用于联合检测多种呼吸道细菌的荧光PCR检测体系、试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及生化检测领域，尤其是涉及一种用于联合检测多种呼吸道细菌的荧光pcr检测体系、试剂盒及检测方法。
背景技术：
：世界卫生组织2013年发布的统计结果显示，在世界十大疾病死因中，下呼吸道感染占5.9％，位列第三位，并且位列第四位的慢性阻塞性肺病(占5.4％)的死亡也多与呼吸道感染有关。肺炎作为全球传染性疾病最主要的死因之一，更是儿童死亡的第一病因。据中国疾病预防控制中心2011年系统分析不完全统计显示，中国大陆5岁以下儿童，每10万人中就有184～223人死于肺炎。而由于免疫力降低而继发性的细菌感染正是导致重症肺炎死亡的主要原因。在传统检测中，往往需要患者先抽血化验，但临床常规的生化指标分析无法对患者所感染的病原菌种属做出准确鉴定，大多数临床治疗仍处于经验抗菌素应用阶段，在使用高级抗生素方面存在较大的盲目性。而且针对病原菌的鉴定目前临床上主要使用的是细菌培养法及药敏实验，一般细菌培养需要一周左右，个别细菌甚至需要一个月的时间。这种方法周期长、准确率低、部分细菌难培养，不仅耗费人力物力，对重症呼吸道感染患者来说还会延误宝贵救治时间，所以急需一种检测速度快、灵敏度高、结果准确细菌检测方法，为快速检测、精准治疗提供一种有效的工具。目前市场上虽有一些检测呼吸道病原菌的试剂盒，但均是单一靶标检测，不能一次性检出多个病原菌，要检测多个靶标就需进行多次检测，耗时长，且检测流程不统一，操作复杂。伴随着21世纪朝阳产业-分子检测的迅猛发展，pcr、rt-pcr、real-timepcr、lamp等新技术正以其高特异性、敏感性和时效性慢慢地在取代传统的病原体分离培养和生化鉴定等敏感性低、费时费力的检测方法。然而由于生化鉴定的敏感性不仅仅包括检测敏感性as(analyticalsensitivity)，还包括临床敏感性cs(clinicalsensitivity)。例如呼吸道感染可以有30～40个常见病原体感染引起，如果仅仅检测一个指标，检测敏感性as再高其临床敏感性也会大打折扣，故而多重pcr技术在分子检测行业越来越被重视，其所解决的问题就是让分子检测不仅能看到点上的问题还能看到面上的东西，从而增加生化鉴定的敏感性。然而，虽然体外检测行业依靠实时荧光pcr技术作为分子检测工具已有二十多年，但随着检测行业发展的需求，多基因、多病原体的检测变得越来越迫切，很多企业和科研单位已做过多次尝试，但仍未取得重大进展，无法用一支反应管里有限数量的检测通道提高靶点检测的通量，面对越来越复杂的复合性病原体感染的多靶点检测需求，多重pcr扩增以其高通量、高效率、低成本和少耗时的特性成为最理想和最快速的分子检测方法之一，但是在进行多重pcr扩增时，实验也不得不去面对新的问题，如每增加一对引物就会增加对pcr反应体系的设计和优化的挑战。虽然荧光定量pcr在过去的二十多年里得到了飞速的发展，已经渗透到生物技术开发的各行各业，但随着生物检测技术要求越来越高，该技术也暴露出了很多亟待解决的问题，如现有的常用荧光定量仪器检测通道为4-5个，单管检测的靶基因数量一般也为4-5，这也成为要进行多重实时定量pcr检测的瓶颈。技术实现要素：基于此，有必要提供一种能够提高检测效率、检测通量且特异性好、灵敏度高的用于联合检测多种呼吸道细菌的荧光pcr检测体系、试剂盒及检测方法。一种用于联合检测多种呼吸道细菌的荧光pcr检测体系，包括非荧光扩增引物系统、检测探针系统以及荧光扩增引物系统；其中，所述非荧光扩增引物系统包括如下非荧光引物对中的至少一种：序列如seqidno.1和seqidno.2所示的肺炎克雷伯杆菌扩增引物对、序列如seqidno.3和seqidno.4所示的肺炎链球菌扩增引物对、序列如seqidno.5和seqidno.6所示的流感嗜血杆菌扩增引物对、以及序列如seqidno.7和seqidno.8所示的铜绿假单胞菌扩增引物对；对应地，所述检测探针系统包括如下检测探针中的至少一种：序列如seqidno.9所示的肺炎克雷伯杆菌检测探针、序列如seqidno.10所示的肺炎链球菌检测探针、序列如seqidno.11所示的流感嗜血杆菌检测探针、以及序列如seqidno.12所示的铜绿假单胞菌检测探针；所述检测探针在5’端连接有第一荧光报告基团，在3’端连接有第一荧光淬灭基团，且不同检测探针的第一荧光报告基团不同；所述荧光扩增引物系统包括如下荧光引物对中的至少一种：序列如seqidno.13和seqidno.14所示的嗜肺军团菌扩增引物对、序列如seqidno.15和seqidno.16所示的百日咳杆菌扩增引物对、以及序列如seqidno.17和seqidno.18所示的卡他莫拉菌扩增引物对；所述荧光引物对中的上游引物或下游引物在两端或在靠近两端的位置分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团，且不同荧光引物对中的第二荧光报告基团不同。