本发明涉及食品加工技术领域，具体地涉及一种具有ace抑制和dpp-iv抑制功能的蛹虫草蛋白肽及其制备方法。
背景技术：
血管紧张素转化酶(angiotensiniconvertingenzyme，ace)为肾素-血管紧张素系统的关键酶。血管紧张素原在肾素的作用下转化为血管紧张素i，血管紧张素i在ace的作用下转化为血管紧张素ii，刺激血管收缩，造成血压上升。抑制ace的活性对降低血压有着积极的作用，因而开发有效的ace抑制剂引起人们的极大关注。虽然来源于食物的ace抑制肽比人工合成的ace抑制剂作用弱，但是它有其独特的优点，不会产生降压过度的问题，安全性高，无副作用，除降压功能外，往往同时具有免疫促进、易消化吸收等功能。由于药物疗法存在副作用，天然食物中的降血压功能因子的开发利用将成为今后高血压非药物治疗的重要部分。
现有技术中关于ace抑制肽开发的报道，主要是通过酶解的方法从水产动物体或牛乳乳清蛋白源获得ace抑制肽，酶解过程通常都需要通过添加酸或碱来调节体系的ph值，这无疑影响了获得的ace抑制肽产品的功能特性，且增加了操作的繁琐程度，这些方法均不同程度地增加了操作步骤和生产成本，制约了产业化规模化ace抑制肽的生产及蛋白肽的得率。目前国内外专利中未见利用蛹虫草为原料制备同时具有dpp-iv抑制功能和ace抑制功能的蛹虫草蛋白肽的报道。
降血糖功能因子是指能降低糖尿病患者血糖浓度以及改善其症状的生物活性成分。目前研究较多的天然产物类降糖因子、矿物质类降糖因子、维生素类降糖因子，其作用机理各不相同。天然产物类降糖因子按化学结构可分为黄酮类、活性多糖类、生物碱类、皂甙类、萜类、多肽类等。自人工合成胰岛素以来，磺脲类药物、双胍类、胰岛素增敏剂、糖抑制剂等各种口服或注射的药物相继问世，然而化学药物常产生一定的毒副作用，天然降血糖成分具有作用温和而持久，性质稳定，几乎无毒性反应，还可多种降糖成分并存，综合起作用等优点，备受患者以及和医学界的青睐，也成为了降血糖功能因子的主要研究方向。
dppiv二肽基肽酶(一种负责降解glp1的酶)：其作用是使glp-1分裂，降解，dppiv是一种能使促胰岛素激素glp-1迅速失活的酶。抑制dpp-iv能提高glp-1及其他生物活性肽的激素活性，从而刺激胰岛素的释放，减少胰高血糖素的分泌，有利于2型糖尿病患者血糖高水平的调节。
本发明针对目前蛹虫草蛋白产品开发的现状，利用蛹虫草粉为原料，在不添加任何酸和碱条件下，利用多种蛋白酶复合酶解，通过膜分离和凝胶分离技术，开发了同时具有特定降血压和降血糖功能的蛹虫草蛋白肽，建立简单高效的多功能的蛹虫草蛋白肽的制备方法。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的是在于提供一种具有ace抑制和dpp-iv抑制功能的蛹虫草蛋白肽。
本发明的另一目的在于提供上述蛹虫草蛋白肽的制备方法。
本发明的再一个目的在于提供上述蛹虫草蛋白肽的应用。
为了实现上述技术目的，本发明提供了一种具有ace抑制和dpp-iv抑制功能的蛹虫草蛋白肽，包括以下步骤:
(1)清洁的蛹虫草打成粉加水，在高温下处理、得到蛹虫草液；
(2)超声处理蛹虫草液；
(3)加入复合蛋白酶酶解，酶解过程同步进行超声处理；高温下保温，冷却后，过滤分离，收集分离液；
(4)分离液通过二步超滤法处理；
(5)滤液过柱分离，收集洗脱峰，即得。
步骤(1)水与蛹虫草粉的质量比为15-20:1，所述高温下处理为100-121℃搅拌1-4小时。
步骤(2)超声处理方法为将步骤(1)得到的蛹虫草液调至65-75℃，80-100kh的超声频率处理15-25min。
本发明通过大量实验发现，蛹虫草液温度调至65-75℃进行80-100kh超声处理，效果最好，能够较好地改变蛹虫草蛋白的组织结构，使下面酶解步骤缩短酶解时间和使用较少的酶量，就能够获得优质的蛋白肽。
步骤(3)按照蛹虫草液总重量的0.2-0.8％的重量百分比加入复合蛋白酶，所述复合蛋白酶由碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶组成，三者质量比为1：(1-2):1。
