本发明属于天然产物提取分离
技术领域：
，具体涉及一种具有降血压和降血脂作用的驼血多肽。
背景技术：
：我国是世界上双峰骆驼主要产地之一。全国约有骆驼29.5万峰左右，主要分布在内蒙古、新疆、青海、甘肃、宁夏等省区约110万平方公里的干旱荒漠草原上。其中内蒙古自治区是我国骆驼养殖量最大的地区之一，约占全国骆驼总数的41.7％。近年来，由于骆驼产业链规模小、产品单一、科技含量低、附加值低等问题，没有形成骆驼系列产品精深加工企业，严重制约骆驼产业健康发展，致使骆驼数量锐减，骆驼产业逐年萎缩，资源优势没有转化为经济优势。现代研究表明：骆驼血富含蛋白质，其血清蛋白质共有白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白等5个组分。由于骆驼生长在沙漠地区，严酷和特殊的生存环境使其血液中蛋白质具有独特的化学结构，表现出独特的生理活性，如维持血浆胶体渗透压的恒定、运输功能等。但是，骆驼产业的开发主要集中在驼奶、驼绒和驼肉等方面，而产量相对较多的驼血，除少量食用外，则没有进行相应的开发与利用，造成资源的大量浪费。高血压和高血脂症是最常见的慢性病，是心脑血管病最主要的危险因素，也是目前困扰全球的一个难题。据世界卫生组织统计，全球大约有超过5亿人患此疾病。高血压和高血脂发病率逐年升高，常导致中风、猝死等重大疾病或死亡的发生。食源性活性肽是预防、缓解和治疗高血压和高血脂的一个有效手段。因此，利用现代分离纯化技术从骆驼血中分离制备具有降血压和降血脂作用的驼血多肽，可以用于保健食品的开发利用，符合市场需求。对于延长骆驼产业链，打造地方特色高端品牌产品，增加农牧民收入具有重要的意义。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种具有降血压和降血脂作用的驼血多肽，通过本发明方法提取的有效成分纯度和提取率高；且提取的多肽的降血压和降血脂效果好、操作简单、安全可靠、环境友好等优点。本发明首先提供一种提取驼血多肽的方法，所述的方法包括如下的步骤：1)将新鲜骆驼血或冷冻后的骆驼血置于酶解罐中，加入纯水，搅拌均匀，调节ph为5～9，温度为45～55℃，然后向发酵罐中加入蛋白酶进行酶解，酶解后进行高温灭酶灭菌；冷却至室温后，过滤，收集滤液，得到骆驼血酶解液；2)将骆驼血酶解液直接加入聚酰胺柱进行吸附，流速为2～30bv/h(柱体积，简称bv)，弃去残液；吸附结束后，用2～30bv的纯水进行冲洗除杂，流速为2～30bv/h，弃去水洗液；再用2～50bv的洗脱溶液进行洗脱，流速为2～30bv/h。然后，直接将洗脱液通过大孔吸附树脂柱进行分离，流速为2～30bv/h，收集洗脱液，回收乙醇后，干燥后得到驼血多肽产品；步骤1)中的蛋白酶为flavourzyme酶和/或肉类蛋白水解酶；步骤2)的聚酰胺柱中使用的聚酰胺的粒径为20～70目。优选地，采用30～50目聚酰胺树脂的吸附率最高，分离效果最好。步骤2)中的聚酰胺树脂与骆驼血酶解液的质量比为1:5～50；洗脱溶液为50～95％乙醇溶液。步骤2)中的大孔吸附树脂为非极性大孔吸附树脂(lx-16、hpd200a、lx-1180)、中极性大孔吸附树脂(lx-38、07c、lsa40)和极性大孔吸附树脂(hpd600、xda-1、lsd001)组成的混合树脂，其比例为非极性大孔吸附树脂:中极性大孔吸附树脂:极性大孔吸附树脂1～10:1～10:1～5。优选地，lx-1180:07c:hpd600为5:3:1的分离效果最高。大孔吸附树脂树脂与骆驼血酶解液的质量比为2:1～30。步骤2)中的干燥方法为喷雾干燥、微波干燥、真空干燥、冷冻干燥、鼓风干燥、气流干燥中的一种或几种。