在其中一个实施例中，所述非荧光扩增引物系统包括所述肺炎克雷伯杆菌扩增引物对、所述肺炎链球菌扩增引物对、所述流感嗜血杆菌扩增引物对以及所述铜绿假单胞菌扩增引物对；所述检测探针系统包括所述肺炎克雷伯杆菌检测探针、所述肺炎链球菌检测探针、所述流感嗜血杆菌检测探针以及所述铜绿假单胞菌检测探针；所述荧光扩增引物系统包括所述嗜肺军团菌扩增引物对、所述百日咳杆菌扩增引物对以及所述卡他莫拉菌扩增引物对。在其中一个实施例中，所述第二荧光淬灭基团和所述第二荧光报告基团之间相距15～25nt。在其中一个实施例中，所述荧光引物对中的上游引物或下游引物在5’端连接有所述第二荧光淬灭基团，在靠近3’端连接有所述第二荧光报告基团。在其中一个实施例中，所述荧光扩增引物系统还包括序列如seqidno.19和seqidno.20所示的内标引物对，所述内标引物对中的上游引物或下游引物在两端或在靠近两端的位置分别连接有所述第二荧光淬灭基团和所述第二荧光报告基团，且所述内标引物对中的第二荧光报告基团与所述荧光引物对中的第二荧光报告基团不同。在其中一个实施例中，所述第一荧光报告基团选自fam、hex、rox或cy5，所述第一荧光淬灭基团选自bhq1或bhq2；所述第二荧光报告基团选自fam、hex、rox或cy5，所述第二荧光淬灭基团选自bhq1或bhq2。在其中一个实施例中，所述肺炎克雷伯杆菌检测探针连接的第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团分别为fam和bhq1，所述肺炎链球菌检测探针连接的第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团分别为hex和bhq1、所述流感嗜血杆菌检测探针连接的第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团分别为rox和bhq2，所述铜绿假单胞菌检测探针连接的第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团分别为cy5和bhq2；所述嗜肺军团菌扩增引物对中上游引物连接的第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团分别为fam和bhq1，所述百日咳杆菌扩增引物对中上游引物连接的第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团分别为rox和bhq2，所述卡他莫拉菌扩增引物对中上游引物连接的第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团分别为cy5和bhq2，所述内标引物对中下游引物连接的第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团分别为hex和bhq1。一种用于联合检测多种呼吸道细菌的试剂盒，包括上述任一实施例所述的用于联合检测多种呼吸道细菌的荧光pcr检测体系。在其中一个实施例中，所述用于联合检测多种呼吸道细菌的试剂盒还包括dna提取试剂、pcr反应缓冲液、mg2+试剂、dntps以及taqdna聚合酶中的至少一种。在其中一个实施例中，所述dna提取试剂包括溶液1、溶液2、溶液3、溶液4、磁珠溶液和洗脱液，其中，溶液1的成分包括十二烷基硫酸钠、曲拉通x-100和异硫氰酸胍；溶液2的成分包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸和氯化钠；溶液3的成分包括曲拉通x-100和氯化钠；溶液4的成分为矿物油；洗脱液的成分包括tris-hcl和edta。pcr反应缓冲液的成分包括kcl、tris-hcl、1％tritonx-100，pcr反应缓冲液的使用浓度为1×。mg2+试剂如mgcl2试剂等，mg2+的使用浓度为4mm。dntps中各dntp的使用浓度为0.25mm。taqdna聚合酶的使用浓度为5u/50μl。一种用于联合检测多种呼吸道细菌的检测方法，使用上述任一实施例所述的用于联合检测多种呼吸道细菌的荧光pcr检测体系，所述检测方法包括如下步骤：提取待测样本的dna；以提取的dna作为模板，以所述非荧光扩增引物系统和所述荧光扩增引物系统作为扩增引物，并加入检测探针系统进行实时荧光pcr扩增；在实时荧光pcr扩增过程中检测荧光信号，得到检测结果。在其中一个实施例中，针对单色荧光通道中一个靶点的检测采用荧光探针，以荧光信号达到设定的阈值时所需的循环次数ct值作为阴阳性判定标准，ct值小于40时为阳性，ct值大于等于40时为阴性；另一个靶点的检测采用熔解曲线的方式，以熔解曲线法在tm时有无特征峰作为阴阳性判定标准，在特定的tm温度下，有特征峰，则为阳性，若无，则为阴性。