本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种能够激活卵巢皮质内原始卵泡的3d打印生物支架的制备。
背景技术：
随着我国社会经济的快速发展，女性地位越来越高，同时也面临着越来越大的工作、心理压力，育龄女性生育年龄不断推迟；再加上环境污染越来越严重，各种有毒有害物质离生活越来越近，社会和环境因素相结合，引发了大量生殖健康问题；而自二胎政策开放后，高龄产妇也越来越多。因此，如何让卵巢功能已逐渐衰退的超育龄女性顺利完成妊娠过程，近年来已成为一大研究热点。
除了育龄女性的妊娠问题，近年来，由于生活节奏快，工作压力大，许多女性进入“围绝经期”有提前趋势，对身体和心理健康都有诸多不利影响，如情绪不稳定、易怒、抑郁、记忆力衰退等各种更年期症状、皮肤老化、肥胖、骨质疏松等。如何调节老龄化时期妇女的生理与心理状态，延缓衰老，缓解围绝经期的症状，提高绝经后的生活质量，在人口逐渐老龄化的社会，也越来越值得关注。
(一)卵巢功能衰竭
随着年龄的增长，女性卵巢功能逐渐衰竭至月经永久性停止，这一生理现象被称为绝经。当卵巢内卵泡用尽，或剩余卵泡对促性腺激素丧失了反应，卵泡不在发育和分泌雌激素，不能刺激子宫内膜生长，导致绝经。
目前对绝经期最常用的治疗措施是激素替代/补充疗法，即在更年期女性缺乏激素的时候，用外源激素来补充。虽然对改善绝经期综合症状有一定效果，但也存在一些弊端，如：激素治疗并不适用于所有人，患有乳腺、子宫疾病和糖尿病、高血压等疾病的患者需慎用；激素治疗时每个人所需的量也不同，医生很难给出最合适的剂量，而体内激素过多会引发诸如子宫内膜癌、卵巢癌或乳腺癌等无法控制的副作用；外源给予的激素为人工合成，无论从成分上还是比例上始终无法替代自身分泌激素的效果。
(二)卵巢早衰(prematureovarianfailure,pof)
女性的平均自然绝经年龄为50岁左右，当这一现象出现在40岁之前时，称为卵巢早衰，约占育龄妇女的1％-3％。卵巢早衰主要是由于卵巢中的原始卵泡过早耗竭或者原始卵泡不能发育而致。
目前，辅助生殖技术如试管婴儿技术等已经成为治疗不孕不育症的关键技术，然而，试管婴儿技术的关键是必须要求母亲提供一枚高质量的成熟卵子，如果母亲无卵可排或排卵功能低下，比如对于卵巢早衰症患者，那么这项技术则爱莫能助。
(三)多囊卵巢综合征
多囊卵巢综合征(polycysticovarysyndrome，pcos)是育龄妇女较常见的内分泌综合征，发病率占育龄期妇女的6～10％，其主要表现为月经稀发或闭经、不孕、卵巢多囊性变、肥胖、多毛、高雄激素血症等。对于pcos患者的治疗，包括手术治疗、药物治疗和辅助生育技术。
其中，对pcos患者采用辅助生育技术，尤其是对于应用6个月以上标准的促排卵周期治疗后有排卵但仍未妊娠的pcos患者，或多种药物促排卵治疗及辅助治疗无排卵并急待妊娠的患者，可以选择胚胎移植的辅助生育技术，包括体外受精技术(invitrofertilization,ivf)和卵母细胞体外成熟技术(invitromaturation,ivm)。
(四)卵巢癌(ovariancancer,oac)
卵巢癌是发生于卵巢的一种发病率较高的恶性肿瘤，除了干扰卵巢激素的正常分泌，还会破坏大部分卵巢组织，造成不孕症，严重危害妇女生殖健康。
卵巢癌的治疗以手术为主，辅以化学、放射、免疫治疗等。手术治疗是最有效的治疗手段，手术范围原则上尽可能切除原发肿瘤及所有的转移灶，对有生育要求者，符合条件者可行保守性手术保留生育能力。
当大部分卵巢组织被肿瘤或其他原因破坏导致卵泡发育障碍时，卵泡皮质中还存在大量的原始卵泡，卵巢皮质组织冷冻是当今较为常见的生育力保护的措施，如何在之后的体外培养中使其激活、生长和排卵，是当下的研究热点。
