上呼吸道病症的快速评估的制作方法

专利名称：：上呼吸道病症的快速评估的制作方法上呼吸道病症的快速评估制月體上呼吸道病症包括涉及上呼吸道(如鼻子、鼻窦、咽、喉或支气管)的急性感染和全身感染，例如鼻鼻窦炎(普通感冒)、鼻窦炎、咽炎/扁桃体炎、喉炎、支气管炎和流行性感冒(流感)等。受到呼吸系统不适(例如鼻塞、咳嗽、流涕、喉咙疼痛、发烧、面部紧张和打喷嚏)折磨的病人，往往寻求临床医生的建议以尽力减少或克服他们的不适。然而，对于面对此类病人的临床医生而言，确定哪一种主要病因是造成某一特定病人所经历的不适的成因，通常是一件令人生畏的任务。上呼吸道病症常见的病毒性病因包括，例如，鼻病毒、冠状病毒、流感A或B病毒、副流感病毒和腺病毒等，而常见的细菌学病因包括肺炎衣原体、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌和肺炎支原体等。某些过敏症也可能导致上呼吸道病症。不幸的是，确切病因的错误诊断可能相当成问题。例如，将一种过敏症错误诊断为鼻窦炎可能会造成开具一个疗程抗生素的不必要的处方，这将对减轻过敏性不适没什么帮助，且会提高之后抗性细菌感染的可能性。就这点而言，目前存在对于快速简单地评估上呼吸道病症的技术的需求。发明概沭根据本发明的一个实施方式，公开了一种用于快速检测上呼吸道测试样品中微生物的方法。该方法包括将测试条和上呼吸道测试样品相接触。该测试条包含至少一种广谱指示剂，该广谱指示剂在细菌存在时显示第一光谱响应，而在病毒存在时显示第二光谱响应。该测试条还包含含有至少一种区分性指示剂的阵列，该阵列在一种微生物存在时显示第三光谱响应，而在另一种微生物存在时显示第四光谱响应。观察该广谱指示剂的第一光谱响应或第二光谱响应，该第二光谱响应的存在表示样品中病毒的存在。其后，观察该阵列的第三光谱响应或第四光谱响应。根据本发明的另一个实施方式，公开了用于快速检测上呼吸道测试样品中微生物的试剂盒。该试剂盒包含用于从宿主的上呼吸道收集测试样品的器具和包含至少一种广谱指示剂的测试条，该广谱指示剂在细菌存在时显示第一光谱响应，而在病毒存在时显示第二光谱响应。该测试条还包含含有至少一种区分性指示剂的阵列，该阵列在一种微生物存在时显示第三光谱响应，而在另一种微生物存在时显示第四光谱响应。下文将更详细地讨论本发明的其它特征和方面。附图简沭针对本领域普通技术人员，本发明全面和能够实现的公开内容，包括其最佳方式将在本说明书的其它部分进行更为详细地说明，其说明将参考所附的图，其中图1为本发明示例性的测试条的透视图，包括在与测试样品接触之前(图1A)，与感染了细菌的测试样品接触之后(图1B);和与没有感染细菌的测试样品接触后(图1C)。在本说明书和附图中的附图标记重复使用，其目的是表示本发明的相同或类似的特征或元素。代表'性輔材白勺糊定义如本文所用，术语"上呼吸道测试样品"一般指从宿主的上呼吸道直接或间接获得的生物材料，例如从鼻道、口腔和咽喉等。可以通过任何期望的方法获得该测试样品，例如采用拭子。也可采用以某一方式获得的或预处理的测试样品。例如，该预处理可包括过滤、沉淀、稀释、蒸馏、混合、浓縮、干扰组分的灭活、试剂的加入和细胞溶解等。如本文所用，术语"宿主"指任何动物，优选为人。发明详沭现在将对本发明的各种实施方式进行详细的介绍，下文说明了其中的一个或多个实施例。提供的每一个实施例用以解释本发明，而非限制本发明。事实上，在本发明中可进行各种修饰和变化而不会脱离本发明的范围或精神，这对本领域技术人员来说是明显的。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可用于另一个实施方式以产生又一个实施方式。因此，其目的是本发明涵盖这些修饰和变化，它们均属于所附权利要求及其等同物的范围之内。—般来说，本发明在于保护一种用于快速评估上呼吸道病症的方法。更具体地，该方法包括将从宿主上呼吸道获得的样品与测试条相接触。该测试条含有指示剂，该指示剂在细菌、霉菌、酵母菌或其它微生物存在时提供广谱响应，该广谱响应不同于病毒存在时该指示剂的响应。这使得就该测试样品是被病毒感染还是被其它某微生物感染进行快速和简单的评估。为了帮助临床医生确定治疗的正确疗程，获得关于存在的特定种类微生物的更多信息也可能是理想的。就这一点，该测试条含有一种或多种区分性指示剂的任何阵列，该阵列在不同种类微生物存在时提供某种光谱响应。例如，该阵列在革兰氏阴性细菌存在时可以提供某一种光谱响应，但在革兰氏阳性细菌存在时提供一种完全不同的光谱响应。同样地，该阵列在鼻病毒(与普通感冒有关)存在时可以提供某一种光谱响应，但在流感病毒存在时提供一种不同的响应。因此对指示剂提供的光谱响应进行检测可以使得在不同种类微生物之间进行快速的区分。根据本发明可对多种微生物中的任一种进行检测。例如，革兰氏阳性菌(如化脓性链球菌和肺炎链球菌)和革兰氏阴性菌(如腔隙莫拉氏菌、流感嗜血杆菌和肺炎衣原体)往往与上呼吸道病症有关，可在本发明中被检测。革兰氏阴性菌具有脂多糖(LPS)包被的细胞壁。革兰氏阳性菌被厚的片状肽聚糖(或胞壁质)层包被。上呼吸道病症最为普遍的细菌性病因为肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和化脓性链球菌。化脓性链球菌为革兰氏阳性、无运动、不产生孢子的球菌，细胞成链或成对出现。化脓性链球菌为不含过氧化氢酶的耐氧厌氧菌(兼性厌氧菌)，且需要含有血液的富集培养基以进行生长。流感嗜血杆菌为巴斯德菌科中小型、无运动革兰氏阴性菌。与上呼吸道病症有关的最常见的病毒为以下属的病毒鼻病毒(如42型鼻病毒)、流感病毒A(如H1N1、H1N2、H2N2或H3N2株)、流感病毒B、流感病毒C、呼吸道病毒(如1、2、3和4型人副流感病毒)、单纯疱疹病毒(如I型单纯疱疹和II型单纯疱疹)、哺乳动物腺病毒(如1、2、5和6型腺病毒)和冠状病毒(如人冠状病毒229E、人冠状病毒NL63、人冠状病毒0C43、SARS-CoV和IBV)。