一种利用海藻糖提高丙酸产量的方法与流程

本发明涉及生物领域中的一种提高产酸丙酸杆菌产丙酸的方法。
背景技术：
：丙酸是一种无色透明的液态羧酸，强烈的刺激性气味和腐蚀性，丙酸作为一种重要的化工原料，丙酸及其衍生物应用非常广泛，主要应用于有机合成、食品、饲料、橡胶和医药等领域。丙酸及其钠、钙盐对霉菌和嗜氧芽孢杆菌具有良好的抑制作用，且对人体基本无害，因此，常用于谷物和饲料的防腐及食品的保鲜；丙酸酯类作为重要的溶剂和香料在食品和饮料制造中得到广泛应用；丙酸盐、丙酸氯和丙酸酐常用于农药、医药领域是重要的中间体；此外，丙酸还可用于生产电镀助剂、增塑剂、乳化剂以及生物降解塑料。近年来随着农业、食品、医药等工业的发展，对丙酸的需求量也在日益增加，使丙酸的应用优势得以充分发挥，潜在市场进一步扩大了。目前美国是世界上丙酸生产和消费的主要国家。而依赖我国的丙酸产量满足市场需求远远不能满足的，仍需通过大量进口来弥补。目前，生产丙酸的方法有化学合成法和微生物发酵法，工业化生产丙酸主要依赖化学合成法，以石油等化工产品为原料，经过加温、加压利用催化剂合成丙酸。在当前全世界面临环境污染、能源短缺等的严峻情况下，由于微生物发酵生产丙酸能减轻对环境造成的压力以及降低对石油等不可再生能源的依赖，微生物发酵法生产丙酸为丙酸合成提供了新的思路，同时得到了越来越多研究者的关注。用于丙酸发酵的菌株主要是丙酸杆菌属，是一类革兰氏阳性、不运动、不产芽孢、接触酶阳性的厌氧菌。产酸丙酸杆菌(propionibacteriumacidipropionici)是产丙酸的主要菌株之一，其最适ph值为6.5～7.5，培养温度为30℃，具有较强的丙酸生产能力。然而相对于目前市场的需求，微生物发酵法生产丙酸由于过低的丙酸产量受到抑制。大幅提高微生物发酵丙酸的产量、底物利用率以及生产强度成为主要的研究方向。目前文献所报道的提高丙酸产量的方法主要包括通过调控发酵方法，采用纤维床生物反应器发酵提高丙酸产量；通过在培养基中添加多种有机酸来控制丙酸代谢过程中关键代谢节点的通量，从而提高丙酸产量。关于通过过表达海藻糖合成途径提高丙酸产量的暂未文献报道。海藻糖是由两分子葡萄糖以α,α-1,1糖苷键构成的，是一种天然稳定的、无色无味、具有生物活性的非还原性糖，被称为天然安全的生命之糖，在自然界中普遍分布广泛的分布于生物体内，可作为糖类用作储存能量。但海藻糖更加引人注目的是，当一些生物体在遭遇冰冻、干旱和脱水等恶劣环境时，海藻糖的存在可以维持生命过程的稳定。各种研究表明，在不同的逆境胁迫条件下，海藻糖通过对生物体和生物大分子起到非特异性保护的作用，使生物体具备极强的适应恶劣环境的能力。迄今，至少5种海藻糖生物合成途径在各种生物体内被发现，已被详细研究的海藻糖生物合成途径主要有三种，以葡萄糖为底物的磷酸化酶法(tps-tpp途径)、以麦芽糖精为底物的酶转化法(trey-trez途径)、以麦芽糖为底物的分子内转糖基途径(tres途径)。其中tps-tpp途径最早被发现存在于在酵母菌中，在真核生物内这一途径，被称为otsa-otsb途径，海藻糖的合成大多数都是经otsa-otsb途径完成。本发明通过在产酸丙酸杆菌(p.acidipropionici)中过表达海藻糖合成途径，最终达到有效提高微生物发酵丙酸的产量。技术实现要素：本发明的目的在于通过过表达海藻糖合成途径，提供一种提高微生物发酵制备丙酸的产量的方法。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种利用海藻糖提高丙酸产量的方法，包括如下步骤：(1)选取产酸丙酸杆菌出发菌株，确定产酸丙酸杆菌出发菌株的海藻糖合成途径，构建海藻糖合成途径过表达的产酸丙酸杆菌基因工程菌株；(2)产酸丙酸杆菌基因工程菌株发酵制备丙酸。本发明的方法，所述产酸丙酸杆菌出发菌株选用产酸丙酸杆菌(p.acidipropionici)cgmcc1.2232；构建otsa基因合成过表达的产酸丙酸杆菌基因工程菌株。