技术实现要素：
目前已有研究发现很多与原始卵泡激活相关的信号通路和靶点，如pten与pi3k-mtor信号通路、lkb1-ampk信号通路等，本发明利用3d打印技术，将原始卵泡激活剂和能够促进卵泡发育的激素和生长因子混入支架材料中，打印成型，然后移入含有原始卵泡的卵巢皮质碎片，移植回体内后，皮质碎片能有更好的支架保护和更丰富的营养供给，生物支架在体内缓慢降解，缓释出卵泡激活剂，持续激活原始卵泡。
本发明一个方面提供了一种模拟人造卵巢的生物支架，其通过3d打印方式获得，3d打印采用的打印材料为生物相容性材料、原始卵泡激活剂、原始卵泡发育促进剂的混合物。
本发明一个方面提供了一种人造卵巢，其中包含了生物支架以及镶嵌于生物支架中的包含原始卵泡的组织碎片，其中生物支架通过3d打印获得，其打印材料为生物相容性材料、原始卵泡激活剂、卵泡发育促进剂的混合物。
在本发明的技术方案中，生物相容性材料模拟卵巢组织中包含的组分，其选自胶原ⅰ、海藻酸钠、明胶、琼脂糖、基质胶(matrigel)、透明质酸、壳聚糖、葡聚糖中的一种或者几种任意组合。优选为海藻酸钠和明胶的混合物、海藻酸钠和基质胶的混合物、明胶和基质胶的混合物、胶原ⅰ和海藻酸钠和明胶的混合物、胶原ⅰ和海藻酸钠和基质胶的混合物、胶原ⅰ和明胶和基质胶的混合物。
在本发明的技术方案中，制备得到的生物支架先紫外交联，再用cacl2交联。可泡在cacl2中-20℃短期保存，或-80℃冰箱长期保存，使用之前用pbs或生理盐水浸泡清洗。
在本发明的技术方案中，促进卵泡发育的激素或生长因子选自卵泡刺激素(fsh)、黄体生成素(lh)、表皮细胞生长因子(egf)、胰岛素-转铁蛋白-硒(its)中的一种或几种的组合。优选为卵泡刺激素、卵泡刺激素和黄体生成素的组合、卵泡刺激素和黄体生成素和表皮细胞生长因子的组合、卵泡刺激素和黄体生成素和表皮细胞生长因子和胰岛素-转铁蛋白-硒的组合。更优选地，卵泡刺激素(fsh)用量为10-1000miu/ml、黄体生成素(lh)1-100miu/ml、表皮细胞生长因子(egf)0.1-100ng/ml、胰岛素-转铁蛋白-硒(its)。胰岛素-转铁蛋白-硒中包含1-100ug/ml重组人胰岛素，1-100ug/ml人转铁蛋白(基本无铁)以及0.1-100ng/ml亚硒酸钠。
在本发明的技术方案中，原始卵泡激活剂包括与原始卵泡激活相关的信号通路激动剂或抑制剂，和基础培养液。其中，相关信号通路激动剂或抑制剂选自pten抑制剂、pi3k信号通路激活剂、akt信号通路激活剂、mtor信号通路激活剂的中一种或几种的组合。
在本发明的技术方案中，pten抑制剂选自sf1670(0.5-100um)、vo-ohpictrihydrate(0.1-100nm)、pic型bpv(0.1-100nm)、phen型bpv(0.1-100nm)中的一种或多种的组合；
在本发明的技术方案中，pi3k信号通路激动剂选自1,3-二咖啡酰奎宁酸(0.1-100um)、740y-p(pdgfr740y-p)(0.1-300ug/ml)一种或多种的组合。
在本发明的技术方案中，akt信号通路激动剂选自1,3-二咖啡酰奎宁酸(0.1-100um)、去氧穿心莲内酯(0.1-100mm)、sc79(0.1-10ug/ml)一种或多种的组合。
在本发明的技术方案中，mtor信号通路激动剂选自mhy1485(0.1-10um)、pa(0.1-200um)、pro(0.1-100um)一种或多种的组合。