在这些常见种类的病毒中，单纯疱疹病毒和哺乳动物腺病毒一般为含有二十面体衣壳的双链DNA病毒。单纯疱疹病毒一般拥有被包膜的病毒粒子，而哺乳动物腺病毒为裸露的。鼻病毒、流感病毒、副流感病毒和冠状病毒为单链RNA病毒。鼻病毒含有二十面体衣壳且并未被包膜，流感病毒和副流感病毒含有螺旋状衣壳且被包膜，而冠状病毒具有不对称衣壳并被包膜。如上文所提到的，在本发明中采用了指示剂，该指示剂能够提供对于细菌或其它微生物的广谱响应，该广谱响应不同于它对于病毒的响应。尽管并不被限于任何特殊类型，本发明人已发现在广谱的细菌或其它微生物存在时，溶剂化显色指示剂在发生独特的颜色变化方面特别有效，而在与上呼吸道病症有关的病毒存在时即使有任何变化，其变化也非常小。部花青指示剂(如单-、双-和三-部花青)是可以用于本发明的一类溶剂化显色指示剂的一个例子。例如部花青540，属于Griffiths在"ColourandConstitutionofOrganicMolecules"AcademicPress,London(1976)中所论述的的供体-单一受体指示剂的分类。更具体地，部花青指示剂具有由偶数个次甲基碳的共轭链分开的碱性核和酸性核。此类指示剂具有作为电子受体部分的羰基基团。该电子受体与例如羟基基团或氨基基团的电子供体基团共轭。该部花青指示剂可以为环状或非环状的(例如，环状部花青指示剂的插烯酰胺)。例如，环状部花青指示剂一般具有以下结构11，其中，n为包括0的任何整数。如上述通式结构1和1'所说明的，部花青指示剂通常具有电荷分开(即"两性离子的")的共振形式。两性离子指示剂是既含有正电荷又含有负电荷且为净中性的但高度带电荷的指示剂。不打算受理论所限，相信该两性离子形式显著地促成该指示剂的基态。因而此类指示剂产生的颜色取决于该指示剂的基态和激发态之间的分子极性差异。下述结构2说明了部花青指示剂的一个具体例子，该例子的基态比激发态极性更高左边电荷分开的标准式2为基态的主要促成因素，而右边的标准式2'为第一激发态的主要促成因素。下列结构3-13说明了适合的部花青指示剂的其它例子。a36<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中"R"为例如甲基、烷基、芳基、苯基等的基团。靛青为用于本发明的适合的溶剂化显色指示剂的另一个例子。靛青具有极性显著低于激发态的基态。例如，靛青一般具有以下结构14:1414，左边标准式14为该指示剂基态的主要促成因素，而右边标准式14'为激发态的主要促成因素。可在本发明使用的其它适合的溶剂化显色指示剂包括具有永久两性离子形式的溶剂化显色指示剂。即，这些指示剂具有包含于相邻n-电子体系内的形式正负电荷。与上述引用的部花青指示剂相反，对于该永久两性离子指示剂，无法画出中性共振结构。这一类示例性的指示剂包括N-酚盐甜菜碱指示剂，例如含有下列通式结构的指示剂<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>其中R「R5分别选自氢，硝基基团(如氮)，卤素，或直链、支链或环状的C「C2。基团(如烷基、苯基、芳基、妣啶基等)，该d-(^基团可以为饱和的或不饱和的，和未被取代的或任选地在同一个或不同碳原子上被一个、两个或多个卤素、硝基、氰基、羟基、烷氧基、氨基、苯基、芳基、吡啶基或烷基氨基基团所取代。例如，该N-酚盐甜菜碱指示剂可以是具有下列通式结构15的4-(2，4，6-三苯基吡啶鎗-l-基)-2，6-二苯基酚盐(雷查德染料)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>雷查德染料表现出强烈的阴性溶剂化显色现象，并可以因此在细菌存在时发生从蓝色到无色的显著的颜色变化。即，雷查德染料显示吸光度向更短波长的位移，从而随着溶剂洗脱液强度(极性)增加具有可见的颜色变化。下列结构16-23说明了适合的阴性溶剂化显色吡啶鎗N-酚盐甜菜碱指示剂的其它例子<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>其中，R为氢、-C(CH3)3、<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>23具有永久两性离子形式的指示剂的其它例子包括具有下列通式结构24的指示剂<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>其中，n为0或大于0，X为氧、碳、氮、硫等。以结构24表示的永久两性离子指示剂的具体例子包括下列结构25-33。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>还有其它适合的溶剂化显色指示剂，可包括但不限于4-二氰亚甲基_2-甲基-6-(对-二甲氨基苯乙烯基)-4H-妣喃(DCM);6-丙酰_2-(二甲氨基)萘(PR0DAN);9-(二乙氨基)-5H-苯[a]吩噁嗪-5-酮(尼罗红)；4-(二氰乙烯基)久洛尼定(DCVJ);酚蓝；杂芪指示剂；香豆素指示剂；酮花青指示剂；N，N-二甲基-4-硝基苯胺(NDMNA)和N-甲基-2-硝基苯胺(NM2NA);尼罗蓝;1-苯氨基萘_8_磺酸(1，8_ANS)，和d即oxyl丁基磺胺(DBS)和其它d即oxyl类似物。除了以上提到的指示剂外，还有一些可用于本发明的适合的指示剂包括但不限于4-[2-N-取代的-l，4-羟基吡啶-4-亚基)亚乙基]环己-2，5_二胺-1-酮、红吡唑啉酮指示剂、甲亚胺指示剂、靛苯胺指示剂及它们的混合物。除了广谱指示剂之外，还采用了一种或多种能够在某些种类微生物之间进行区分的指示剂(如染料、颜料等)。例如，可采用能够检测微生物生长培养基中pH变化的pH敏感性指示剂。例如，细菌和病毒可使生长培养基发生新陈代谢而产生造成pH变化的酸性化合物(如C02)或碱性化合物(如氨)。同样，某些微生物(如细菌)在它们的细胞壁上含有高度组织化的酸部分。