一种非同源重组抑制剂筛选模型和筛选方法与流程

本发明涉及抗癌药物研究领域，具体涉及利用斑马鱼胚胎发育特性构建一种新的非同源重组抑制剂药物筛选模型和筛选方法。

背景技术：

放射治疗(放疗)是利用不同能量的射线治疗恶性肿瘤的一种局部治疗手段，约50％的恶性肿瘤患者会接受不同形式的放疗，放疗最主要的作用是造成肿瘤细胞的dna双链断裂。化学药物治疗(化疗)是通过使用化学治疗药物杀灭癌细胞，其主要通过作用于肿瘤细胞周期来达到治疗目的。放疗和化疗后，肿瘤细胞通过各种修复机制进行修复，增加了肿瘤细胞的耐药性和肿瘤复发的几率。同源重组和非同源重组(nhej)是dna损伤修复机制中最主要的2条途径，尤以nhej常见。

nhej是基因组中修复dna双链断裂的一种重要途径，通常由紫外线照射,电离辐射,或极端的烷基化剂造成，其在促进细胞抵抗化疗和放疗伤害中起着非常重要的作用。nhej修复效率高，但相对不准确，在没有对同源模板做要求的情况下，它会吸收与dna相关的蛋白质加入dna末端。易出错或反常的dna修复会导致染色体易位，基因组重组，以及更高的突变率，这将为癌症细胞提供生存优势。nhej抑制剂可以阻止断裂的dna双链进行非同源重组修复，因此可以作为增敏剂在肿瘤治疗过程中使用，这已经逐渐成为一种直接的治疗手段或辅助治疗癌症的药物。

不仅如此，nhej抑制剂的使用还相对减少了放疗和化疗药物的有效剂量，阻止了与肿瘤和治疗相关的副作用的形成。然而，传统的药物筛选过程是非常复杂的。例如，通过建立含pi-sceⅰ酶切位点的总的非同源末端连接(totalnon-homologousendjoining，total-nhej)和非经典末端连接(alternativeendjoining，a-ej)修复底物的细胞株，设置特定的流式细胞术参数，定量检测依托泊苷(etoposide，vp-16)对非同源末端连接(non-homologousendjoining，nhej)修复的影响。此模型通过脂质体转染含修复底物的质粒，嘌呤霉素筛选，构建起nhej修复系统的稳定细胞株；运用流式细胞术和pcr技术对所构建的细胞株的基因组dna进行分析与鉴定；运用细胞免疫荧光及基因组dna琼脂糖凝胶电泳检测vp-16诱导的dna双链断裂(dnadoublestrandbreak，dsb)损伤，运用流式细胞术定量检测vp-16对nhej修复的影响。这些筛选过程繁琐，技术要求高，筛选周期长。相比之下，斑马鱼胚胎模型是一种简单，快捷，准确的可视化模型。国际化标准组织(iso)在20世纪80年代推荐斑马鱼为毒性实验的标志性实验鱼。经济合作与开发组织(oecd)的指导手册则将其列为健康毒性和环境毒性检测实验的标准鱼类，并制订了详细的操作指南。目前，斑马鱼已经成为国内外一种热门的药学研究工具，用于建立疾病模型，进行药物活性成份的高通量筛选及药物代谢的研究。oecd基于对刚受精的斑马鱼胚胎进行化学品接触测试，并预计可能产生的一般毒性。在24hpf和48hpf之间，记录4种典型的现象，以指示对斑马鱼产生的毒性作用：1.受精卵凝聚在一起；2.不能形成正常的体节；3.未出现尾部在卵黄囊的出芽；4.无心跳。以上毒理学检测标准刚好可以用来指示待测药品的细胞毒性，有一石二鸟的作用。以山东省科学院生物研究所为例，凭借斑马鱼，他们建立了国内首个以斑马鱼为实验模型的药物筛选技术研发服务平台，并借此建立了肿瘤、血栓、老年痴呆、骨质疏松、高血脂、糖尿病等人类重大疾病模型，能够用于新药活性筛选与评价。而国际上兴起的利用斑马鱼进行的高通量药物筛选技术也直接推动了新药研发的速度。

斑马鱼之所以可以作为人类肿瘤细胞非同源重组抑制剂的筛选模型，是因为药物在斑马鱼和人类体内有着相似的作用过程，同时斑马鱼胚胎发育还具有肿瘤细胞的发育特点，所以斑马鱼胚胎是一个理想的模型来描述不同癌症治疗药物的反应。

sv40转录终止子作为一个分子生物学载体构建过程中常用的功能片段，是许多终止子功能片段的一种，其长度为122bp，序列如seqidno.1所示。顾名思义，该片段的主要作用是在被转录复合物识别之后起到转录终止的作用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种关于非同源重组抑制剂的定性筛选模型。