步骤(3)的酶解条件为50-65℃酶解1.5-3.5小时；步骤(3)所述超声处理是25-40kh处理；步骤(3)酶解之后于90-95℃下保温10-20min，冷却至65-75℃，过滤分离，收集分离液。在本发明的实施例中，是通过硅藻土进行过滤分离，然后收集分离液。本领域技术人员可以采用任何具有等同效果的分离方式进行过滤分离。
步骤(4)的两步超滤法为先用孔径为5000d的膜超滤，再用孔径为2000d的膜超滤，得到分子量小于2000d的蛋白肽。
具体地，是利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于1500道尔顿的蛋白肽分离出来。
步骤(5)滤液过柱分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰，浓缩、冷冻干燥得到蛹虫草蛋白肽。
具体地，取分子量为小于2000的蛋白肽液，再经过sephadexg-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到蛹虫草蛋白肽；再用rp-hplc反相高效液相色谱进行分离，收集经过rp-hplc反相高效液相色谱分离中第9-10分钟洗脱出来的肽液；将步骤(5)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到蛹虫草蛋白肽粉。
通过lc-ms/ms对蛹虫草蛋白肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为nveidpe(天冬酰胺-缬氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-天冬氨酸-脯氨酸-谷氨酸)、siiaevk(丝氨酸-异亮氨酸-异亮氨酸-丙氨酸-谷氨酸-缬氨酸-赖氨酸)、rdltdy(精氨酸-天冬氨酸-亮氨酸-苏氨酸-天冬氨酸-酪氨酸)的肽的含量为85～95％，其中nveidpe(20-27％)、siiaevk(35-45％)、rdltdy(22-29％)。所述％均为质量百分比。
上述制备方法制备得到的蛹虫草蛋白肽属于本发明的保护范围。本发明通过实验发现，本发明上述方法制备得到的蛹虫草蛋白肽具有优异的dpp-iv抑制和ace抑制功能。
进而，本发明提供了该蛹虫草蛋白肽在制备降血压或降血糖药物中的应用。含有本发明方法制得的蛹虫草蛋白肽的食品、保健品或药物也属于本发明的保护范围。
本发明发现氨基酸序列如seqidno.1-3所示的肽均具有ace抑制功能和dpp-iv抑制功能。
进一步地，本发明提供了氨基酸序列分别如seqidno.1-3所示的肽在制备食品、保健品或药物中的应用。
本发明的优点在于：
(1)本发明提出蛹虫草蛋白肽制备全过程同步利用不同频率的超声波处理，制备方法简单，整个加工过程中没有添加酸或碱进行ph的调整，产品保持较好的功能特性，较易实现产业化生产。
(2)开发的蛹虫草蛋白肽具有很好的dpp-ⅳ抑制和ace抑制功能，制得的蛹虫草蛋白肽dpp-iv抑制活性(ic50值)低于190μg/ml,ace抑制活性(ic50值)低于305μg/ml，开发的蛹虫草siiaevk肽dpp-iv抑制活性(ic50值)为98μg/ml，nveidpe肽ace抑制活性(ic50值)为208μg/ml。
(3)本发明利用特定频率超声波技术处理的蛹虫草蛋白液，可以明显改善蛹虫草蛋白对酶的敏感性，降低酶的使用量。
(4)开发的产品安全，本发明采用多种食品级复合蛋白酶(碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶)，经在温和条件下，经过适度酶解获得特定分子量和肽组成的蛹虫草蛋白肽，不加任何添加剂，为100％蛹虫草蛋白肽。
(5)本发明开发的蛋白肽，具有良好的风味和色泽，能广泛应用于特需食品和营养食品。
(6)本发明开发蛋白肽中分子量小于2000的肽的比例为95％以上，具有非常明确的肽的组成。
具体实施方式
