荧光探针分子及其合成方法和在次氯酸根离子检测中的应用与流程

本发明涉及水样检测领域，特别是涉及荧光探针分子。尤其还涉及荧光探针分子合成方法和其在次氯酸根离子检测中的应用。

背景技术：

在日常生活中，一定量的次氯酸根离子常用于食物表面和水的杀毒。而从细胞生物学上看，次氯酸是由激活的中性细胞通过过氧化物酶(mpo)催化过氧化氯离子得到的；它作为一种重要的活性氧，在免疫系统中发挥着重要的作用。然而，如果次氯酸根离子含量出现异常，则会使人体产生神经衰弱、心血管疾病、关节炎和肾脏疾病等一系列疾病。由于次氯酸和次氯酸根在生物体系中扮演着如此重要的角色，检测水样和生命体系中的次氯酸含量越来越引起人们的关注。

相比于传统的其他荧光探针，比率型荧光探针能更好地消除大部分背景干扰。因此，设计和合成一种能快速、高灵敏、高选择性的实时检测的比率型荧光探针，对于改进现有的荧光检测方法是很有意义的。

技术实现要素：

基于此，有必要针对次氯酸根离子检测的问题，提供一种荧光探针分子及其合成方法和在次氯酸根离子检测中的应用。

一种荧光探针分子，荧光探针分子的结构如结构式a所示：

其中，r为甲基、乙基、丁基等烷基或苯基等芳香基团。

进一步地，r为甲基基团。一种荧光探针分子的合成方法，包括以下步骤：

将4-溴-1,8-萘二甲酸酐与甲胺反应生成化合物2；

将化合物2与水合肼发生取代反应生成化合物3；

将罗丹明b与三氯氧磷反应后，继续与化合物3反应生成结构式a所示的荧光探针分子。

将4-溴-1,8-萘二甲酸酐与甲胺反应生成化合物2的步骤为：

将4-溴-1,8-萘二甲酸酐溶于甲胺中，在50～100℃的条件下反应0.5～2小时得到所述化合物2。

进一步地，将化合物2与水合肼发生取代反应生成化合物3的步骤为：

将化合物2与水合肼在130℃条件下搅拌反应1h，停止反应并冷却室温，向反应溶液中加入水，分离析出的黄色固体并用水洗涤。

进一步地，将罗丹明b与三氯氧磷反应后，继续与化合物3反应的步骤为：

将罗丹明b溶于l,2-二氯乙烷，在保护气体的作用下，并缓慢加入三氯氧磷加热回流8h；停止反应，去除l,2-二氯乙烷，得到红色固体；

将红色固体溶于l,2-二氯乙烷中并缓慢加入至化合物3的l,2-二氯乙烷溶液中，加热搅拌回流反应12小时，除去溶剂残余物分离纯化得到荧光探针分子。

一种荧光探针分子在次氯酸根离子检测中的应用。

进一步地，包括以下步骤：

将上述荧光探针分子配制成10μm的荧光探针测试溶液，并加入测试水样，在410nm激发波长条件下激发，检测420nm-700nm的荧光发射光范围。

进一步地，在576nm和528nm的荧光光强比与次氯酸根离子的浓度呈线性正相关。

上述荧光探针分子，加入含次氯酸根离子的测试样品中，测试样品的颜色发生明显变化，并且其对次氯酸根离子的选择性好，且可以稳定地响应次氯酸。可采用通过测量不同波段的荧光光强比来计算次氯酸根离子的浓度，该测试过程无需进行复杂的理化测试方法，具有操作简单、快速高效、灵敏度高的优势。

附图说明

图1为荧光探针分子a溶液在加入次氯酸前后的颜色外观变化；图1a为uv灯下颜色外观变化图；图1b为日光灯下颜色外观变化图；

图2为荧光探针分子a中逐渐滴加naclo(0-50μmol/l)后的荧光发射光谱图；

图3为naclo浓度(0-100μmol/l)与荧光发射波长在528、576nm处强度比值的线性图；

图4为荧光探针分子a对于次氯酸根离子(clo^-)、超氧阴离子(o2^-)、过氧化氢(h2o2)、羟基自由基(oh·)等常见的活性氧物种和氯离子、高氯酸根等阴离子的荧光强度变化；图4a为荧光探针分子a中加入上述离子后的荧光发射光谱图；图4b为荧光探针分子a中加入上述离子后在576nm和528nm的荧光光强比。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