在本发明的技术方案中，基础培养液中包含用于培养原始卵泡的培养溶液，优选包括培养基、抗生物、碳源、蛋白酶抑制剂，优选包含αmem、fbs/bsa、丙酮酸钠、青霉素、链霉素。更优选以αmem为母液，内含10％fbs、5.5mg/ml丙酮酸钠、100iu/ml青霉素和100ug/ml链霉素。
本发明的技术方案中，所述生物相容性支架上具有空隙，空隙的直径为卵巢皮质碎片大小的1.5倍-3倍，优选为2-2.5倍。
在本发明的技术方案中，所述生物相容性支架的3d打印尺寸为：孔隙尺寸(r)：100μm-800μm，优选为150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm；线条堆积夹角:0°-180°，优选为5°、10°、15°、20°、30°、40°、50°、60°、70°、80°、90°、100°、110°、120°、130°、140°、150°、160°、170°、175°。
在本发明的技术方案中，所述的生物支架的形状可以为圆形、椭圆形、长方形、正方形、不规则型等各种形状。其内部具有一定孔隙率的联通结构。
在本发明的技术方案中，所述的包含原始卵泡的组织碎片在植入生物支架前在使用原始卵泡激活剂中激活浸泡0.1-24小时，优选为0.5-6小时。
在本发明的技术方案中，包含原始卵泡的组织碎片选自包含原始卵泡的卵巢组织碎片、更优选为包含原始卵泡的卵巢皮质碎片。
本发明另一个方面一种制备人工卵巢的方法，其包括如下步骤：
采用3d打印方式打印生物相容性支架，打印生物相容性支架的材料为生物相容性材料以及原始卵泡激活剂、原始卵泡发育促进剂的混合物。
本发明另一个方面提供了一种制备人工卵巢的方法，其包括如下步骤：
1)采用3d打印方式打印生物相容性支架，打印生物相容性支架的材料为生物相容性材料以及原始卵泡激活剂、原始卵泡发育促进剂的混合物；
2)将包含原始卵泡的卵巢皮质碎片浸泡在原始卵泡激活剂和基础培养液的混合液中激活；
3)将激活后的卵巢皮质碎片注入到步骤1)获得的3d打印生物相容性支架上，获得人工卵巢。
本发明另一个方面提供了本发明的人造卵巢作为药物筛选、卵泡研究模型的用途。
本发明另一个方面提供了本发明的人造卵巢治疗卵泡发育障碍疾病的用途。
在本发明的技术方案中，所述的卵泡发育障碍疾病选自卵巢功能衰竭、卵巢早衰、多囊卵巢综合症、卵巢癌、外伤导致的卵巢损伤。
本发明另一个方面提供了一种治疗卵泡发育障碍疾病的方法，其包括将本发明的人造卵巢移植至受试者体内的步骤。
本发明另一个方面提供了本发明所述的模拟人造卵巢的生物支架在制备人造卵巢中的用途。
本发明另一个方面提供了本发明所述的模拟人造卵巢的生物支架在制备模拟人造卵巢的医疗器械中的用途。
在本发明的技术方案中，含有原始卵泡激活剂和促进卵泡发育的激素或生长因子的生物相容性支架通过3d打印制成，冷冻的新鲜的含有原始卵泡的卵巢皮质碎片在含有不同浓度不同组合的原始卵泡激活剂的基础培养液中温育0.5～6小时后，转移入生物相容性支架的内部，然后移植回体内。
在本发明的技术方案中，所述的卵细胞、卵泡、原始卵泡、包含原始卵泡的组织，例如包含卵泡的卵巢皮质等均为非人类细胞，或者本发明所使用到的卵细胞、卵泡、原始卵泡、包含原始卵泡的组织均为商业化可以获得的。
有益效果
1、本发明采用在支架中混合了激素、生长因子等活性物质，能够缓慢释放，在皮质碎片注入3d打印支架内部，并移植回体内后，皮质碎片能有更好的支架保护和更丰富的营养供给。而生物支架在体内缓慢降解，缓释出卵泡激活剂，持续激活原始卵泡。
2、由于支架中加入了卵泡激活剂，从而大大缩短了原始卵泡体外激活的时间，为揭示原始卵泡激活的机制提供新的研究工具。