因为对于不同微生物该酸性/碱性转变可能发生变化，在本发明中可以选择经调整用于期望的pH转变的pH敏感性指示剂。以这种方式，可提供带有pH敏感性指示剂的测试条，该指示剂被设置成只有在显示某一酸性/碱性转变的细菌或病毒存在时发生可检测的颜色变化。酞类指示剂组成了一类可应用于本发明测试条的适合的pH敏感性指示剂。例如，酚红(即酚磺酞)在pH范围6.6到8.0显示出从黄色到红色的转变。pH约8.1以上，酚红变成鲜艳的粉(梅红)色。酚红的衍生物也可适合在本发明中使用，例如用氯、溴、甲基、羧酸钠、羧酸、羟基和氨基官能团取代的酚红衍生物。示例性的取代的酚红化合物包括，例如，氯酚红、间甲酚紫(间甲酚磺酞)、甲酚红(邻甲酚磺酞)、焦儿茶酚紫(焦儿茶酚磺酞)、氯酚红(3'，3〃_二氯酚磺酞)、二甲苯酚蓝(对二甲苯酚磺酞的钠盐)、二甲酚橙、媒介蓝3(C.1.43820)、3，4，5，6-四溴酚磺酞、溴代二甲苯酚蓝、溴酚蓝(3'，3〃，5'，5〃-四溴酚磺酞)、溴氯酚蓝(二溴-5'，5〃_二氯酚磺酞的钠盐)、溴甲酚紫(5'，5〃-二溴-邻-甲酚磺酞)和溴甲酚绿(3'，3〃，5'，5〃-四溴-邻-甲酚磺酞)等。还有其它适合的酞类指示剂是本领域众所周知的，且可以包括溴百里酚蓝、百里酚蓝、溴甲酚紫、百里酚酞和酚酞(通用指示剂的常见组分)。例如，氯酚红在约4.8到6.4的pH范围显示出从黄色到红色的转变；溴百里酚蓝在约6.0到7.6的pH范围显示出从黄色到蓝色的转变；百里酚酞在约9.4到10.6的pH范围显示出从无色到蓝色的转变；酚酞在约8.2到10.0的pH范围显示出从无色到粉色的转变；百里酚蓝在约1.2到2.8的pH范围显示出从红色到黄色的第一转变和在8.0到9.6的pH范围显示出从黄色到pH的第二转变；溴苯酚蓝在约3.0到4.6的pH范围显示出从黄色到紫色的转变；溴甲酚绿在约3.8到5.4的pH范围显示出从黄色到蓝色的转变；以及溴苯酚紫在约5.2到6.8的pH范围显示出从黄色到紫色的转变。羟基蒽醌组成了用于本发明的另一类适合的pH敏感性指示剂。羟基蒽醌具有以下通式结构O通式中显示的数字1-8代表在稠环结构上官能团取代可能发生的位置。对于羟基蒽醌，至少一个官能团是羟基(-0H)基团或含有一个羟基(-0H)基团。在该稠环结构上可能取代的其它官能团的例子包括卤素基团(如氯或溴基团)、磺酰基团(如磺酸盐)、烷基基团、苯甲基基团、氨基基团(如伯胺、仲胺、叔胺或季胺)、羧基基团、氰基基团和磷基团等。可在本发明中使用的一些适合的羟基蒽醌，媒介红11(茜素)、媒介红3(茜素红S)、茜素黄R、茜素氨羧络合剂、媒介黑13(茜素蓝黑B)、媒介紫5(茜素紫3R)、茜素黄GG、天然红4(胭脂红酸)、氨基-4-羟基蒽醌、大黄素、核固红、天然红16(红紫素)、醌茜素等。例如，胭脂红酸在约3.0到5.5的pH范围显示出从橙色到红色的第一次转变和在约5.5到7.0的pH范围显示出从红色到紫色的第二次转变。在另一方面，茜素黄R在约10.1到12.0的pH范围显示出从黄色到橙红色的转变。还有一类可应用于测试条中的适合的pH敏感性指示剂为具有以下通式结构的芳香族偶氮化合物X-R「N=N-R2_Y其中，&为芳香族基团；R2选自脂肪族基团和芳香族基团；禾口X和Y分别选自氢、卤化物、_N02、_朋2、芳基基团、烷基基团、烷氧基基团、磺酸盐基团、-S03H、-OH、-COH、-C00H和卤化物等。适合的还有偶氮衍生物，例如氧化偶氮化合物(X-R「N=NO-R厂Y)或氢化偶氮化合物(X-R「NH-NH-R厂Y)。此类偶氮化合物(或其衍生物)的具体例子包括甲基紫、甲基黄、甲基橙、甲基红和甲基绿。例如，甲基紫在约0到1.6的pH范围发生从黄色到蓝紫色的转变，甲基黄在约2.9到4.0的pH范围发生从红色到黄色的转变，甲基橙在约3.1到4.4的pH范围发生从红色到黄色的转变，和甲基红在约4.2到6.3的pH范围发生从红色到黄色的转变。芳基甲烷(如二芳基甲烷和三芳基甲烷)组成了用于本发明的又一类适合的pH15其中R、R'和R"分别选自被取代的和未被取代的芳基基团，例如苯基、萘基和蒽基等。该芳基基团可被官能团取代，官能团例如氨基、羟基、羰基、羧基、磺酸基、烷基和/或其它已知的官能团。此类三芳基甲烷隐色碱的例子包括隐色孔雀绿、副品红碱、结晶紫内酯、结晶紫隐色体、结晶紫、CI碱性紫1、CI碱性紫2、CI碱性蓝、CI维多利亚蓝和N-苯甲酰基隐色体-亚甲基等。同样适合的二芳基甲烷隐色碱可包括4，4'-双(二甲基氨基)二苯基甲醇(也称为"双(二甲基氨基苯)甲醇")、双(二甲基氨基苯)甲醇隐色苯并三唑、双(二甲基氨基苯)甲醇隐色吗啉、双(二甲基氨基苯)甲醇隐色苯磺酰胺等。在一个具体实施方式中，该指示剂为隐色孔雀绿甲醇(溶剂绿l)或其类似物，该指示剂通常无色且具有以下结构在酸性条件下，隐色孔雀绿甲醇形式的一个或多个自由氨基基团可被质子化以形成孔雀绿(也已知为苯胺绿、碱性绿4、金刚绿B或维多利亚绿B)，其具有以下结构孔雀绿通常在pH范围0.2到1.8显示出从黄色到蓝绿色的转变。在pH约1.8以上，孔雀绿变成深绿色。可被应用于测试条中其它适合的pH敏感性指示剂包括刚果红、石蕊(石蕊精)、亚甲基蓝、中性红、酸性品红、靛类胭脂红、亮绿、苦味酸、酸性间胺黄、m-间甲酚紫、奎哪啶红、苯胺黄00、2，6-二硝基酚、焰红染料B、2，4-二硝基酚、4-二甲基氨基偶氮苯、2，5-二硝基酚、l-萘基红、氯苯红、苏木紫、4-硝基酚、硝嗪黄、3-硝基酚、碱性蓝、依波西隆蓝、尼罗蓝A和通用指示剂等。例如，刚果红在约3.0到5.2的pH范围发生从蓝色到红色的转变；石蕊在约4.5到8.3的pH范围发生从红色到蓝色的转变，而中性红在约11.4到13.0的pH范围发生从红色到黄色的转变。除了pH以外，其它机制也可能是引起指示剂中颜色变化的全部或部分成因。例如，许多微生物(如细菌)在生长培养基中产生低分子量的铁络合化合物，这些微生物已知为"铁载体"。因此，在铁载体存在时发生颜色变化的金属络合指示剂可被应用于本发明的某些实施方式中。