一种荧光探针分子，荧光探针分子的结构如结构式a所示：

其中，r为甲基、乙基、丁基等烷基或苯基等芳香基团。

上述荧光探针分子，包括两个荧光分子基团，一个是罗丹明b(红色荧光)，另一个是萘酐(绿色荧光)。加入含次氯酸根离子的测试样品中，测试样品的颜色发生明显变化，并且其对次氯酸根离子的选择性好，且可以稳定地响应次氯酸。可采用通过测量不同波段的荧光光强比来计算次氯酸根离子的浓度，该测试过程无需进行复杂的理化测试方法，具有操作简单、快速高效、灵敏度高的优势。

进一步地，r为甲基基团。

一种荧光探针分子的合成方法，包括以下步骤：

将4-溴-1,8-萘二甲酸酐与甲胺反应生成化合物2。

将化合物2与水合肼发生取代反应生成化合物3。

将罗丹明b与三氯氧磷反应后，继续与化合物3反应生成结构式a所示的荧光探针分子。

合成路线如下所示：

进一步地，将4-溴-1,8-萘二甲酸酐与甲胺反应生成化合物2的步骤为：

将4-溴-1,8-萘二甲酸酐溶于甲胺中，在50～100℃的条件下反应0.5～2小时得到化合物2。优选的反应条件为10～40℃的条件下反应1.5～3小时。

进一步地，将化合物2与水合肼发生取代反应生成化合物3的步骤为：

将化合物2与水合肼在130℃条件下搅拌反应1h，停止反应并冷却室温，向反应溶液中加入水，分离析出的黄色固体并用水洗涤。

进一步地，将罗丹明b与三氯氧磷反应后，继续与化合物3反应的步骤为：

将罗丹明b溶于l,2-二氯乙烷，在保护气体的作用下，并缓慢加入三氯氧磷加热回流8h；停止反应，去除l,2-二氯乙烷，得到红色固体；

将红色固体溶于l,2-二氯乙烷中并缓慢加入至化合物3的l,2-二氯乙烷溶液中，加热搅拌回流反应12小时，除去溶剂残余物分离纯化得到荧光探针分子。

一种荧光探针分子在次氯酸根离子检测中的应用。

荧光探针分子配制成荧光探针测试溶液中加入次氯酸根离子，颜色会有明显变化，可用于定性分析检测样品是否存在次氯酸根离子，操作简单，分析速度快。配制50μm的荧光探针测试溶液，在加入naocl(5equiv.)后的外观改变，如图1所示。uv灯照射下，显示蓝绿色的荧光探针测试溶液加入次氯酸根离子后呈鲜红色。在日光下，显示淡黄色的荧光探针测试溶液加入次氯酸根离子后呈暗红色。

进一步地，包括以下步骤：

将荧光探针分子配制成10μm的荧光探针测试溶液，并加入测试水样，在410nm激发波长条件下激发，检测420nm-700nm的荧光发射光范围。

进一步地，在576nm和528nm的荧光光强比与次氯酸根离子的浓度呈线性正相关。

实施例1

化合物2的合成

在100ml圆底烧瓶中加入4-溴-1,8-萘二甲酸酐(5g，18mmol)，加入54ml33％的甲胺溶液溶解，85℃条件下搅拌反应1h。停止反应，过滤得到固体粗产物，将固体充分干燥后用氯苯重结晶，得到4.43g灰白色的化合物2，收率83％。

m.p.172-174℃；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ3.56(s,3h),7.86(dd,j＝8.4hz&j＝0.8hz,1h),8.05(d,j＝7.6hz,1h),8.43(d,j＝8.0hz,1h),8.58(dd,j＝8.4hz&j＝1.2hz,1h),8.67(dd,j＝8.4hz&j＝1.2hz,1h).

化合物3的合成

在100ml圆底烧瓶中，依次加入化合物2(2.4g，8mm01)，水合肼(80％，25ml)，在130℃条件下搅拌反应1h。停止反应并冷却室温，向溶液中加入大量水，有黄色固体析出，过滤并用清水洗涤，得到得到1.66g黄色晶体化合物3，收率83％。

m.p.>260℃；¹hnmr(400mhz,d⁶-dmso)δ3.35(s,3h),4.67(s,2h),7.24(d,j＝8.4hz,1h),7.63(dd,j＝8.0hz&j＝7.6hz,1h),8.29(d,j＝8.4hz,1h),8.42(d,j＝7.6hz,1h),8.61(d,j＝8.0hz,1h),9.12(s,1h).