3、由于原始卵泡体外体外激活时间缩短，因此，可以在同一次手术中完成取出-激活-植入工序，在避免二次手术的基础上，减少病人等待时间，也为临床治疗卵巢早衰和辅助生殖技术提供新的选择。
4、使用本发明得人工卵巢后，卵泡激活分泌大量激素调节机体内分泌，为改善绝经期综合症状，延缓衰老提供新的研究方向。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
本发明使用的its市售产品中包含1.0mg/ml重组人胰岛素，0.55mg/ml人转铁蛋白(基本无铁)和0.5μg/ml亚硒酸钠。
实施例13d打印生物支架的设计及制备
(1)结合计算机辅助设计(computeraideddesign,cad),采用三维打印技术构建生物支架，3d生物支架的形状，选为圆形、长方形、正方形、椭圆形或不规则形，内部结构联通，具有孔隙；孔隙尺寸(r)：400μm；线条堆积夹角：30-120度；
(2)配制3d打印生物支架打印材料，其中包含生物相容性材料、原始卵泡激活剂、原始卵泡发育促进剂的混合物；生物相容性材料为3％-5％海藻酸钠与8％-10％明胶，海藻酸钠和明胶的质量比为1：1，混合后室温条件下成凝胶状。在生物相容性材料中加入740y-p10ug/ml、pa8um、pro2um、fsh100miu、lh10miu、egf5ng/ml、its(100倍稀释后使用)。
(3)以3d打印方式打印卵巢支架；
(4)制备好的支架首先紫外交联10分钟，再用cacl2交联，可泡在cacl2中-20℃短期保存，或-80℃冰箱长期保存，使用之前用pbs或生理盐水浸泡清洗。
实施例23d打印生物支架的设计及制备
实施例2制备的支架与实施例1的方法相同，除步骤(2)中打印材料的配方，所述打印材料的配方按照下表所列比例进行。
实施例2原始卵泡的获得
对3日龄的雌性小鼠采用颈椎脱臼法处死，消毒皮肤后，背位无菌摘取卵巢，放入分离培养基中(l-15+10％fbs+100iu/ml青霉素+100ug/ml链霉素)。在实体显微镜下剔除卵巢周围附带组织，在分离液中清洗3遍。然后在镜下用胰岛素计量注射针刺卵巢，将小鼠卵巢分成含有原始卵泡的组织碎片。
实施例3原始卵泡的激活
激活剂为与原始卵泡激活相关的信号通路的激动剂或抑制剂，均属于现有技术，且可以从市场上购买得到。
冻存的或新鲜的含大量原始卵泡的卵巢皮质切碎后，在含不同组合卵泡激活剂的基础培养液中温育激活0.5～6小时后，生理盐水洗三次，去除外源物，然后移入打印好的生物支架，移植到双侧卵巢摘除的成年母鼠肾被膜下。
其中卵泡激活剂的基础培养液配方为：
实施例43d打印生物支架和人工卵巢的制备以及效果
(1)将实施例2制备得到的3d打印生物支架储存备用的生物支架预处理：将在-80℃储存备用的卵巢生物支架取出，在超净台中紫外放置，室温20分钟，然后在生理盐水中孵育30分钟，清洗和灭菌同时进行。
(2)将3天新生小鼠卵巢皮质碎片置于实施例2的基础培养液1号中培养1-6小时，体外激活皮质中的大量原始卵泡。
(3)培养后的皮质碎片注入3d打印生物支架中。
(4)将含有皮质碎片的生物支架移植入双侧卵巢切除的成年母鼠(8-10周)肾被膜下，手术例大于等于6。
(5)分别于移植手术后的第5,10,15天处死母鼠，取出支架，石蜡包埋、5um组织切片：h&e染色，观察卵泡发育形态；免疫组织化学染色pcna检测细胞增殖情况；tunnel检测细胞凋亡。
结果显示：随着天数增加，进行试验的12组结果均显示出原始卵泡激活发育的状态，从照片可以看出部分原始卵泡成功激活并发育至腔前卵泡阶段，且发育中的卵泡颗粒细胞增殖。说明本发明的支架以及人工卵巢成功在体内激活了小鼠的原始卵泡，并促进其发育，能够为卵巢因病导致缺失或损伤提供替代方案。