本发明的方法，取产酸丙酸杆菌cgmcc1.2232为出发菌株时，以产酸丙酸杆菌cgmcc1.2232中的otsa基因序列为模板，通过pcr扩增otsa基因片段，构建otsa基因片段载体质粒，并导入产酸丙酸杆菌cgmcc1.2232，获得otsa基因过表达的产酸丙酸杆菌基因工程菌株。其中；pcr扩增引物设计为：正向引物5’-atagatcaatgtccgaacccgttcagg-3’；反向引物为5’-tatccgcggtcactcgccctccagctggt-3’(含酶切位点sacⅱ)其中正向引物含含酶切位点bcli，反向引物含酶切位点sacⅱ。所述otsa基因片段载体质粒载体选用穿梭质粒pbresp36a。本发明的方法，所述步骤(2)中，将产酸丙酸杆菌基因工程菌株接种于50ml发酵培养基中，在30℃，ph7.0的无氧条件下培养24小时后，培养液以5％的比例分别接种于2l的发酵培养基中，在30℃，ph7.0的无氧条件下进行发酵培养。其中，发酵培养基的组成如下：酵母提取物10g；胰蛋白胨5g；磷酸氢二钾0.25g；硫酸锰0.05g；葡萄糖30g；0.05％刃天青指示剂2ml；蒸馏水定容至1000ml。本发明利用海藻糖的生物保护机制，可以维持生命过程的稳定，提高菌株自身耐受性，通过过表达海藻糖合成途径，增加细胞内海藻糖含量，提高菌株耐受性，克服大规模微生物发酵生产丙酸过程中的压力，最终提高丙酸产量。附图说明图1是otsa基因过表达的产酸丙酸杆菌与野生型产酸丙酸杆菌在下于发酵培养基中，培养温度为30℃时菌体的od600值。图2是otsa基因过表达的产酸丙酸杆菌与野生型产酸丙酸杆菌在下于发酵培养基中，培养温度为30℃时丙酸的产量。具体实施方式下面结合具体实验操作，对本发明进一步说明，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。下述实施例中采用的产酸丙酸杆菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号cgmcc1.2232，为野生型菌株。实施例中，发酵产物中海藻糖含量检测步骤如下；(1)样品处理；取10ml发酵液，4℃条件下，以16，000g离心10min，弃上清；80％乙醇重悬，重悬液在100℃下煮沸5min，并以16，000g离心10min，取上清，经0.22μm滤膜过膜后，加入磷酸盐缓冲液(100mm，ph5.7)，使最终体积达到1ml。反应体系：100μl样品，100μl磷酸盐缓冲液(100mm，ph5.7)，800μl蒸馏水，和10μl海藻糖酶，催化时间1h，并通过沸水浴5min终止催化。(2)检测方法；利用高效液相色谱(hplc)检测分析样品，色谱条件(hplc-ri)如下：柱温45℃，流动相为77％乙腈和23％蒸馏水，流速0.6ml/min，进样量20μl。(3)海藻糖的线性范围；准确称量0.6g海藻糖标准品于100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释并定容，得到6g/l的海藻糖标准品溶液，将上述溶液稀释得到4g/l、2g/l、1g/l、0.5g/l标准品溶液。发酵产物中丙酸含量的检测步骤如下：(1)样品处理；取2ml发酵液，加入1ml1mh2so4、1ml蒸馏水混匀，以8000g离心1min，取上清，稀释，经0.22μm滤膜过膜后使用hplc法测定丙酸含量。(2)检测方法；用高效液相色谱(hplc)检测分析样品，色谱条件(hplc)如下：柱温65℃，流动相为5mmh2so4，流速1.0ml/min，进样量20μl，紫外吸收波长为214nm。(3)丙酸的线性范围；准确量取2.97ml丙酸标准品于100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释并定容，得到30g/l的丙酸标准品溶液，将上述溶液稀释得到15g/l、10g/l、7.5g/l、5g/l、3g/l标准品溶液。实施例1本实施例说明产酸丙酸杆菌基因工程菌株的构建过程。