本发明采用sv40转录终止子片段和斑马鱼胚胎用于非同源重组抑制剂筛选，其原因在于：其一，该片段的大小合适，不至于过大(难以发生随机整合)或者过小(随机整合频率过高，药物抑制效果不明显)；其二，斑马鱼胚胎早期发育过程中，基因组中非同源重组现象发生频繁，从上世纪80年代早期的转基因实验可以得到验证(注射的荧光表达基因被随机整合到基因组中，使斑马鱼胚胎表达荧光)。结合这两点，我们认为将具有转录终止作用的sv40转录终止子注射到斑马鱼胚胎内，借由频繁发生的非同源重组现象，使终止子片段被随机整合到斑马鱼基因组中，对整合处的基因表达起到阻断的作用，若发育相关的关键基因被阻断，则会导致胚胎的死亡。由于斑马鱼早期胚胎发育过程中，非同源重组频率很高，而sv40终止子片段会被大量整合到基因组中，因此只要控制好注射的sv40终止子的量，是可以实现利用胚胎的存活情况来定性检测药物是否具有非同源重组抑制剂的作用，并实现肉眼检测。

一种非同源重组抑制剂的筛选模型，是含有sv40转录终止子片段的斑马鱼胚胎。

本发明公开了斑马鱼胚胎在制备非同源重组抑制剂筛选模型中的应用。

本发明还公开了所述的非同源重组抑制剂模型在筛选抗癌药物中的作用。

本发明中sv40转录终止子片段的使用浓度为10ng/μl。

本发明还提供了一种非同源重组抑制剂筛选方法，是通过向所述的筛选模型中添加药物是否可以降低模型死亡率来定性筛选具有非同源重组抑制功能的药物。

所述的sv40转录终止子，本领域技术人员可以通过所熟知的方法获得，也可以通过下述一个具体方式获得：以pires2-egfp质粒(addgenecatalognumber:6029‐1,http://www.addgene.org/vector–database/3178/)作为模板通过pcr手段获得的，其中采用的引物序列为：f:aacttgtttattgcagcttataatggt(seqidno.2)，r:taagatacattgatgagtttggacaaac(seqidno.3)。

本发明通过注射sv40转录终止子导致胚胎致死现象来证实在斑马鱼胚胎发育早期非同源重组现象，并利用药物对胚胎致死率的缓解来证明药物的非同源重组抑制功能。

一个具体的过程如下：

⑴科学饲养斑马鱼，选健康的雄鱼和雌鱼，通过自然的交配繁殖产生受精卵，收集受精卵。

⑵通过显微注射的方法将sv40转录终止子片段注射进斑马鱼胚胎，其浓度为10ng/μl(实验表明，当sv40片段浓度为10ng/μl时，48小时后胚胎死亡率为100％，如图2所示)。

⑶药物处理的同时，注射sv40转录终止子片段的胚胎，设置实验组和对照组。

⑷48小时后，统计胚胎的死亡率，进行比较。

当使用sv40转录终止子和药物处理后，需观察48小时。

一种筛选模型，是控制sv40注射浓度为10ng/μl时，48小时胚胎死亡率为100％，通过添加药物是否可以降低死亡率来定性筛选具有非同源重组抑制功能的药物。

本发明先将sv40转录终止子片段注射进斑马鱼早期胚胎，后选用非同源重组抑制剂处理注射了sv40转录终止子片段的斑马鱼早期胚胎，致死亡率显著降低。本发明提供了新兴抗癌药物——非同源重组抑制剂筛选的新模型，对癌症治疗具有重要意义。

附图说明

图1注射sv40转录终止子导致斑马鱼胚胎存活率降低

图1a为sv40注射后胚胎存活率的统计，其中sv40实验组被注射了sv40转录终止子片段(5ng/μl)，对照组是没有注射的正常斑马鱼胚胎，结果显示注射sv40片段的胚胎存活率相比对照组显著降低。图1b为验证sv40是导致胚胎致死的真正原因，其中对照组1注入了等长但无终止子功能片段，对照组2注入了酚红溶液，结果显示注射sv40片段的胚胎存活率显著降低，而2个对照组的胚胎存活率与未注射组相同。在注射后，统计0小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时和168小时斑马鱼胚胎的存活率。采用2路方差分析方法对数据进行了分析，得到了平均方差，p<0.001，差异极显著，该结果说明，造成胚胎死亡的原因是注射的片段为sv40终止子片段。

图2不同浓度的sv40转录终止子片段对斑马鱼胚胎的存活率的影响

给正常的斑马鱼胚胎分别注射浓度为5ng/μl和10ng/μl的sv40转录终止子片段，统计注射后0小时、24小时、48小时斑马鱼胚胎的存活率，结果表明相比5ng/μl注射浓度，当注射浓度达到10ng/μl时胚胎48小时存活率最低，致死效果最显著。采用2路方差分析方法对数据进行了分析，得到了平均方差，p<0.0001，差异极显著。