本发明提出了上述的具有降血压和降血脂功能的驼血多肽，可用于汤剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、酒剂、冲剂、口服液剂、胶囊剂、片剂、注射剂等食品、保健食品、药品等的原料。利用本发明方法，制备得到具有降血压和降血脂作用驼血多肽的纯度均达到85％以上，提取率大于75％。与已有技术方法相比，除了上述聚酰胺和大孔吸附树脂具有的优点，本发明还具有操作简单，成本低，产品纯度高，溶剂绿色环保，可以重复回收利用，环境友好等优势。本发明可为药物、保健品或食品等提供高纯度的具有降血压和降血脂作用的驼血多肽，可进一步促进驼血多肽的产业化开发，具有比较广阔的应用前景和经济效益。具体实施方式在驼血多肽的制备过程中，聚酰胺粒径和不同极性大孔吸附树脂的比例对纯化效果具有重要的影响。申请人经过长期的研究，确定制备具有降血压和降血脂作用的驼血多肽所需的最佳聚酰胺粒径和不同极性大孔吸附树脂的比例，实现了驼血多肽的高纯度和提取率。下面结合实施例对本发明进行详细的描述。实施例1将新鲜骆驼血150g置于酶解罐中，加入100g纯水，搅拌均匀，调节ph为6，温度为45℃，然后向发酵罐中加入flavourzyme酶，浓度0.2g/l，酶解4.5h，酶解后，升温至87℃，保温16分钟，进行灭酶灭菌；冷却至室温后，过滤，收集滤液，得到骆驼血酶解液。称取60g30～50目聚酰胺树脂，湿法装入一根内径2cm、柱高30cm的玻璃柱中。将骆驼血酶解液直接加入聚酰胺柱进行吸附，流速为5bv/h，弃去残液；吸附结束后，用8bv的纯水进行冲洗除杂，流速为5bv/h，弃去水洗液；再用10bv的55％乙醇溶液进行洗脱，流速为5bv/h。称取lx-1180非极性大孔吸附树脂100g、07c中极性大孔吸附树脂60g和hpd600极性大孔吸附树脂20g(lx-1180:07c:hpd600＝5:3:1，质量比)，湿法装入一根内径4cm、柱高50cm的玻璃柱中。然后，直接将洗脱液通过大孔吸附树脂柱进行分离，流速为3bv/h，收集洗脱液，回收乙醇后，喷雾干燥后得到驼血多肽产品。对本品进行高效液相色谱法(hplc法)检验，驼血多肽的纯度为93.2％，驼血多肽的提取率为80.5％。上述的液相色谱法的测定条件如下：色谱柱：tskgelg2000swxl(300mmi.d.×7.8mm)。流动相：乙腈:水:三氟乙酸＝20:80:0.03(体积比)。流速：0.5ml/min。检测波长：220nm。进样量：20μl。实施例2将冷冻骆驼血1000g置于酶解罐中，加入2000g纯水，搅拌均匀，调节ph为7.5，温度为49℃，然后向发酵罐中加入肉类蛋白水解酶，浓度0.5g/l，酶解3h，酶解后，升温至92℃，保温13分钟，进行灭酶灭菌；冷却至室温后，过滤，收集滤液，得到骆驼血酶解液。称取200g20～30目聚酰胺树脂，湿法装入一根内径4cm、柱高80cm的玻璃柱中。将骆驼血酶解液直接加入聚酰胺柱进行吸附，流速为8bv/h，弃去残液；吸附结束后，用18bv的纯水进行冲洗除杂，流速为8bv/h，弃去水洗液；再用20bv的75％乙醇溶液进行洗脱，流速为8bv/h。称取lx-16非极性大孔吸附树脂180g、lsa40中极性大孔吸附树脂180g和xda-1极性大孔吸附树脂60g(lx-16:lsa40:xda-1＝3:3:1，质量比)，湿法装入一根内径6cm、柱高60cm的玻璃柱中。然后，直接将洗脱液通过大孔吸附树脂柱进行分离，流速为5bv/h，收集洗脱液，回收乙醇后，冷冻干燥后得到驼血多肽产品。对本品进行高效液相色谱法(hplc法)检验，驼血多肽的纯度为86.9％，驼血多肽的提取率为77.3％。实施例3将新鲜骆驼血1500g置于酶解罐中，加入1000g纯水，搅拌均匀，调节ph为8，温度为53℃，然后向发酵罐中加入flavourzyme酶和肉类蛋白水解酶(1:4)，浓度1g/l，酶解2.5h，酶解后，升温至94℃，保温10分钟，进行灭酶灭菌；冷却至室温后，过滤，收集滤液，得到骆驼血酶解液。