荧光探针分子a的制备

在100ml圆底烧瓶中加入罗丹明b(478mg，1.08mm01)，加入15ml干燥的l,2-二氯乙烷做溶剂，使罗丹明b完全溶解，n2保护。用注射器慢慢滴加0.5ml的三氯氧磷，加热回流8h。停止反应，减压蒸馏掉l,2-二氯乙烷，剩余红色固体直接进行下一步合成。

另外取一个干燥的100ml圆底烧瓶，加入化合物3(0.5g，2.1mmol)，10ml干燥的l,2-二氯乙烷做溶剂，搅拌15分钟后，将上一步反应获得的红色固体先用10ml干燥的l,2-二氯乙烷溶解，之后再慢慢滴加入化合物3的溶液中，加热搅拌回流过夜。反应结束后，旋转蒸发仪旋除溶剂。残余物通过硅胶柱层析分离纯化，二氯甲烷作为洗脱剂，得到272mg棕色固体状探针分子1，收率为38％。

m.p.181-184℃；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ1.09(t,j＝7.2hz,12h),3.24～3.36(m,8h),3.47(s,3h),6.09(s,2h),6.23(d,j＝8.4hz,2h),6.45(d,j＝8.8hz,2h),6.48(d,j＝8.4hz,1h),7.24(d,j＝8.0hz,1h),7.29(d,j＝7.6hz,1h),7.58～7.67(m,2h),7.88(d,j＝8.8hz,1h),7.97(d,j＝8.4hz,1h),8.03(d,j＝7.2hz,1h),8.28(d,j＝7.2hz,1h)；¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ12.45(ch3),26.88(ch3),44.36(ch2),67.35(ch),97.64(ch),104.74(c),107.83(ch),109.10(ch),113.72(c),120.07(c),122.03(c),123.55(ch),124.67(ch),125.12(ch),127.01(ch),128.43(ch),128.66(ch),130.37(ch),132.36(ch),133.57(ch),148.18(c),148.99(c),149.70(c),154.21(c),164.01(c＝o),164.50(c＝o),166.51(c＝o)；ei-msm/z665.4(m⁺)；hrms(ei)m/zcalcd665.2997forc41h39o4n5,observed665.3029.

r为乙基、丁基和苯基的荧光探针分子与r为甲基的荧光探针分子制备方法类似。

pbs缓冲溶液的配制

准确称取磷酸二氢钾1.70g，氢氧化钠395mg于250ml容量瓶中，用二次蒸馏水定容，摇匀，静置片刻，取1.0ml用ph计测量其ph为7.40，密封待用。

探针测试溶液的配置

用n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶解探针固体，得到1.0×10^-3mol/l的探针母液备用。测试时取0.03ml的1.0×10^-3mol/l探针母液，加入2ml的磷酸钾缓冲溶液(ph＝7.4)与dmf体积比为1：1的混合溶液，加入不同体积的次氯酸钠(0.01mol/l)，再用上述磷酸钾缓冲溶液与dmf的混合溶液定容至3ml；从而获得了含不同次氯酸钠浓度的探针分子1测试溶液(10μmol/l)。

荧光探针分子a对次氯酸根离子的荧光光谱滴定研究

为了进一步考察荧光探针分子a对次氯酸根离子识别的灵敏度，本发明在探针分子1的溶液(10μmol/l)中逐渐滴加0-100μmol/l的次氯酸钠，并测试其荧光发射光谱的变化。从图2和图3中可以看出，随着次氯酸钠浓度的增加，荧光发射波长在528nm处的强度逐渐降低，同时荧光发射波长在576nm处的强度逐渐増强；溶液的颜色呈现出明显的由绿变红现象。并且如图3所示，在576nm和528nm的荧光光强比与次氯酸根离子的浓度呈线性正相关。

荧光探针分子a对次氯酸根离子的识别选择性

选择性高低是决定荧光探针性能的重要条件，所以本项工作还探究了探针分子1对其他常见生物分子和金属离子的荧光响应情况，包括次氯酸(hclo)、超氧阴离子(o^2-)、羟基自由基(·oh)、过氧化氢(h2o2)等常见的活性氧物种和氯离子、高氯酸根离子、硝酸根离子、硫酸根离子对探针分子1的影响进行了测试，测定结果如图4所示。

从图4a和4b中可以看出，只有加入次氯酸之后，荧光探针分子a的528nm和576nm处荧光强度才发生显著增强，其他物质基本没有变化。这一结果表明，荧光探针分子a对次氯酸根离子的选择性是专一的，且可以稳定地响应次氯酸。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。