一类特别适合的金属络合指示剂为芳香族偶氮化合物，例如羊毛铬黑T、羊毛铬蓝SE(络蓝B)、羊毛铬蓝黑B、羊毛铬花青R、二甲酚橙、铬天青S和胭脂红酸等。还有其它适合的金属络合指示剂，可包括茜素氨羧络合剂、茜素S、偶氮胂III、金精三羧酸、2，2'_双吡啶、溴邻苯三酚红、茜素蓝黑(羊毛铬蓝黑R)、钙红、变色酸、二钠盐、铜腙、5-(4_二甲基氨-亚苄基)绕丹宁、丁二酮肟、1，5-二苯卡巴肼、双硫腙、荧光素氨羧络合剂、苏木紫、8-羟基喹啉、2-巯基苯并噻唑、甲基百里酚蓝、红紫酸铵、l-亚硝基-2-萘酚、2-亚硝基-l-萘酚、亚硝基-R-盐、l，10-菲咯啉、苯基荧光酮、酞紫、l-(2-吡啶基偶氮)-萘酚、4-(2-吡啶基偶氮)间苯二酚、焦性没食子酚红、偶氮磺III、5-磺基水杨酸、4-(2-噻唑基偶氮)间苯二酚、钍试剂、百里酚酞氨羧络合剂(Thymolthalexon)、钛试剂、Tolurnr-3，4-二硫醇和锌试剂等。应当注意的是以上引用的一种或多种pH敏感性指示剂可也被分类为金属络合指示剂。尽管以上引用的指示剂是基于它们颜色变化的机制(例如，pH敏感性的、金属络合的或溶剂化显色的)而分类的，应当理解本发明并不限于颜色变化的任何特殊机制。例如，即使采用PH敏感性指示剂时，其它机制实际上也可以是该指示剂颜色变化的完全或部分的成因。例如，在该指示剂和微生物之间的氧化还原反应也可促进颜色变化。为了形成本发明的测试条，可将指示剂施加到基材上，例如薄膜、纸、非织造网、针织物、机织织物、泡沫和玻璃等。例如，用于形成该基材的材料可包括但不限于天然的、合成的或被合成修饰的天然存在的材料，例如多糖(例如，如纸和纤维素衍生物的纤维素材料，例如乙酸纤维素和硝化纤维素)；聚醚砜；聚乙烯；尼龙；聚偏氯乙烯(PVDF);聚酯；聚丙烯；二氧化硅；无机材料，例如减活氧化铝、硅藻土，MgS04或其它均一分散在多孔聚合物基质上的精细分开的无机材料，该聚合物例如氯乙烯、氯乙烯_丙烯共聚物和氯乙烯_乙酸乙烯酯共聚物；天然存在的(如棉)和合成的(如尼龙或人造纤维)布；多孔胶，例如硅胶、琼脂糖、右旋糖苷和明胶凍合膜，例如聚丙烯酰胺；等。如有必要，可以以包含移动载体的组合物的形式施加指示剂。该载体可以是液体、气体、凝胶等，且可选择载体以提供该指示剂期望的性能(用于颜色变化的时间、在不同区域之间进行对比和敏感性)。例如，在某些实施方式中，载体可以是含水溶剂，例如水，以及非水溶剂，例如二元醇类(如丙二醇、丁二醇、三甘醇、己二醇、聚乙二醇、乙氧二甘醇和双丙甘醇)；醇类(如甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇)；甘油三酯类；乙酸乙酯；丙酮；甘油三乙酸酯；乙腈、四氢呋喃；二甲苯；甲醛类(如二甲基甲酰胺"DMF");等。其它添加剂也可单独施加或与指示剂组合物共同施加到测试条中。例如，在一个实施方式中，采用了环糊精，环糊精被认为抑制指示剂的结晶化，因此提供更鲜艳的颜色，也可提高检测敏感度。即，单个指示剂分子对于微生物具有更高的敏感度，因为每一个指示剂分子能够自由的与微生物细胞膜相互作用。相比之下，指示剂的小晶体必须先溶解，然后渗透该细胞膜。适合的环糊精的例子可以包括但不限于羟丙基-P-环糊精、羟乙基_P-环糊精、Y_环糊精、羟丙基_Y-环糊精和羟乙基_Y-环糊精，这些从位于Indiana的Hammond的CerestarInternational购买得至U。表面活性剂也可有助于增强不同指示剂之间的对比。特别理想的表面活性剂为非离子表面活性剂，例如乙氧基化烷基酚、乙氧基化和丙氧基化的脂肪醇、环氧乙烷_环氧丙烷的嵌段共聚物、脂肪酸(c8-c18)的羟乙基化酯，环氧乙烷和长链胺或酰胺的縮合产物、环氧乙烷和醇的縮合产物、炔二醇及上述物质的混合物。适合的非离子表面活性剂的各种具体例子包括但不限于甲基葡糖醇聚醚-10、PEG-20甲基葡萄糖二硬脂酸酯、PEG-20甲基葡萄糖倍半硬脂酸酯、Cn-C^parath-20、鲸蜡醇聚醚_8、鲸蜡醇聚醚_12、十二烷基苯酚聚醚-12、月桂醇聚醚-15、PEG-20蓖麻油、聚山梨醇酯20、硬脂醇聚醚-20、聚氧乙烯-10鲸蜡基醚、聚氧乙烯-10硬脂酰醚、聚氧乙烯-20鲸蜡基醚、聚氧乙烯-10油醚、聚氧乙烯-20油醚、乙氧基化的壬基酚、乙氧基化的辛基酚、乙氧基化的十二烷基酚或乙氧基化的脂肪醇(&-(:22)，包括3-20个环氧乙烷部分，聚氧乙烯-20异鲸蜡烷醚(polyoxyethylene-20isohexadecylether)、聚氧乙烯-23月桂酸甘油酯、聚氧_乙烯-20硬脂酸甘油酯、PPG-10甲基葡萄糖醚、PPG-20甲基葡萄糖醚、聚氧乙烯-20山梨醇酐单酯、聚氧乙烯-80蓖麻油、聚氧乙烯-15十三烷醚、聚氧_乙烯-6-十三烷醚、月桂醇聚醚_2、月桂醇聚醚_3、月桂醇聚醚-4、PEG-3蓖麻油、PEG600二油酸酯、PEG400二油酸酯以及以上物质的混合物。可以商购的非离子表面活性剂可包括可从位于Pennsylvania的Allentown的AirProductsandChemicals获得的SURFYN0L系列的炔二醇表面活性剂和从位于Pennsylvania的Pittsburgh的FischerScientific获得的TWEEN⑧系列的聚氧乙烯表面活性剂。还可以采用粘合剂以促进指示剂固定在基材上。例如，水溶性的有机聚合物，如多糖及其衍生物可以作为粘合剂使用。多糖是含有重复的碳水化合物单元的聚合物，其可以是阳离子的、阴离子的、非离子的和/或两性的。在一个具体实施方式中，所述多糖是非离子的、阳离子的、阴离子的和/或两性的纤维素醚。适合的非离子的纤维素醚可以包括但不限于烷基纤维素醚，例如甲基纤维素和乙基纤维素；羟烷基纤维素醚，例如羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基羟丁基纤维素、羟乙基羟丙基纤维素、羟乙基羟丁基纤维素和羟乙基羟丙基羟丁基纤维素；烷基羟烷基纤维素醚，例如甲基羟乙基纤维素、甲基羟丙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、乙基羟丙基纤维素、甲基乙基羟乙基纤维素和甲基乙基羟丙基纤维素；等。