称取320g50～70目聚酰胺树脂，湿法装入一根内径6cm、柱高70cm的玻璃柱中。将骆驼血酶解液直接加入聚酰胺柱进行吸附，流速为15bv/h，弃去残液；吸附结束后，用25bv的纯水进行冲洗除杂，流速为15bv/h，弃去水洗液；再用35bv的83％乙醇溶液进行洗脱，流速为9bv/h。称取hpd200a非极性大孔吸附树脂70g、lx-38中极性大孔吸附树脂350g和lsd001极性大孔吸附树脂140g(hpd200a:lx-38:lsd001＝1:5:2，质量比)，湿法装入一根内径6cm、柱高80cm的玻璃柱中。然后，直接将洗脱液通过大孔吸附树脂柱进行分离，流速为6bv/h，收集洗脱液，回收乙醇后，真空干燥后得到驼血多肽产品。对本品进行高效液相色谱法(hplc法)检验，驼血多肽的纯度为85.5％，驼血多肽的提取率为75.1％。以上实施例表明，使用的洗脱液能够满足提取率和纯度两方面的要求。以下通过试验例进一步阐述本发明制备的驼血多肽的效果。实施例41、依据卫生部关于《保健食品检测与评价技术规范》辅助降血压功能检验方法中的动物实验法：选用兰州大学医学实验动物中心繁殖的清洁级(b级)自发高血压大鼠(shr)，10～12周龄，体重180～220g，雌雄各30只，共60只。实验前分析各组血压、体重、周龄等比较差异均无显著性(p＞0.05)。清洁级动物房饲养，饲养环境温度25±1℃，湿度60％rh。shr大鼠适应性喂养5天后可进行实验。将60只shr大鼠进行随机分组，分成5组，雄雌各半。分为空白对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组(分别灌胃给予30、60、120mg·kg-l的驼血多肽)(分别相当于人体推荐用量的5、10、20倍)，阳性对照组给予卡托普利(l0mg·kg-1·bw)灌胃。各组大鼠每天灌胃给药1次，灌胃量为lml/l00g·bw，进行6周的治疗。空白对照组，则每天灌胃以相同体积的蒸馏水，连续灌胃治疗6周。采用中日友好医院临床医学研究所rbp-1型大鼠血压计，测定各组大鼠的尾动脉收缩压(tailsystolicpressure,sbp)，每次测量3次，取其平均值。应用驼血多肽治疗后，同空白对照组相比，大鼠尾动脉sbp明显降低；驼血多肽的三个剂量治疗组从用药2周开始即可使高血压大鼠尾动脉sbp降低，用药后6周且高剂量治疗组降压效果更明显，与阳性对照药卡托普利的降压效果相近，与空白对照组相比，差异无统计学意义。实验结果见表l。表1驼血多肽对shr大鼠收缩压的影响由表1可见，分别经口给予小鼠30、60、120mg/kgbw(分别相当于人体推荐量5、10、20倍)剂量的本发明样品6周，能明显降低shr大鼠收缩压。由此可见，本发明所得的驼血多肽产品具有较好的有降血压作用，且有一定的剂量效应关系，可以应用于降血压食品、保健品、药品中。2、依据卫生部关于《保健食品检测与评价技术规范》辅助降低血脂功能检验方法中的动物实验法：选用兰州大学医学实验动物中心繁殖的spf级雄性sd大鼠，体重200±20g，共72只。造高血脂大鼠模型：雄性sd大鼠72只，适应性饲养1周，随机分成空白组和模型组，其中空白组12只，模型组60只。每周称量体重1次。空白组饲喂普通饲料，模型组饲喂高脂饲料，连续喂4周。4周后模型组大鼠禁食不禁水10h，眼内眦取血，采血后尽快分离血清，测定血清tc、tg、ldl-c、hdl-c水平。根据tc水平将模型对照组随机分成4组(低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照组)，分组后空白对照组和模型对照组比较tc、tg、ldl-c、hdl-c差异均无显著性。