplatespectrophotometer,bio-rad,california,usa)在波长570nm下读取吸光度。

根据标准曲线计算出样品孔中乳酸含量(nmol)，根据公式样品乳酸浓度＝每孔中乳酸含量(nmol)/每孔中样品体积(μl)×样品稀释比例。样品中相对乳酸含量使用细胞总蛋白浓度进行校准。对于所有数据,都将进行至少3次生物学重复进行统计和分析。

(2)细胞中atp含量测定

细胞中atp含量测定使用atp检测定剂盒(货号：s0026，购自上海碧云天生物技术有限公司)，测定方法依照说明书进行。方法简单概括为：吸除培养液，按照6孔板每孔加入200μl裂解液的比例加入裂解液，裂解细胞，置于冰上，用移液器反复吹吸细胞沉淀，8-10次，以充分裂解细胞；裂解后4℃12,000g离心5min，取上清；把atp标准溶液用atp检测裂解液稀释成0.01μmol/l、0.03μmol/l、0.1μmol/l、0.3μmol/l、1μmol/l、3μmol/l和10μmol/l，用于标准曲线的测定；按照每个样品或标准品需100μlatp检测工作液的比例配制适当量的atp检测工作液，atp检测定剂稀释液和atp检测定剂的体积比为1:9，atp检测工作液保存在冰上；加100μlatp检测工作液到检测孔或检测管内。室温放置3-5min，以使本底性的atp全部被消耗掉，从而降低本底。在检测孔或检测管内加上20μl样品或标准品，迅速用枪(微量移液器)混匀，至少间隔2s后，用20/20luminometer化学发光检测仪(货号：e5311，美国promega-glomaxpromegaglomax)测定rlu值；根据标准曲线计算出样品中atp的浓度，相对atp含量用样品中蛋白浓度校准。

(3)实时荧光定量rt-pcr

细胞中总rna提取采用takaraminibestuniversalrna萃取试剂盒(货号9767，takara)，操作步骤按照试剂盒说明书进行。方法简单概括为：裂解液室温静置2min；将gdnaeraserspincolumn安放到2ml的收集管(试剂盒提供)上；将裂解液转移入到gdnaeraser离心柱中；12,000rpm，离心1min；保留2ml收集管中的滤液；加入与液体等体积的70％乙醇(此时可能会出现沉淀)，使用移液枪将溶液混合均匀；立即将混合液(含沉淀)全部转入到rna离心柱(含2ml收集管)中；12,000rpm，离心1min，弃滤液。将rnaspincolumn放回到2ml收集管中；将500μl的bufferrwa加入至rna离心柱中，12,000rpm离心30s，弃滤液；将600μl的bufferrwb加入至rna离心柱中，12,000rpm离心30s，弃滤液；将rnaspincolumn重新安置于2ml收集管上，12,000rpm离心2min；将rna离心柱安置于1.5ml的去rna酶收集管(试剂盒提供)上，在rnaspincolumn膜中央处加入50～200μl的rnasefreedh2o或0.1％depc处理水，室温静置5min；12,000rpm离心2min洗脱rna。

(4)总rna浓度的测定

使用微量分光光度计(nanodrop2000)测定总rna浓度，纯度要求：a260/a280比值在1.9-2.0，rna浓度＝a260×稀释倍数×0.04μg/μl。根据各个样品rna浓度将其浓度统一配成100ng/μl。

逆转录：mrna(100ng/μl)使用primescript^tmrtmastermix(perfectrealtime)(货号：rr036a，takara)来进行逆转录。具体反应体系如下表1。共20μl的反应体系，4μl5×primescriptrtmastermix(perfectrealtime)、10μl浓度为100ng/μlcdna和6μlrnasefreedh2o加入0.5ml离心管中，然后bio-rad上机，反转录程序为37℃、15min，85℃、5s，4℃、无穷。

表1逆转录反应体系

(5)实时定量rt-pcr

使用premixextaq^tmii(tlirnasehplus)(货号：rr820a，takara)试剂盒。按照剂盒说明书要求配制20μl的反应体系，在appliedbiosystems7500fastreal-timepcrsystem仪器上进行定量分析。按照下表所示配制pcr反应液(反应液配制在冰上进行)。然后进行realtimepcr反应。两步法pcr扩增标准程序：95℃预变性、30s；95℃、5s，60℃、30-34s；40个循环；之后熔解曲线程序95℃、15s，60℃、15s，95℃、60s(详见表2)。并且用核糖体18s1rna作为内参校准基因。pgc1α、myhci、myhciia、myhciix、myhciib、cytc、gpr81、mct1、mct4、il-6和18srrnamrna采用sybrgreen方法进行检测。引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司，序列如下表3，并且用18srrna进行内参基因校准。