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除有特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公知的方法制得的产品。以下实施例的％均指质量百分比。蛹虫草粕购自购自沈阳瀚瑞达生物技术有限公司，中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶均购自诺维信(中国)投资有限公司。
实施例1具有dpp-ⅳ抑制和ace抑制功能的蛹虫草蛋白肽的制备
(1)选用干燥的蛹虫草100克，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,蛹虫草清洗后用粉碎机将蛹虫草打成粉，加入蛹虫草粉总量15倍的水在121℃条件下处理2小时，得到蛹虫草液。
(2)将(1)得到的蛹虫草液，温度调整到75℃，利用超声波发生器经超声波(频率为80kh)处理15分钟，改变蛹虫蛋白的组织结构。
(3)按照蛹虫草液中蛹虫草重量0.6％的重量百分比加入复合蛋白酶进行酶解(复合蛋白酶组成：碱性蛋白酶和中性蛋白酶、风味蛋白酶组成，它们之间的质量比为1：1：1)，在55℃条件下进行酶解反应3.0h，酶解过程同步利用超声波发生器(频率为40kh)处理；在95℃下保温10分钟，冷却至75℃，通过硅藻土进行过滤分离，收集分离液；
(4)将步骤(3)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来。
(5)取分子量为小于2000的蛋白肽液，再经过sephadexg-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到蛹虫草蛋白肽；再用rp-hplc反相高效液相色谱进行分离，收集经过rp-hplc反相高效液相色谱分离中第9-10分钟洗脱出来的肽液；
(6)将步骤(5)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到蛹虫草蛋白肽粉。通过lc-ms/ms对蛹虫草蛋白肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为nveidpe(天冬酰胺-缬氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-天冬氨酸-脯氨酸-谷氨酸)、siiaevk(丝氨酸-异亮氨酸-异亮氨酸-丙氨酸-谷氨酸-缬氨酸-赖氨酸)、rdltdy(精氨酸-天冬氨酸-亮氨酸-苏氨酸-天冬氨酸-酪氨酸)的肽的含量为88％，其中nveidpe(23％)、siiaevk(38％)、rdltdy(27％)。
实施例2具有dpp-ⅳ抑制和ace抑制功能的蛹虫草蛋白肽的制备
(1)选用干燥的蛹虫草500克，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,蛹虫草清洗后用粉碎机将蛹虫草打成粉，加入蛹虫草粉总量20.0倍的水在110℃条件下处理3小时，得到蛹虫草液。
(2)将(1)得到的蛹虫草液，温度调整到70℃，利用超声波发生器经超声波(频率为100kh)处理15分钟，改变蛹虫蛋白的组织结构。
(3)按照蛹虫草液中蛹虫草重量0.8％的重量百分比加入复合蛋白酶进行酶解(复合蛋白酶组成：碱性蛋白酶和中性蛋白酶、风味蛋白酶组成，它们之间的质量比为1：2：1)，在60℃条件下进行酶解反应3.5h，酶解过程同步利用超声波发生器(频率为25kh)处理；在90℃下保温15分钟，冷却至75℃，通过硅藻土进行过滤分离，收集分离液；
(4)将步骤(3)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来。
(5)取分子量为小于2000的蛋白肽液，再经过sephadexg-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到蛹虫草蛋白肽；再用rp-hplc反相高效液相色谱进行分离，收集经过rp-hplc反相高效液相色谱分离中第9-10分钟洗脱出来的肽液；