针对上述荧光pcr检测受限于检测通道的瓶颈问题，上述用于联合检测多种呼吸道细菌的荧光pcr检测体系、试剂盒及检测方法基于taq酶水解荧光探针产生荧光信号及荧光引物扩增后产物杂交产生荧光信号的两种技术原理，针对单色荧光通道中一个靶点的检测采用荧光探针，另一个靶点的检测采用荧光引物对直接扩增的荧光引物熔解曲线的方式，实现了在单色的荧光通道中同时进行两个靶点检测和分析，因而能够进行呼吸道多种细菌的联合检测，并将现有的荧光pcr检测通量增加一倍，可一次性检测多种病原菌，有利于解决目前市场上病原菌试剂盒检测靶标单一，无法同时获得多个靶标信息的问题。上述荧光pcr检测体系、试剂盒及检测方法具有高通量、低成本、少耗时的特点，可广泛用在科研上的多病原体混合检测分析，其检测结果可作为中间结果进一步用于辅助临床诊断和治疗。并且，上述荧光pcr检测体系、试剂盒及检测方法在实时多重pcr检测平台开发时，在考虑不更改现行市面上已有的普通定量pcr仪的硬件设施前提下，进行单色单通道多靶点检测的开发，可直接在传统荧光pcr仪器上进行单通道多靶点检测，从而达到解决现有荧光定量pcr仪器多重检测通道瓶颈问题，进而实现多重实时定量pcr检测的目的。进一步，上述荧光pcr检测体系、试剂盒及检测方法可在一管试剂中同时检测多种病原菌，极大地提高了检测效率，为量少、珍贵的核酸样品提供更多的靶点检测信息，并且该检测方法使pcr扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行，避免了由于样本间交叉引起的假阳性和环境污染，能对反应过程进行实时监测。尤其是荧光引物熔解曲线法采取的是核酸杂交的方式，故而相对于传统的荧光染料的方式特异性更好，灵敏度更高。此外，采用多重荧光pcr扩增检测技术与传统的血清免疫学检测比较，具有更高的灵敏度，从理论上讲只要有一个基因拷贝就可以检测出来，同时避免了交叉反应，缩短了检测窗口期。附图说明图1为fam通道肺炎克雷伯杆菌的阳性检测结果；图2为hex通道肺炎链球菌的阳性检测结果；图3为rox通道流感嗜血杆菌的阳性检测结果；图4为cy5通道铜绿假单胞菌的阳性检测结果；图5为fam通道嗜肺军团菌的阳性检测结果；图6为rox通道百日咳杆菌的阳性检测结果；图7为cy5通道卡他莫拉菌的阳性检测结果；图8为hex通道内参检测结果；图9为所有通道中阴性样本检测结果；图10为灵敏度分析时fam通道肺炎克雷伯杆菌的检测结果；图11为灵敏度分析时hex通道肺炎链球菌的检测结果；图12为灵敏度分析时rox通道流感嗜血杆菌的检测结果；图13为灵敏度分析时cy5通道铜绿假单胞菌的检测结果；图14为灵敏度分析时rox通道百日咳杆菌的检测结果；图15为灵敏度分析时fam通道嗜肺军团菌的检测结果。具体实施方式为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。一、引物及探针设计本实施例所提供的试剂盒包括序列如下的非荧光扩增引物系统、检测探针系统和荧光扩增引物系统：seqidno.1～seqidno.20，具体参见下表1。该试剂盒可特异性地检测多种呼吸道细菌，包括流感嗜血杆菌(hi)、肺炎链球菌(sp)、肺炎克雷伯杆菌(kpn)、嗜肺军团菌(lp)、百日咳杆菌(bp)、铜绿假单胞菌(pa)及卡塔莫拉菌(mc)等，特异性高，检测便捷，检测速度快，临床应用范围广。表1gb-f及gb-r为内标引物对。可理解，在其他实施例中，该试剂盒中的非荧光扩增引物系统可以包括肺炎克雷伯杆菌扩增引物对、肺炎链球菌扩增引物对、流感嗜血杆菌扩增引物对以及铜绿假单胞菌扩增引物对中的任一种、任两种的组合或任三种的组合；检测探针系统可以包括肺炎克雷伯杆菌检测探针、肺炎链球菌检测探针、流感嗜血杆菌检测探针以及铜绿假单胞菌检测探针中的任一种、任两种的组合或任三种的组合，只要与非荧光扩增引物系统对应即可；并且荧光扩增引物系统也可以包括嗜肺军团菌扩增引物对、百日咳杆菌扩增引物对以及卡他莫拉菌扩增引物对中的任一种或任两种的组合。二、实验步骤1、样本dna提取本实施例检测样本来源可以是痰液、咽拭子、肺泡灌洗液等，用磁珠法提取dna，在样本处理室进行如下操作：1.1、取适量1.5ml灭菌离心管，分别标记阴性对照(无核酸水)及待测样本，每管加入600μldna提取溶液1(superall超级提取试剂盒，货号s1006，湖南圣湘生物科技有限公司)；1.2、每管加入200μl待测样本或阴性对照，盖上管盖，震荡混匀10秒钟，95℃加热10分钟，瞬时离心；1.3、每管加入100μldna提取溶液2和50μl磁珠溶液(superall超级提取试剂盒，货号s1006，湖南圣湘生物科技有限公司)，震荡混匀10秒钟，室温静置20分钟；1.4、瞬时离心后将离心管置于分离器上，3分钟后缓慢将溶液吸出，注意不要碰到吸附于管壁的棕色物；1.5、每管加入600μldna提取溶液3(superall超级提取试剂盒，货号s1006，湖南圣湘生物科技有限公司)和200μldna提取溶液4(superall超级提取试剂盒，货号s1006，湖南圣湘生物科技有限公司)，震荡混匀5秒钟，瞬时离心后将离心管再次置于分离器上；1.6、约3分钟后，上清液分为两层，将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置1分钟后将管底残余液体完全吸出丢弃。