1.产酸丙酸杆菌的培养；(1)菌株冻干粉的活化1)用浸过75％酒精的脱脂棉擦净安剖瓶；将安剖瓶顶端在火焰上加热，注意避免直接加热菌体或加热过度；将无菌水滴至加热过的安剖瓶顶端，使玻璃开裂；用锉刀或镊子敲下已开裂的安剖瓶的顶端；2)吸取0.3ml-0.4ml种子培养基或无菌水，滴入安剖瓶内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解成悬浮状液体将菌悬液，转接于50ml种子培养基中，在30℃，ph7.0的厌氧条件下培养。种子培养基的组成如下：酵母提取物5g；胰蛋白胨5g；磷酸氢二钾(k2hpo4)0.25g；硫酸锰(mnso4)0.05g；葡萄糖5g；0.05％刃天青指示剂2ml；蒸馏水定容至1000ml。培养所需的厌氧环境是由80％n2、10％h2和10％co2的混合气组成，一般注入达到1个大气压的量。(2)产酸丙酸杆菌的发酵培养；将步骤(1)获取的菌液以5％的比例接种于50ml的发酵培养基中，在30℃，ph7.0，的无氧条件下进行传代培养。发酵培养基的组成如下：酵母提取物10g；胰蛋白胨5g；磷酸氢二钾(k2hpo4)0.25g；硫酸锰(mnso4)0.05g；葡萄糖30g；0.05％刃天青指示剂2ml；蒸馏水定容至1000ml。培养所需的厌氧环境是由80％n2、10％h2和10％co2的混合气组成，一般注入达到1个大气压的量。2.基因序列的比对；利用ncbi基因库，确定产酸丙酸杆菌(p.acidipropionici)中海藻糖合成途径，分别为otsa途径以及trey途径。3.构建otsa合成过表达的工程菌株；(1)otsa基因序列的pcr扩增及测序；以产酸丙酸杆菌(p.acidipropionici)中的otsa基因序列(1485bp)为模板，正向引物为5’-atagatcaatgtccgaacccgttcagg-3’(含酶切位点bcli)；反向引物为5’-tatccgcggtcactcgccctccagctggt-3’(含酶切位点sacⅱ)；进行pcr扩增，并将扩增得到的目的片段经连接酶与线性化载体pgem-teasy进行连接，获取质粒pgem-otsaex，对质粒pgem-otsaex进行测序，验证结果。(2)工程菌株的构建；将测序结果正确的pgem-otsaex质粒经bcli与sacⅱ双酶切，回收otsa基因片段，同时对穿梭质粒pbresp36a进行bcli与sacⅱ双酶切，将otsa基因片段与酶切后的穿梭质粒pbresp36a进行连接构建重组质粒pbresp36a-otsa，将构建成功的重组质粒导入产酸丙酸杆菌，获得otsa基因过表达的工程菌株。实施例2本实施例说明利用实施例1的基因工程菌株在发酵生产丙酸中一种具体应用方式。将实施例1获取的工程菌株和p.acidipropionici野生型菌株分别接种于50ml的发酵培养基中，在30℃，ph7.0的无氧条件下培养24小时后，以5％的比例分别接种于2l的发酵培养基中，在30℃，ph7.0的无氧条件下进行发酵培养。发酵培养基的组成如下：酵母提取物10g；胰蛋白胨5g；磷酸氢二钾(k2hpo4)0.25g；硫酸锰(mnso4)0.05g；葡萄糖30g；0.05％刃天青指示剂2ml；蒸馏水定容至1000ml。50ml培养体系所需的厌氧环境由80％n2、10％h2和10％co2的混合气组成，一般注入达到1个大气压的量；2l发酵体系所需的厌氧环境由连续通入含量为99.999％高纯氮形成。实验设置三组平行试验，每隔10小时取样检测菌体od600值以及丙酸产量。海藻糖产量变化如表1所示。表1：otsa合成过表达对产酸丙酸杆菌(p.acidipropionici)海藻糖产量的影响菌株海藻糖(mg/ml)p.acidipropionici野生型菌株497±23otsa过表达基因工程菌906±47菌体od600值以及丙酸产量如图1、图2所示，可以看出，经otsa基因过表达构建的工程菌株丙酸产量提高了有一倍。当前第1页12