用于将指示剂组合物施加到基材上的适合的技术包括印刷、浸渍、喷涂、熔化挤压、涂层(例如，溶剂涂层、粉末涂层、用刷子涂层等)、喷涂等。印刷技术可包括，例如凹板印刷、柔版印刷、丝网印刷、激光印刷、热色带印刷和活塞印刷等。在一个具体实施方案中，使用喷墨印刷技术将指示剂施加到基材上。喷墨印刷是一种无接触的印刷技术，包括迫使墨水通过微小的喷嘴(或一系列的喷嘴)以形成指向基材的液滴。通常利用两种技术，即"D0D"(按需要滴下)或"连续的"喷墨印刷。在连续体系中，墨水在压力下以连续的液流经过至少一个孔口或喷嘴放射出来。液流被增压致动器扰乱以使液流在距离孔口的固定距离处破碎成液滴。相反，DOD体系在每个孔口采用一个增压致动器将墨水破碎成液滴。每种体系中的增压致动器可以是压电晶体、声基阵列、热基阵列等。喷墨体系类型的选择可根据将要从印头被印刷的材料类型而变化。例如，传导性材料有时需要连续体系，因为液滴被静电偏离。因此，当样品通道由绝缘材料形成时，D0D印刷技术可能更理想。采用多种已知的组分和/或方法中的任何一种可以将该指示剂组合物形成为印刷墨水。例如，该印刷墨水可以包含水作为载体，特别是去离子水。在墨水中也可以包含各种共载体(co-carrier)，如内酞胺J-甲基吡咯烷酮J-甲基乙酞胺J-甲基吗琳-N-氧化物、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基甲酰胺、丙二醇-单甲醚、环丁砜、三丙二醇单甲醚、丙二醇和三乙醇胺(TEA)。还可以利用湿润剂，如乙二醇；二乙二醇；甘油；聚乙二醇200、300、400禾口600;l，3—丙二醇；丙二醇单甲鹏，如DowanolPM(GalladeChemicalInc.，SantaAna，CA);多元醇；或以上物质的组合。还可以包含其它添加剂以改善墨水的性能，如包含鳌合剂以隔离随时间推移可能参与到化学反应里的金属离子，包含腐蚀抑制剂以帮助保护印刷机或墨水输送体系的金属部件，以及表面活性剂以调节墨水的表面张力。用在墨水中的各种其它组分，如着色稳定剂、光引发剂、粘合剂、表面活性剂、电解质盐、pH值调节剂等，可以如Nohr等人的美国专利号Nos.5，681，380和6，542，379中的描述使用，本文出于全部目的将它们的全部内容在此引入作为参考。采用的指示剂的精确用量可基于多种因素变化，包括指示剂的灵敏度、其它添加剂的存在、检测能力所期望的程度(例如，借助肉眼)、所怀疑的微生物的浓度等。在一些情况中，只检测以作为特定阈值浓度(如致病的)的浓度存在的微生物是所期望的。例如，细菌浓度为每毫升测试样品中约lxl03个菌落形成单位("CFU")或更大浓度，在一些实施方式中为约lxl05CFU/ml或更大浓度，在一些实施方式中为约lxl06CFU/ml或更大浓度，而在一些实施方式中，在本发明中可检测约lxl07CFU/ml。因此，可以以细菌存在时足以发生可检测颜色变化的量使用指示剂，该细菌存在的浓度为每毫升测试样品中至少有约lxl03CFU。例如，该指示剂可以以每毫升载体中约0.1至约100毫克的浓度施加，在一些实施方案中以每毫升载体中约0.5至约60毫克的浓度施加，而在一些实施方案中以每毫升载体中约1至约40毫克的浓度施加。指示剂改变颜色的程度可以通过视觉或使用仪器来确定。在一个实施方案中，用光学读数器测定颜色强度。如本领域技术人员能容易理解的，该光学读数器的实际配置和结构通常可以变化。通常，该光学读数器包括能够发出电磁辐射的照明源和能够寄存信号(如传递的或反射的光线)的检测器。该照明源可以是本领域中已知的能够提供电磁辐射的任何装置，电磁辐射例如在可见范围或靠近可见范围的光(例如，红外线或紫外线)。例如，可用于本发明的适合的照明源包括但不限于发光二极管(LED)、闪光灯、冷阴极荧光灯和电致发光灯等。照明可以是多路和/或准直的。在一些情况中，照明可以是脉冲的以减少任何背景干扰。此外，照明可以是连续的或可以结合连续波(CW)和脉冲照明，其中多路照明光线是多路复用的(例如，脉冲束与CW束多路复用)，允许在由CW源诱发的信号和由脉冲源诱发的信号之间进行信号分辨。例如，在一些实施方案中，将LEDs(例如，砷化稼铝红色二极管、磷化稼绿色二极管、磷砷化稼绿色二极管或氮化稼铟紫/蓝/紫外线(UV)二极管)用作该脉冲照明源。适合用于本发明的适合的UVLED激发二极管的一个可以商购的例子是ModelNSHU550E(NichiaCorporation)，其在IO毫安(3.5-3.9伏特)的正向电流下发出750至1000微瓦的光强，形成在10度的半最大值下具有完整宽度，具有370-375纳米的峰值波长和12纳米的光谱半宽度的光束。在一些情况中，该照明源可以向指示剂提供漫射照明。例如，可以简单地采取多点光源(例如LEDs)的阵列以提供相对漫射的照明。另一种特别期望的能够以相对低廉的方式提供漫射照明的照明源是电致发光(EL)装置。EL装置一般为利用夹在电极之间的发光材料(例如磷颗粒)的电容结构，其中至少一个电极是透明的以使得光散发出来。施加穿透电极的电压在发光材料内产生一个不断变化的电场从而使其发光。19该检测器一般可以是本领域已知的能够感应信号的任何装置。例如，该检测器可以是被配置用于空间分辨的电子成像检测器。这类电子成像感应器的一些例子包括高速、线性电荷耦联装置(CCD)、电荷注入装置(CID)、互补金属氧化物半导体(CMOS)装置等。例如，这类图像检测器一般是电子光线感应器的二维阵列，尽管也可以采用包括单线的检测器像素或光线感应器的线性成像检测器(如线性CCD检测器)，例如，例如用于扫描图像的检测器。每一阵列包括一组已知的独特的位置，该位置可以被称为"地址"。在图像检测器中的每一个地址被覆盖一个区域(例如，形状通常为方框或矩形的区域)的检测器占用。