一种银纳米材料及其生物制备方法与应用与流程

本发明涉及银纳米材料的制备与应用技术领域，具体涉及银纳米材料的生物制备方法与应用。

背景技术：

银纳米材料具有非常稳定的物理化学性能，已在陶瓷和环保材料等领域得到了广泛的应用。目前，银纳米材料仍是研究的热点，应用前景较为广阔。

目前，银纳米粒子的制备方法多种多样，根据制备机理的不同，可分为以下几种：化学还原法、电化学法、光化学还原法、辐射法、激光烧蚀法、溶胶-凝胶法、真空蒸镀法、化学电镀法、晶种法等。而制备的银纳米材料可应用于光学、催化剂、抗菌材料等领域。

抑菌材料包括天然、有机、无机抑菌材料三大类型，与天然和有机抗菌材料相比，无机抗菌材料具有明显的毒性低、耐热性好，持续时间长，抗菌谱广，是一种具有良好商业前景的抗菌剂品种。

银离子作为一种抑菌性最强的金属离子，应用最早，且最广泛。微量的ag+对人体是有益的，却对微生物有破坏作用。银是一种历史悠久的抑菌剂，人们在古代就开始使用银器具保存食品，到20世纪初，硝酸银溶液就被外科创始人之一halstead用于处理伤口和烫伤。

无机抑菌材料的制备目前有物理、化学、生物方法，由于化学和物理方法制备涉及到有毒或放射性试剂，而生物方法因其具有可靠、绿色特点，成为近年来银纳米技术发展的趋势。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种银纳米材料，该银纳米材料为圆形的纳米颗粒材料，分散性好，粒度分布窄，颗粒粒径为6.66～28.89nm，且具有良好的抑菌效果。

本发明的目的还在于提供所述的一种银纳米材料的生物制备方法，该方法采用分离自铁皮石斛根部的内生真菌fusariumsacchariscut951(保藏号cctccno.m2017299)生物胞外合成所述银纳米材料，反应条件温和、易于控制。

本发明的目的还在于提供所述的一种银纳米材料在制备抑菌材料中的应用，由于所述银纳米材料具有良好的抗菌活性，因此将该银纳米材料应用于抑菌材料的制备中，具有良好的应用前景。

本发明的目的通过如下技术方案实现。

一种银纳米材料的生物制备方法，包括如下流程：

fusariumsacchariscut951菌株活化→种子培养液→发酵培养→抽滤获取菌丝→菌丝于无菌去离子水中培养→抽滤获取滤液→加入agno3反应→材料获取。

一种银纳米材料的生物制备方法，具体包括如下步骤：

(1)将铁皮石斛内生真菌fusariumsacchariscut951菌株活化后，进行种子液培养，将得到的种子液再进行发酵培养；

(2)将步骤(1)最终得到的培养液进行抽滤，无菌去离子水冲洗，获得的菌丝于无菌去离子水中培养后，再次抽滤，往得到的滤液中加入agno3进行反应；反应结束后，离心、收集沉淀，得到所述银纳米材料。

进一步地，步骤(1)中，所述铁皮石斛内生真菌fusariumsacchariscut951菌株分离自铁皮石斛根部，拉丁名为fusariumsacchariscut951，保藏号为cctccno.m2017299。

进一步地，步骤(1)中，所述活化是在无菌条件下，采用试管斜面培养方法于28±1℃活化培养48～72小时，培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)。

进一步地，步骤(1)中，所述种子液培养是在无菌条件下，采用马铃薯葡萄糖水培养基(pdb)，于28±1℃、转速120rpm摇床培养48～72小时。

进一步地，步骤(1)中，所述发酵培养是在无菌条件下，将得到的种子液按照10v％的接种量接入液体培养基中，于温度28±1℃、转速120rpm条件下培养3～4天。

进一步地，步骤(2)中，所述无菌去离子水采用milli-q去离子水。

进一步地，步骤(2)中，所述在无菌去离子水中培养是在无菌条件下，温度28±1℃、转速120rpm条件下培养24～48h。

进一步地，步骤(2)中，所述加入agno3进行反应过程中，保持加入的agno3的浓度在1mmol/l。

进一步地，步骤(2)中，所述反应是在室温、转速120rpm的条件下反应24～48h。

进一步地，步骤(2)中，所述离心是在温度4℃、12000g离心20min。

所述活化、种子液培养、发酵培养、抽滤以及无菌去离子水中培养的过程，均是在无菌条件下进行。

本发明银纳米材料的制备原理：在fusariumsacchariscut951菌株的生长培养过程中，fusariumsacchariscut951菌株会产生还原酶，该还原酶促使ag⁺离子被还原为ag，生成所述的银纳米材料。

由上述任一项所述制备方法制得的一种银纳米材料，为圆形或椭圆形纳米颗粒材料，颗粒的粒径为6.66～28.89nm。

所述的一种银纳米材料具有良好的抗菌活性，对于包括热带假丝酵母、蜡样芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产碱杆菌以及沙门氏菌在内的测试菌均有较好的抑制作用；将所述银纳米材料应用于抑菌材料的制备，包括抗菌膜涂料的开发制备。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

(1)本发明提供了银纳米材料的生物制备方法，工艺过程简单易行，反应条件温和、易于控制，且采用生物方法制备银纳米材料，避免了化学、物理方法中的有毒或放射性试剂，具有可靠、绿色的优点；