图3dna印迹检测实sv40转录终止子片段整合进斑马鱼基因组

m,dl15000marker(takara)；条带1，没有注射sv40转录终止子片段的斑马鱼基因组，作为阴性对照；条带2，注射了sv40转录终止子片段(10ng/μl)后，从斑马鱼胚胎中分离出来的基因组；条带3，sv40片段的pcr产物，作为阳性对照。结果说明，斑马鱼胚胎在注射sv40终止子之后发生了该片段随机整合到基因组中的现象，证明了sv40注射致死的原因。

图4scr7影响注射了sv40转录终止子片段斑马鱼胚胎的死亡率

没有注射的正常斑马鱼胚胎作为对照；sv40+scr7‐代表斑马鱼胚胎注射了sv40(10ng/μl)，没有使用scr7；sv40+scr7+代表斑马鱼胚胎注射了sv40(10ng/μl)，并且使用了scr7(5μm)。采用2路方差分析方法对数据进行了分析，得到了平均方差，p<0.0001，差异极显著。结果说明，在scr7的作用下，注射了sv40的胚胎存活率得到了显著提高，而scr7的主要作用是非同源重组抑制剂，这样的结果一方面验证了我们对这个理论模型的实际应用推测，另一方面证实了该模型在裸眼检测中是可行的，作为非同源重组抑制剂筛选模型是具有其实际意义的。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

本实施例1中，先验证sv40转录终止子的致死作用，通过使用显微注射的方法将sv40转录终止子片段、等长但无终止子功能片段、水注射进受精卵，另设对照未注射组。验证sv40转录终止子的致死作用后，通过southernblot检测sv40是否在斑马鱼胚胎基因组中发生了整合。

具体包括如下步骤：

⑴科学饲养斑马鱼，选健康的雄鱼和雌鱼，通过自然的交配繁殖产生受精卵，收集受精卵。

⑵通过显微注射的方法将sv40转录终止子片段、等长但无终止子功能片段、水分别注射进受精卵，另设对照未注射组(图1)，数据显示，注射了sv40转录终止子片段的斑马鱼胚胎死亡率确实高于未注射的正常的斑马鱼胚胎。

⑶统计胚胎的死亡率(图2)，数据显示注射sv40终止子片段的斑马鱼胚胎存活率相比对照组大幅降低，同时随着浓度的提高，10ng/μl浓度注射组在48h存活率约为2％左右。

⑷通过southernblot检测在斑马鱼胚胎基因组中sv40是否发生了整合(图3)，结果显示注射sv40终止子(5ng/μl)的胚胎基因组中sv40片段发生了大量随机整合，同时作为阴性对照的野生型斑马鱼胚胎基因组中是不含有sv40片段的，而阳性对照使用的是注射所用的sv40片段，可以清晰的看到在约122bp处有一条清晰的杂交条带。

实施例2

本实施例2中，在向斑马鱼早期胚胎显微注射sv40转录终止子片段时，添加非同源重组抑制剂scr7，与未添加scr7时的死亡率进行对比，发现胚胎死亡率明显降低。

scr7(化学名：5,6-bis((e)-benzylideneamino)-2-thioxo-2,3-dihydropyrimidin-4(1h)-one；smiles：s＝c(nc(/n＝c/c1＝cc＝cc＝c1)＝c2/n＝c/c3＝cc＝cc＝c3)nc2＝o；分子式：c18h14n4os)是一种dna连接酶iv抑制剂，最初被用作抗癌药物。scr7的目标是dna结合酶iv的dna结合域，减少其对双链断裂(dsbs)的亲和力，并抑制其功能。

具体包括如下步骤：

⑴科学饲养斑马鱼，选健康的雄鱼和雌鱼进行交配，收集受精卵。

⑵设置两个实验组：不添加scr7仅注射sv40转录终止子片段的斑马鱼受精卵，添加scr7与sv40转录终止子片段一起注射的斑马鱼受精卵(图4)。

统计胚胎死亡率，进行对比。结果显示，在48小时，添加scr7的胚胎存活率从2％提高到了50％左右，与未用scr7处理组相比，胚胎存活率有了极显著提高，并且该结果是肉眼可见的，无需仪器设备检测。

sequencelisting

<110>扬州大学

<120>一种非同源重组抑制剂筛选模型和筛选方法

<130>

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>122

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

aacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcaca60

aataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatct120

ta122

<210>2

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

aacttgtttattgcagcttataatggt27

<210>3

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

taagatacattgatgagtttggacaaac28