该区域一般被称为"像素"或像素区域。例如，检测器像素，可以是CCD、CID或CMOS感应器或任何其它检测或测定光线的装置或感应器。检测器像素的大小可以在很大程度上变化，在一些情况中检测器像素可以具有低到0.2微米的直径或长度。在其它实施方式中，该检测器可以是缺乏空间分辨能力的光线感受器。例如，这些光线感受器的例子可以包括光电倍增装置、例如雪崩光电二极管或硅光电二极管的光电二极管等。有时硅光电二极管是有利的，因为它们便宜、灵敏、能够高速运转(短上升时间/高带宽)，且容易整合到大多数其它半导体技术和单片式电路中。此外，硅光电二极管体积小，这使得它们容易整合到各种类型的检测体系中。如果采用硅光电二极管，那么发射的信号的带宽范围可以在它们的灵敏度范围内，该范围为400到1100纳米。光学读数器一般可以采用任何已知的检测技术，包括，例如发光(例如荧光、磷光等)、吸光率(例如荧光的或非荧光的)和衍射等。在本发明的一个具体实施方式中，该光学读数器测定颜色强度作为吸光率的一个函数。在一个实施方式中，采用来自位于Virginia的Chantilly的DynexTechnologies,(Model#MRX)的微禾反读数器测定吸光率读数。在另一个实施方式中，采用被称为"CIELAB"的常规测试测定吸光率读数，该常规测试论述于F.Cost白勺PocketGuidetoDigitalPrinting,DelmarPublishers，Albany,NY.ISBN0-8273-7592-l，第144和145页。这一方法定义了三个变量L*、a*和b*，基于颜色感知对向论，这三个变量对应于被感知的颜色的三个特性。该三个变量具有以下含义L*=亮度(或发光度)，范围从0到100，其中0=暗而100=亮；a*=红色/绿色轴，范围约从-100到100;正值为发红色的而负值为发绿色的；和b*=黄色/蓝色轴，范围约从-100到100;正值为发黄色的而负值为发蓝色的。因为CIELAB色域在视觉上有些一致，所以可以计算单一数值，代表被人所感知的两种颜色之间的差别。这一差别被称为AE，通过取这两种颜色之间的三个差值(AL*、Aa*和Ab*)平方和的平方根进行计算。在CIELAB色域中，每一个AE单位约等于两个颜色之间"仅能注意得到的"差别。因此，CIELAB是一种用于与客观装置无关的表色体系的良好测定方法，可以用作参考色域用于颜色管理和颜色改变表达的目的。因此，采用这一测试，可以采用例如来自日本0saka的的MinoltaCo.Ltd.的手持分光光度计(Model#CM2600d)测定颜色强度(L*、a*和b*)。这种仪器利用符合CIE15号，IS07724/1,ASTME1164和JISZ8722-1982漫射照明/8_度观察体系的D/8几何结构。D65光线被样品测定光学体系所接收，D65光线是被样品表面以与表面法线成8度的角度反射的。还有一种适合的光学读数器为反射分光光度计，其描述于kaylor等人的美国专利申请公布号No.2003/0119202，出于全部目的将其全文在此引入作为参考。同样，传输型检测体系也可以用于本发明。上述筛选技术可以以根据本发明的多种方式实施。例如，可以利用含有检测带的20测试条，该检测带提供任何数量的不同的检测区域(例如，线、点和条纹等)，使得使用者可以更好地确定测试样品内病毒、细菌或其它微生物的存在。每个区域可以含有同一种指示剂，或含有用于和不同种类的微生物反应的不同的指示剂。在一个具体实施方式中，该测试条含有指示剂阵列，该阵列对于某些种类的病毒提供不同的光谱响应(例如颜色型)或"指纹"。例如，该阵列可以在鼻病毒存在时提供某一种光谱响应，但在流感病毒、人副流感病毒或其它常与上呼吸道病症有关的病毒存在时可以提供完全不同的响应。类似的，该阵列可以在革兰氏阳性细菌存在时提供某一种光谱响应，但是在革兰氏阴性细菌存在时可以提供完全不同的响应。在应用时，该阵列可以含有多个以预先设定的形式间隔开的分离的区域(被称为"地址")。这些地址含有能够在特定微生物存在时显示颜色变化的指示剂。用于阵列的指示剂的选择对本发明来说并不严格，只要该阵列产生独特的光谱响应即可。单个阵列的地址可以以多种方式设置以实现这个目的。在一个具体实施方式中，单个阵列的地址可含有指示剂，每种指示剂在特殊种类的病毒、细菌或其它微生物存在时显示不同的光谱响应。当然，无需总是通过使用不同的指示剂提供在单个阵列的地址之间的光谱差别。例如，同样的指示剂可以用于单个阵列的地址中，但是以不同的浓度使用以便产生不同的光谱响应。某些地址也可以含有同样浓度的同一种指示剂，只要该阵列作为整体能够产生独特的光谱响应即可。除了单个阵列地址的组合以外，该阵列的多种其它方面也可以选择性地进行控制以加强其提供独特光谱响应的能力。影响该阵列产生独特光谱响应的能力的一个因素是所采用的阵列地址的数目。即，数目更多的单个阵列地址可以加强对于不同微生物的光谱响应变化的程度。然而，地址数目过大也可以导致在光谱响应之间视觉区分的困难。因此，在本发明绝大多数实施方式中，该阵列含有2到50个阵列地址，在一些实施方式中，含有3到约40个阵列地址，而在一些实施方式中，含有4到20个阵列地址。在阵列中采用的地址的数目将最终，至少部分取决于所选择的指示剂的性质。即，如果所选择的指示剂在微生物存在时具有类似的颜色变化，可能需要更多数量的地址以提供期望的光谱响应。可以影响该阵列提供独特光谱响应的能力的另一个方面是单个阵列地址的形式(例如，大小、间隔和排列等)。在不过度增大测试条大小的情况下，单个阵列的地址可以具有允许视觉观察的有效大小。该地址大小的范围可以是，例如约0.01到约100毫米，在一些实施方式中，为约0.1到约50毫米，而在一些实施方式中，为约1到约20毫米。地址的形状也可以增强光谱响应的视觉观察。例如，该地址可以呈条纹状、带状、点状或任何其它几何形状。该地址还可以以某一距离被间隔开以提供更可见的光谱响应。