分组后，低剂量组、中剂量组、高剂量组三个剂量组(分别灌胃给予30、60、120mg·kg-l的驼血多肽)(分别相当于人体推荐用量的5、10、20倍)每天经口给予驼血多肽，阳性对照组按剂量给予血脂康，空白对照组和模型对照组同时给予同体积的相应溶剂，空白对照组继续给予维持饲料，模型对照组及三个剂量组继续给予模型饲料，并定期称量体重。各组大鼠lg/l00g体重灌胃，每日灌胃1次，治疗4周。高脂饲料配方：在维持饲料中添加20.0％蔗糖、15％猪油、1.2％胆固醇、0.2％胆酸钠，适量的酪蛋白、磷酸氢钙、石粉等。除了粗脂肪外，模型饲料的水分、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、粗灰分、钙、磷、钙：磷均要达到维持饲料的国家标准。末次给药后1h，用10％水合氯醛麻醉，取血，4500r/min离心5min，分离血清，进行生化检测，按相应试剂盒方法测定总胆固醇(tc)、三酰甘油(tg)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)和低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)的含量。检测结果见表2。表2各试验组对高脂血症大鼠血清tc、tg、hdl-c和ldl-c含量的影响组别tc(mmol/l)tg(mmol/l)hdl-c(mmol/l)ldl-c(mmol/l)空白组0.708±0.0410.389±0.0220.925±0.0180.199±0.046模型对照组1.285±0.0760.923±0.0190.404±0.0580.291±0.035低剂量组0.789±0.0480.491±0.0250.828±0.0430.223±0.017中剂量组0.755±0.0360.468±0.0450.859±0.0160.213±0.014高剂量组0.709±0.0260.405±0.0290.911±0.0450.193±0.018阳性对照组0.716±0.0120.408±0.0320.854±0.0580.195±0.023由表2可看出，在低剂量组、中剂量组和高剂量组中tc、tg和ldl-c的含量都降低、hdl-c的含量升高，且接近于空白组，高剂量组中tc、tg、ldl-c和hdl-c的含量更接近于空白对照，高剂量组优于低剂量组和中剂量组，均具有显著的降低血脂作用，且有一定的剂量效应关系，可以应用于降血压食品、保健品、药品中。3、依据卫生部《保健食品检验与评价技术规范》中毒性试验：选用兰州大学医学实验动物中心繁殖的健康成年昆明种小鼠和wistar种大鼠为实验动物。急性毒性实验：采用最大耐受剂量(mtd)试验法，剂量设为3600mg/kgbw。选昆明种小鼠20只，体重为18～22g，雌雄各10只。试验前动物禁食16h，用蒸馏水将样品浓度配成180mg/ml，然后给动物灌胃，灌胃量为0.4ml/20gbw，观察记录动物的中毒表现，每周称重一次，观察两周时间，试验结束后解剖动物进行大体观察。表3急性毒性观察情况由表3可见，给予受试物后，动物生长良好，未见有中毒症状，无动物死亡，试验结束后解剖动物体观察均未见异常。据此判定本发明对小鼠的急性经口毒性mtd3600mg/kgbw，按急性毒性分级标准，属于无毒级。大鼠30天喂养试验：分别以30、60、120mg/kgbw(相当于人体推荐用量5、10、20倍)3个剂量的样品掺入饲料连续给大鼠喂食30天，结果大鼠的体重增长、食物利用率、血常规、血液生化、脏器重量及脏器系数均无异常改变，大鼠的肝、肾、脾、胃、十二指肠、睾丸和卵巢均未见病理组织学改变，未发现该样品对大鼠有毒性作用。经上述各项试验证明，本发明较对照组能显著降低实验动物的血压和血脂，说明本发明具有很好的降血压和降血脂的功能，并且安全有效，无毒副作用。当前第1页12