(2)本发明的银纳米材料为圆形或椭圆形的纳米颗粒材料，分散性好，粒度分布窄，且具有良好的抑菌效果，将银纳米材料应用于抑菌材料的制备中，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为实施例1中加入agno3的细胞滤液在紫外-可见分光光度计下的440nm特征吸收曲线图；

图2为实施例1中制备的银纳米材料的透射电子显微镜图。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图对本发明技术方案作进一步阐述，但本发明不限于此。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件、实验室手册中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。

本发明具体实施例中采用的铁皮石斛内生真菌菌株fusariumsacchariscut951于2017年6月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市武昌路珞珈山武汉大学，邮编430072)，保藏号为cctccno.m2017299；该菌株的核糖体内转录间隔区(its)和5.8s核糖体rna编码基因(5.8srdna)如seqidno.1所示。

本发明具体实施例中的银纳米材料的抑菌活性采用如下方法进行测试观察，具体流程如下：

病原菌菌株活化→种子液培养→平板涂布接种→含银纳米材料滤纸片接种→培养→抑菌效果观察。

实施例1

银纳米材料的生物制备，制备流程如下：

fusariumsacchariscut951菌株活化→种子培养液→发酵培养→抽滤获取菌丝→菌丝于无菌去离子水中培养→抽滤获取滤液→加入agno3反应→材料获取。

具体制备过程包括如下步骤：

(1)取铁皮石斛内生真菌菌株fusariumsacchariscut951菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的固体pda培养基试管，于28±1℃活化培养72小时；

(2)取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体pdb种子培养基中，于28±1℃、120rpm摇床培养72小时，得种子液；

(3)在无菌条件下，按10v％(体积百分比)接种量接入500ml液体培养基中，于28±1℃、120rpm摇床发酵培养3天；

(4)将发酵液于无菌条件下真空抽滤，菌丝体用无菌水冲洗，去除残留培养基成分；

(5)将收获的菌丝体(湿重20g)重新接种于含有200mlmilli-q去离子水的500ml锥形瓶中，28±1℃、120rpm培养24小时；

(6)过滤除去菌丝体，在收集培养液的加入agno3，并确保agno3最终浓度为1mmol/l，反应液于25℃、120rpm反应24h；反应液于紫外可见分光光度计200-800nm波长扫描，确定有银纳米材料生成；

加入agno3的细胞滤液在紫外-可见分光光度计下的440nm特征吸收曲线图如图1所示，由图1可知，在细胞滤液中加入agno3与在细胞菌体中添加agno3后样品都在440nm处有一吸收峰，这和纳米银的特征共振吸收峰完全一样，证明有这两个样品均有银纳米材料形成；而作为对照，单独的细胞滤液和于440nm处均没有吸收，agno3在250～800nm波长范围内均没有吸收，表明无纳米银的生成。

(7)反应结束后，反应液于12000g、4℃离心20分钟收集沉淀，干燥后透射电子显微镜表征结构。

制备的银纳米材料的透射电子显微镜图如图2所示，由图2可知，制备的银纳米材料为圆形或椭圆形颗粒材料，颗粒粒径在6.66～28.89nm。

对比例1

对比例空白对照组制备纳米材料的步骤与实施例1相同，不同在于，空白对照组不加入agno3进行反应。

实施例2

将实施例1和对比例1得到的纳米材料进行抑菌活性的测试观察，抑菌活性评价采用滤纸片法，流程如下：

病原菌菌株活化→种子液培养→平板涂布接种→含银纳米滤纸片接种→培养→抑菌效果观察。

抑菌活性观察，具体包括如下步骤：

(1)取选用的7种常见致病菌：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、蜡样芽胞杆菌、热带假丝酵母及产碱杆菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌落，接入已灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基(固态)试管，于37±1℃活化24小时；

(2)取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体牛肉膏蛋白胨液体培养基(液态)中，于37±1℃、160rpm摇床培养24小时，得种子液；

(3)在无菌条件下，按2v％(体积百分比)接种量接入10ml液体lb平板培养基中，晃动平板，使种子液和lb液体培养基混合均匀，超净工作台中待其凝固；

(4)将经过在实施例1中铁皮石斛内生真菌fusariumsacchariscut951胞外合成的银纳米材料胶质溶液中浸泡的滤纸片(φ＝0.6cm，已灭菌)，采用同样方法将滤纸片(φ＝0.6cm，已灭菌)浸泡于对比例1的胶质溶液中；无菌风干后，接种在涂布致病菌的牛肉膏蛋白胨平板培养基，37℃倒置培养48小时；

(5)将制好后的测试菌培养皿置于37℃的培养箱中恒温培养24h后观察，测其抑菌圈的大小。

抑菌圈的观测结果如表1所示。

表1实施例1和对比例1的纳米材料抗菌活性结果

由表1可知，实施例1合成的银纳米材料对所选的7种常见致病菌的抑菌圈均远大于对比例1纳米材料的抑菌圈，说明实施例1合成的银纳米材料对所选7中常见致病菌有明显的抗性，具有明显的抑制常见致病菌的作用。

应当理解，以上具体实施例仅在于对本发明技术方案进一步理解的阐述，而不用于限制本发明的范围。此外，在阅读了本发明讲述的内容后，本领域技术人员对本发明实施例所作的各种改动、修改或替换的等价方案，将同样落于本申请所附权利要求所限定的范围。

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<110>华南理工大学

<120>一种银纳米材料及其生物制备方法与应用

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<213>铁皮石斛内生真菌（fusariumsacchari）

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