在两个或更多个单个阵列地址之间的间隔范围可以为，例如约O.01到约100毫米，在一些实施方式中，为约0.1到约50毫米，而在一些实施方式中，为约1到约20毫米。该阵列的总体形式可以采取任何实际上期望的外观。可以以多种方式利用指示剂阵列以提供关于上呼吸道病症的信息。例如，在一个实施方式中，可以采用任何已知的样品收集器具从患者的上呼吸道获得测试样品，例如采用拭子、棉签和吸管等。一旦获得样品，该样品可以与具有指示剂阵列的测试条相接触。如必须，可以以诊断测试试剂盒的形式一齐提供该样品收集器具和测试条，该诊断测试试剂盒可以含有其它材料，例如说明书、对照条和预理溶液等。例如，可以采用含有表面活性剂的预处理溶液，该表面活性剂如上所述的作为用于样品的润湿剂。例如，参考图1A，表示本发明的一个实施方式，其中阵列181形成于基材180上。阵列181包括一个广谱指示剂183(例如雷查德染料)。当指示剂183发生颜色变化时(图IB)，于是提醒使用者样品中细菌的存在。同样，当该广谱指示剂183基本保持同样颜色或只出现微弱的颜色变化时(图1C)，于是提醒使用者该样品可能含有其它病原体(例如病毒)或该症状是由于其它成因造成的，例如过敏。如果进一步区分存在细菌的种类是所期望的，阵列181还可以采用在特定种类的细菌存在时发生独特的颜色变化的第一地址185。例如，该第一地址185可以含有在革兰氏阴性细菌存在时发生光谱响应的指示剂，该光谱响应不同于在革兰氏阳性细菌存在时它的光谱响应。还可以采用其它地址以进一步帮助鉴定存在细菌的种类。如果进一步区分可能存在的病毒是所期望的，阵列181还可以采用在特定种类的病毒存在时发生独特颜色变化的第二地址187。例如，第二地址187可以含有在鼻病毒存在时发生光谱响应的指示剂，该光谱响应不同于在流感病毒或人副流感病毒存在时它的响应。应该理解的是，本发明中无需采用分开的地址，且当加上该广谱指示剂提供的信息时，一个单一的地址可能是足够的。例如，该广谱指示剂可能发生颜色变化，因而提示了样品中细菌的存在。有了这一信息，可以接着观察该单一地址以评估革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌的存在。无论如何，指示剂的光谱响应可以提供关于其接触的微生物存在的信息。如必须，该指示剂(或指示剂阵列)的响应可以与对照指示剂(或指示剂阵列)相比较，就微生物响应来说，该对照指示剂以与测试指示剂同样或类似的方式形成。该对比可以在视觉上或错助于设备进行。同样可采用多种对应于某一浓度不同种类的微生物的对照指示剂。经对照，可以通过选择对照指示剂鉴定微生物，该对照指示剂具有和测试指示剂的响应相同或基本类似的光谱响应，之后将所选择的对照与特定微生物或微生物类别相关联起来。作为本发明的结果，已经发现通过采用发生可检测颜色变化的指示剂可以容易地检测细菌、病毒或其它微生物的存在。该颜色变化是迅速的，且可以在相对短的时间段内检测。例如，该变化可以在约30分钟或更短时间内发生，在一些实施方式中约10分钟或更短，在一些实施方式中约5分钟或更短，在一些实施方式中约3分钟或更短，而在一些实施方式中，为约10秒到约2分钟。以这种方式，指示剂可以提供微生物存在或不存在的"实时"显示。该"实时"显示可以提示使用者或护理人员寻求治疗方式(例如抗生素)。在另一方面，缺乏某种颜色变化可以为使用者或护理人员提供该样品没有感染的保证。参考以下实施例可以更好地理解本发明。实施例采用的材料除非另有说明，所有试剂和溶剂都从位于Missouri的St.Louis的Sigma-AldrichChemicalCompany,Inc.，获得，且在没有进一步纯化的情况下采用。在本研究中使用的微生物为1.革兰氏阴性(活的)-大肠杆菌(ATCC#8739)(E.coli)-铜绿假单胞菌(ATCC#9027)(P.aeruginosa)22-猪霍乱沙门氏菌(Gibraltar实验室)(S.choleraesuis)-流感嗜血杆菌(ATCC#49247(H.influenzae))-腔隙莫拉氏菌(ATCC#17972)(M.lacunata)2.革兰氏阳性(活的)-金黄色葡萄球菌(ATCC#6538)(S.aureus)-炭疽芽孢杆菌(Gibraltar实验室)(A.bacillus)-化脓性链球菌(ATCC#10782)(S.pyogenes)-肺炎链球菌(ATCC#10015)(S.pneumoniae)3.酵母菌(活的)-白色念珠菌(ATCC#10231)(C.albicans)4.霉菌(活的)-出芽短梗霉菌(ATCC#16622)(A.pullulans)-微紫青霉菌(ATCC#10069)(P.janthinellum)5.病毒(活的)(Gibraltar实验室)-单纯疱疹病毒1(HSV-1)(ATCC#VR-260)-单纯疱疹病毒2(HSV-2)(ATCC#VR_734)-2型腺病毒(Adeno2)(ATCC#VR_846)-5型腺病毒(Adeno5)(ATCC#VR_5)-冠状病毒(ATCC#VR_740)-2型鼻病毒(5/13/82从HoffmanLaRoche获得)-流感病毒A(H2N2)(ATCC#VR_100)-流感病毒A(ATCC#VR-544)-副流感病毒1(仙台)(ATCC#VR_105)-禽流感病毒(ATCC#VR_797)所有流感病毒株在鸡胚中培养，而其余病毒，除冠状病毒外，采用来自非洲绿猴的VER0-肾细胞作为宿主。冠状病毒在来自女性肺组织的WI-38人二倍体细胞中培养。含有5%胎牛血清(FBS)的达氏修正依氏培养基(匿EM)用作所有非鸡胚病毒的培养和稀释培养基。采用绒毛尿囊液(CAF)用于在鸡胚体系中生长的病毒。在本研究中使用的指示剂和它们的分子结构列于表1中表1:示例性的指示剂和它们相应的结构23指示剂结构4-[(l-曱基-4(1印-亚吡啶基)亚乙基]-2,5-环己二烯-l-酮水合物.xH2〇氯化3-乙基-2-(2-轻基-l-丙烯基)苯并噻唑鐵H3C溴化l-二十二烷基-4-(4-羟基苯乙烯基)恍咬鎗—---------------------—-—■----------—-■.