定量方法用2-δδct表示基因的表达量。计算公式：

δδct＝[ct(实验组目的基因)-ct(18s1)]-[ct(对照组目的基因)-ct(18s1)]

表2qpcr反应体系

表3引物序列表

(6)细胞中甘油三酯含量测定

肌管细胞中甘油三酯含量采用组织甘油三酯酶法测定试剂盒(e1003，购自北京普利莱(applygen)基因技术有限公司)进行测定，操作步骤按照试剂盒说明书进行。

方法简单概括为：按照6孔板每孔加200μl裂解液比例加入裂解液，进行裂解细胞，先将细胞收集在1.5ml离心管中，室温静置10min，期间用移液器反复吹吸细胞沉淀，8-10次，以充分裂解细胞；另取500μl裂解液转移到1.5ml离心管中(余下的裂解液进行蛋白定量和westernblot测定)，70℃加热10min(组织量多时可出现絮状沉淀)，室温2000rpm离心5min，取一定量上清液用于酶学测定；配置工作溶液：取适量试剂r1和试剂r2按体积比4:1比例配制酶工作液，现用现配，立即使用或者4℃保存<1天，变色弃去；标准品稀释：用蒸馏水将4mm甘油标准品倍比稀释为1000μmol/l、500μmol/l、250μmol/l、125μmol/l、62.5μmol/l、31.25μmol/l、15.625μmol/l和7.8125μmol/l，同时设置0浓度对照反应管；取30μl样品或蒸馏水(作为空白管)，然后向样品中加入190μl酶工作液，37℃反应10min，然后在550nm波长下测量吸光度，吸光度读数使用酶标仪进行(benchmarkplusmicroplatespectrophotometer,bio-rad,california,usa)读数。根据标准样品读数绘制标准曲线，并计算样品中甘油三酯浓度。样品中相对甘油三酯含量使用细胞总蛋白浓度进行校准。对于所有数据,都将进行至少3次生物学重复进行统计和分析。

(7)数据统计方法

数据以平均数±标准误表示，用spss18.0统计软件进行处理。组间比较采用独立样本t检验(two-tailed,unpairedstudentttest)，显著水平取p<0.05，非常显著水平p<0.01。作图软件采用excel2010和graphpadprism5。

实施例4：模型的建立

与对照组相比，当步骤2测定的实验组的第3天电脉冲刺激后即刻肌管细胞中乳酸含量显著升高，即独立样本t检验的显著性水平p值<0.05；且第3天电脉冲刺激后即刻肌管细胞中atp含量显著降低，即独立样本t检验的显著性水平p值<0.05；且第3天电脉冲刺激后肌管细胞中肌球蛋白重链亚型出现显著改变时，即独立样本t检验的显著性水平p值<0.05；且第4天电脉冲刺激后12h、24h和36h的甘油三酯含量增加50％以上，即建立所述运动诱发骨骼肌细胞乳酸和甘油三酯堆积模型。

实施例5：结果

(1)一次性电脉冲刺激对c2c12肌管细胞中乳酸和atp含量的影响

为了筛选出能够诱导肌管细胞收缩显著升高乳酸的电脉冲刺激模型，分化4-6天的肌管细胞，先进行两天电脉冲刺激(电压14v/10mm，单次刺激时长2ms，频率1hz，电脉冲刺激总时间为每天2h)；第3天进行一次性高电压不同频率刺激(电压30v/10mm，单次时长2ms，频率分别为0.5hz、1hz、5hz和10hz，电脉冲刺激总时间3小时)。电脉冲刺激后即刻收集细胞测定细胞中乳酸和atp含量。结果如图1-4和5-8所示。

由图1-4可知，相对于对照组，一次性的电压30v/10mm、频率0.5hz-10hz、单次时长2ms和共3h的电脉冲刺激都能够非常显著增加c2c12细胞中乳酸含量(p<0.01)。