1.7加入30～50μl洗脱液，将离心管壁上磁珠洗脱到管底，吸打混匀3～4次，室温静置10分钟后将离心管再次置于磁性分离器上3分钟，然后将洗脱下来的核酸放于新的1.5ml离心管中。2、实时荧光pcr扩增取0.2mlpcr管，分别加入45μlpcr反应液和5μl上述洗脱液，盖上管盖，转移到扩增检测区。本实施例所提供的实时荧光pcr扩增的反应体系如下表2所示。表2组份每一个反应中的体积或浓度mg2+4mmdntps(100mm)0.25mmtaq酶(5u/μl)5useqidno.1～12100nmseqidno.13～1650nmseqidno.17～1860nmseqidno.19～2080nmpcrbuffer(1.5×)upto50μl实时荧光pcr扩增程序如下表3所示。表3三、结果及分析本实施例所用taqman探针法荧光定量pcr其原理为：pcr扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光检测探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，此时5’端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3’端荧光淬灭基团(发生荧光共振能量转移，fret)，因此检测探针完整时，检测不到该探针5’端荧光报告基团发出的荧光。但在pcr扩增中，溶液中的模板变性后低温退火时，引物与检测探针同时与模板结合。在引物的介导下，沿模板向前延伸至检测探针结合处，发生链的置换，taqdna聚合酶的5’-3’外切酶活性(此活性是多链特异性的，游离的单链探针不受影响)将探针5’端连接的荧光报告基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3’端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光信号，即每扩增一条dna链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步。荧光引物熔解曲线法的原理是：在靶点的特异性引物的5’端标记荧光猝灭基团，在特异性引物靠近3’端的位置标记荧光报告基团，荧光猝灭基团和荧光报告基团之间的间距优选为15-25nt，随着pcr不断的扩增，pcr体系内将会积累大量带有荧光的扩增靶序列片段，pcr扩增结束后，进行熔解曲线法分析，当温度低于扩增产物设计的tm值时，带荧光的扩增产物在体系中为相互杂交的dna双链状态，此时由于荧光报告基团和猝灭基团的物理位置较远，故而荧光报告基团产生的荧光不能被荧光猝灭基团猝灭，体系可以检测到较强的荧光信号；当温度高于扩增产物设计的tm值时，带荧光的扩增产物在体系中以dna单链的形式存在，这时由于寡聚核苷酸的分子柔性，导致荧光报告基团与荧光猝灭基团的物理位置较近，进而荧光报告基团发出的荧光会被荧光猝灭基团所猝灭，体系检测的荧光信号会相应减弱，因此，通过监测荧光信号的强弱变化就可以检测是否有目的序列扩增，进而就可以检测出是否有目的菌种。本实施例的技术原理即是一个通道的其中一个靶点利用taqman探针法，通过ct值来判读检测阴阳性，而同一通道中的另一个靶点利用的是熔解曲线分析法，通过是否有熔解曲线特征峰来判读检测阴阳性。1.分析流程1)目的检测信号为fam、hex(或vic)、rox和cy5。2)baseline的设置：baseline一般设置为3～15个循环，具体可根据实际情况进行调整。其调整原则为：选择指数扩增前荧光信号较稳定的区域，起点(start)避开荧光采集起始阶段的信号波动，终点(end)比最早出现指数扩增的样本ct减少1～2个循环。threshold的设置：设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点，一般取扩增斜率1/3～1/2处。3)先分析内参在hex通道是否检测到tm(80～82℃)特征峰，若有，表示本次结果有效，可继续进行后续分析：a)若fam通道检测到扩增曲线，且ct＜40，表示肺炎克雷伯杆菌检测结果为阳性；若fam通道检测到tm(71～73℃)特征峰，表示嗜肺军团菌检测结果为阳性；b)若hex通道检测到扩增曲线，且ct＜40，表示肺炎链球菌检测结果为阳性；c)若rox通道检测到扩增曲线，且ct＜40，表示流感嗜血杆菌检测结果为阳性；若rox通道检测到tm(70～72℃)特征峰，表示百日咳杆菌检测结果为阳性；d)若cy5通道检测到扩增曲线，且ct＜40，表示铜绿假单胞菌检测结果为阳性；若cy5通道检测到tm(76～77℃)特征峰，表示卡他莫拉菌检测结果为阳性。