(6)将步骤(5)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到蛹虫草蛋白肽粉。通过lc-ms/ms对蛹虫草蛋白肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为nveidpe(天冬酰胺-缬氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-天冬氨酸-脯氨酸-谷氨酸)、siiaevk(丝氨酸-异亮氨酸-异亮氨酸-丙氨酸-谷氨酸-缬氨酸-赖氨酸)、rdltdy(精氨酸-天冬氨酸-亮氨酸-苏氨酸-天冬氨酸-酪氨酸)的肽的含量为90％，其中nveidpe(24％)、siiaevk(39％)、rdltdy(27％)。
实施例3具有dpp-ⅳ抑制和ace抑制功能的蛹虫草蛋白肽的制备
(1)选用干燥的蛹虫草1000克，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,蛹虫草清洗后用粉碎机将蛹虫草打成粉，加入蛹虫草粉总量18.0倍的水在100℃条件下处理4小时，得到蛹虫草液。
(2)将(1)得到的蛹虫草液，温度调整到65℃，利用超声波发生器经超声波(频率为100kh)处理20分钟，改变蛹虫蛋白的组织结构。
(3)按照蛹虫草液中蛹虫草重量0.8％的重量百分比加入复合蛋白酶进行酶解(复合蛋白酶组成：碱性蛋白酶和中性蛋白酶、风味蛋白酶组成，它们之间的质量比为1：2：1)，在60℃条件下进行酶解反应3.5h，酶解过程同步利用超声波发生器(频率为30kh)处理；在95℃下保温12分钟，冷却至65℃，通过硅藻土进行过滤分离，收集分离液；
(4)将步骤(3)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来。
(5)取分子量为小于2000的蛋白肽液，再经过sephadexg-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到蛹虫草蛋白肽；再用rp-hplc反相高效液相色谱进行分离，收集经过rp-hplc反相高效液相色谱分离中第9-10分钟洗脱出来的肽液；
(6)将步骤(5)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到蛹虫草蛋白肽粉。通过lc-ms/ms对蛹虫草蛋白肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为nveidpe(天冬酰胺-缬氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-天冬氨酸-脯氨酸-谷氨酸)、siiaevk(丝氨酸-异亮氨酸-异亮氨酸-丙氨酸-谷氨酸-缬氨酸-赖氨酸)、rdltdy(精氨酸-天冬氨酸-亮氨酸-苏氨酸-天冬氨酸-酪氨酸)的肽的含量为88％，其中nveidpe(23％)、siiaevk(37％)、rdltdy(28％)。
实施例4蛹虫草蛋白肽dpp-ⅳ抑制能力的测定试验
1、试验样品：样品1、2、3分别为实施例1、实施例2、实施例3制备的蛹虫草蛋白肽，样品4为实施例1粉碎得到的蛹虫草粉。
2、按照如下方法进行：
将样品用100mmol/l的tris-hcl(ph8.0)缓冲液稀释至合适的浓度，吸取25μl样品稀释液与25μl底物(浓度为1.6mmol/l)混合，加入到96孔酶标板中。在37℃下孵育10min后，加入50μldpp-iv酶液(酶活力为8u/l)，混匀后在37℃下精确孵育60min，立即加入100μl1mol/l的醋酸-醋酸钠(ph4.0)缓冲液终止反应，于405nm下测吸光值a，并根据下列公式计算样品的dpp-iv抑制率。
dpp-iv抑制率％＝{1-(样品吸光值a-样品空白对照吸光值b))/(阴性对照吸光值c-阴性空白对照吸光值d)}×100
样品吸光值a：为样品反应液在405nm处的吸光值；
样品空白对照吸光值b：以tris-hcl缓冲液代替dpp-iv酶液作为样品空白对照在405nm处的吸光值；
阴性对照吸光值c：以tris-hcl缓冲液代替样品作为阴性对照在405nm处的吸光值；