另外由图5-8可知，一次性的电压30v/10mm、频率1hz、单次时长2ms、共3h的电脉冲刺激和电压30v/10mm、频率10hz、单次时长2ms、共3h的电脉冲刺激均能显著降低刺激即刻时c2c12肌管细胞中atp含量(p<0.05)，同时发现电压30v/10mm、频率0.5hz、单次时长2ms、共3h的电脉冲刺激和电压30v/10mm、频率5hz、单次时长2ms、共3h的电脉冲刺激均能非常显著降低电脉冲刺激即刻时c2c12肌管细胞中atp含量(p<0.01)。这些数据表明：电脉冲刺激使c2c12肌管细胞出现收缩并消耗atp作为能源供应，同时这一电脉冲刺激方法能够使c2c12肌管细胞中乳酸显著或是非常显著升高。

本申请的目的是建立一种运动诱发骨骼肌细胞乳酸和甘油三酯堆积模型的建立方法，因此本申请的发明人认为上述方法能够用于模拟运动诱发机体骨骼肌收缩消耗atp并产生乳酸升高。

(2)不同电脉冲刺激对c2c12肌管细胞中肌球蛋白重链亚型mrna含量的影响

在第3天电脉冲刺激后3h收集细胞，采用rt-pcr方法分别检测细胞中肌球蛋白重链亚型myhci、myhciia、myhciib和myhciix的mrna变化情况。具体如图9-12所示。

由图9-12可知，电压30v/10mm、频率0.5hz或1hz、单次时长2ms，共3h的电脉冲刺激能够显著增加氧化型蛋白重链i型(p<0.05)和快肌纤维标志性肌球蛋白重链iib型(p<0.05)。而电压30v/10mm、频率5hz、单次时长2ms共3h的电脉冲刺激对骨骼肌肌球蛋白重链四种亚型影响不明显。

令本发明的申请人疑惑的结果是：电压30v/10mm、频率10hz、单次时长2ms共3h的电刺激非常显著降低myhci、myhciia和myhciib亚型的mrna含量(p<0.01)，却能显著增加myhciix亚型mrna含量(p<0.01)。这些结果表明：电脉冲刺激触发骨骼肌纤维类型的重新装配，电压30v/10mm、频率0.5hz或1hz、单次时长2ms共3h的电脉冲刺激能够显著增加骨骼肌氧化型和快速收缩型肌纤维含量，而电压30v/10mm、频率10hz、单次时长2ms，共3h的电脉冲刺激相对c2c12细胞来说强度较大，主要以提高快缩型myhciib亚型为主。

(3)电脉冲刺激诱发c2c12肌管细胞中甘油三酯堆积模型建立

不同电脉冲频率刺激和刺激后不同细胞收集时间对c2c12肌管细胞中甘油三酯含量的影响，见图13。分化4-6天的肌管细胞进行电脉冲刺激。c2c12肌管细胞分为3个实验组，分别为电压30v/10mm、频率0.5hz、单次时长2ms组，电压30v/10mm、频率1hz、单次时长2ms组和电压30v/10mm、频率5hz、单次时长2ms组。分别在每组电脉冲刺激后的12h、24h和36h收集细胞，采用比色法检测细胞中甘油三酯含量。

由图13可知，与对照组相比，电脉冲刺激后12h，3个实验组的肌管细胞中甘油三酯含量均没有出现变化。

与对照组相比，电脉冲刺激后24h，实验组(电压30v/10mm、频率0.5hz、单次时长2ms组、电压30v/10mm、频率1hz、单次时长2ms组和电压30v/10mm、频率5hz、单次时长2ms组)肌管细胞中甘油三酯含量均增加但无显著性。

与对照组相比，电脉冲刺激后36h，电压30v/10mm、频率0.5hz、单次时长2ms组和电压30v/10mm、频率5hz、单次时长2ms组的细胞中甘油三酯含量显著增加(p<0.05)，电压30v/10mm、频率1hz、单次时长2ms组的细胞中甘油三酯含量非常显著增加(p<0.01)。

基于这一结果，本发明的申请人认为，电压30v/10mm、频率0.5hz或1hz、单次时长2ms和电脉冲刺激后36h收集细胞的方法能够作为电脉冲刺激诱导骨骼肌细胞中甘油三酯堆积的模型。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。