4)若在内参在hex通道没有检测到tm(80～82℃)特征峰，表示本次检测样本浓度太低或者有干扰物质抑制反应，需重新准备实验。2.结果利用各靶标的阳性质粒做模板，模拟实验样本，在宏石荧光定量pcr仪器(型号：slan-96p)上进行多重pcr检测，结果如图1～图9所示。灵敏度分析：取梯度稀释的样本dna，浓度分别为10、100、1000拷贝/μl，分别对3个浓度进行检测，取5μl做模板。结果如图10～图15所示，结果表明本发明的方法灵敏度高，检测浓度可达10拷贝。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。序列表<110>湖南圣湘生物科技有限公司<120>用于联合检测多种呼吸道细菌的荧光pcr检测体系、试剂盒及检测方法<160>20<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ctttcccatgatgagcacctt21<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tgaccggcgagtagtcca18<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tgcagagcgtcctttggtctat22<210>4<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ctcttactcgtggtttccaacttga25<210>5<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5tgcggtagtgttagaaaatggtattatg28<210>6<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6ggacaaacatcacaagcggtta22<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7agcagccactccaaagaaacc21<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8ccagagcttcgtcagccttg20<210>9<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9tctttcgctccagctgttcgtc22<210>10<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10tggcgcccataagcaacactcgaa24<210>11<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11acaaagcgtatcaatactacaacgagacgc30<210>12<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12tctgaccgctaccgaagacgcagc24<210>13<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13agttgtcttatagcattggtgcc23<210>14<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14agccaattgagcgccact18<210>15<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15cccggcgatctgctgca17<210>16<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16atggcacagccgatggcc18<210>17<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17gtgagtgccgcttttacaacc21<210>18<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18tgtatcgcctgccaagacaa20<210>19<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19aagtgctcggtgcctttagtg21<210>20<211>23<212>dna<2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