阴性空白对照吸光值d：以tris-hcl缓冲液代替dpp-iv酶液和样品作为阴性空白对照在405nm处的吸光值
dpp-iv抑制的ic50值测定：
测定样品在不同浓度下的dpp-iv抑制率，以多肽浓度的对数值与抑制率做回归曲线，得到回归方程，由此计算ic50，即50％的dpp-iv酶活性抑制是肽的浓度。
结果见表1，可见本发明蛹虫草蛋白肽具有很好的dpp-iv抑制能力，dpp-iv抑制活性(ic50值)低于190μg/ml，显著低于同类复合蛋白肽的ic50值，其中siiaevk肽具有很好的dpp-iv抑制能力，dpp-iv抑制活性(ic50值)为98μg/ml。
实施例5蛹虫草蛋白肽血管紧张素转化酶(ace)抑制能力的测定试验
试验样品：样品1、2、3分别为实施例1、实施例2、实施例3制备的蛹虫草蛋白肽，样品4为实施例1粉碎的蛹虫草粉。ace抑制能力按照如下方法进行：
ace抑制率的方法。用高效液相色谱可以在228nm下定量检测释放出的hip量，从而计算出多肽的ace抑制率。
(1)试剂的配置
ph8.3的磷酸盐缓冲溶液：用超纯水配制，其中含磷酸盐50mmol/l，nacl300mmol/l，调整ph到8.3；
ace酶液：将2ml的磷酸盐缓冲液加入1u的ace中，使其浓度变为0.5u/ml。
hhl溶液：使用磷酸缓冲液溶解hhl，使其终浓度为5mmol/l。
样品溶液：称取适量样品，用磷酸盐缓冲液所需浓度的溶液。
(2)ace抑制率测定的色谱条件
检测波长：228nm；流速:1ml/min；流动相a:超纯水(含0.1％三氟乙酸)，流动相b:甲醇(含0.1％三氟乙酸)；进样量:10μl，手动进样；
(3)测定ace抑制活性的方法
取120μlhhl底物溶液，加入20μl的样品混合均匀，在37℃恒温水浴中保温10min。然后加入10μlace酶液在37℃恒温水浴中反应30min，再加入150μl1mol/l的hcl终止反应，得到反应液。该反应液利用hplc进行分析，同时设置空白对照组。ace抑制活性计算公式如下：
ace抑制活性％＝(m-n)/m×100,
式中，m为对照组中马尿酸的峰面积，n为添加的样品组中马尿酸的峰面积。
(4)马尿酸标准曲线的绘制方法
用双蒸水将马尿酸溶解为1mmol/l、0.5mmol/l、0.25mmol/l、0.1mmol/l、0.05mmol/l、0.01mmol/l和0.005mmol/l的标准浓度，经0.22ul的滤膜过滤后在hplc仪器上经行进样分析后，可求得不同浓度马尿酸的面积，然后建立马尿酸峰面积与浓度的线性关系。马尿酸的浓度与峰面积能够反应样品中马尿酸的含量，进而反应ace抑制剂的抑制活性。
(5)半抑制浓度的测定
按照ace抑制肽体外检测方法测定其抑制活性，以浓度为横坐标，ace抑制率为纵坐标绘成圆滑的曲线，从曲线中计算出ic50值。结果(见表1)本发明蛹虫草蛋白肽具有较好的ace抑制能力，ace抑制活性(ic50值)低于305μg/ml，显著低于同类复合蛋白肽的ic50值，其中nveidpe肽ace抑制活性(ic50值)为208μg/ml，具有很好的ace抑制能力。
表1本发明蛹虫草蛋白肽的dpp-iv抑制能力和ace抑制活性
以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110>安徽国肽生物科技有限公司
<120>一种具有ace抑制功能和dpp-iv抑制功能的蛹虫草蛋白肽
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>7
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
asnvalgluileaspproglu
15
<210>2
<211>7
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
serileilealagluvallys
15
<210>3
<211>6
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
argaspleuthrasptyr
15