-一CllB「7V，7V-二曱基靛苯胺0={)^N乂^~N'指示剂结构職萏素OHOOH。HOHO部花青540。人s羊毛铬蓝SECI~<^^~OHM0、f)Na"J、)，ouONa朌红尼罗蓝AH2N\^CT、NCH3、CH3OO—，—CT、0l-(4-羟基苯基)-2,4,6-三苯基吡啶鎗氢氧化物内盐水合物O1甲亚胺-H单钠盐水合物NOHNa+HO、人xH2。拔类胭脂红NaO、'？,？H。々s、^y^^)j^^2f/、ONa25指示剂结构亚曱基紫"、1羊毛铬蓝黑BONao="o%亚曱基蓝f\ZN、z、ci-丄、lI〕+，ch3n-^/-\s/^y、ch3"尼罗红H3Can""d^^^^)H3C^台盼蓝H3CCH3NH2OH卜\严〈OHCH30000OO00番红O结晶紫r,、—H3。、NX^!J、N'CH3CH3ch3甲基橙h3c/T"T\n乂'VS03_《3+26<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>实施例1测定各种指示剂在金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌微生物存在时发生颜色变化的能力。测试的指示剂为雷查德染料、溴化l-二十二烷基-4-(4-羟基苯乙烯基)吡啶鎗、氯化3-乙基-2-(2-羟基-1-丙烯基)_苯并噻唑鐵、4-[(1_甲基-4(1H)_亚妣啶基)亚乙基]-2，5-环己二烯-1-酮水合物、N，N-二甲基靛苯胺、醌茜素、部花青540、羊毛铬》蓝3￡(铬蓝8)、酚红、尼罗蓝八、1-(4-羟基苯基)-2，4，6-三苯基吡啶鎗氢氧化物内盐水合物、亚甲胺-H单钠盐水合物、靛类胭脂红、亚甲基紫、羊毛铬蓝黑B、比布列希猩红_酸性品红溶液、亚甲基蓝、尼罗红、台盼蓝、番红o、结晶紫、甲基橙和铬天青s。除非另有说明，将指示剂溶于二甲基甲酰胺(DMF)。然后将指示剂溶液用移液管转移到15厘米滤纸(从VWR国际目录编号No.28306-153获得)上并使其干燥。将滤纸切成四等份以测试四个样品——即金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌和无菌水。用移液管将100微升107CFU/mL的金黄色葡萄球菌转移到一个四分之一的滤纸上，用移液管将100微升107CFU/mL的大肠杆菌转移到第二个四分之一的滤纸上，用移液管将100微升106CFU/mL的白色念珠菌转移到第三个四分之一的滤纸，并用移液管将无菌水转移到最后一个四分之一的滤纸上。观察每个测试样品的指示剂中颜色的变化并记录。在颜色变化之后立即记录颜色以防止随着样品被干燥颜色褪色(或强度损失)。表2表示来自实验的观察。表2.对指示剂颜色变化的观察(第1组)<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>指示剂初始颜色颜色变化w/金黄色葡萄球菌颜色变化w/大肠杆菌颜色变化w/白色念珠菌颜色变化w/无菌水甲基橙鲜艳的橙色黄色黄色黄色较浅的橙色，有暗橙色边缘带(溶解)铬天青s粉色浅橙色，有暗橙色边缘带浅橙色，有暗橙色边缘带更鲜艳的黄色，有暗粉色边缘带浅粉色，有暗粉色边缘带*溶于水除了甲基橙、尼罗红和部花青540之外，几乎立刻观察到颜色变化(1到2分钟)。实施例2测定各种指示剂在金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌微生物存在时发生颜色变化的能力。所测试的指示剂是隐色结晶紫、隐色孔雀绿、隐色二甲苯苯胺FF、4，5-二羟基-1，3-苯二磺酸二钠盐一水合物、5-氰基-2-[3-(5-氰基-1，3-二乙基-1，3-二氢-2H-苯并咪唑-2-亚基)1-丙烯基]-1-乙基-3-(4-磺酸丁基)-1H-苯并咪唑鎗氢氧化物内盐、酸性绿25、红菲咯琳二磺酸二钠盐三水合物、胭脂红酸、天青石蓝、苏木紫、溴酚蓝、溴百里酚蓝、玫瑰红、通用指示剂(0-5)和通用指示剂(3-10)。除非另有说明，将指示剂溶于二甲基甲酰胺(DMF)。按照实施例1中的描述制备VWR滤纸和指示剂。表3表示来自实验的观察。表3.对指示剂颜色变化的观察(第2组)指示剂初始颜色颜色变化w/金黄色葡萄球菌颜色变化w/大肠杆菌颜色变化w/白色念珠菌颜色变化w/无菌水隐色结晶紫白色蓝色蓝色蓝色没有变化隐色孔雀绿白色绿色绿色绿色没有变化隐色二甲苯苯胺FF白色没有变化没有变化没有变化没有变化4,5-二羟基-1,3-苯二磺酸二钠白色没有变化没有变化没有变化没有变化指示剂初始颜色颜色变化w/金黄色葡萄球菌颜色变化w/大肠杆菌颜色变化w/白色念珠菌颜色变化w/无菌水35<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>*溶于水材溶于DMF和水除了隐色结晶紫、隐色孔雀绿和隐色二甲苯苯胺FF之外，几乎立刻观察到颜色变化(1到2分钟)。实施例3测定各种指示剂在金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌微生物存在时发生颜色变化的能力。所测试的指示剂是茜素氨羧络合剂、茜素红S、红紫素、茜素、大黄素、氨基-4-羟基蒽酉昆、核固红、氯酚红、雷马素亮蓝R、普施安蓝HB、酚酞、四苯基卟吩、四-邻-磺酸和水合茚三酮。除非另有说明，将指示剂溶于二甲基甲酰胺(DMF)。按照实施例1中的描述制备VWR滤纸和指示剂。表4表示来自实验的观察。表4.指示剂颜色变化的观察(第3组)指示剂初始颜色颜色变化w/金黄色葡萄球菌颜色变化w/大肠杆菌颜色变化w/白色念球菌颜色变化w/无菌水茜素氨羧络合剂黄色棕色发红色的紫色紫色没有变化茜素红s黄色发橙色的棕色发粉色的紫色紫色较浅的黄色，有较暗的黄色边缘带(溶解)红紫素发桃色的橙较暗的发桃发红色的粉较深的发红发黄色的桃指示剂初始颜色颜色变化w/金黄色葡萄球菌颜色变化w/大肠杆菌颜色变化w/白色念球菌颜色变化w/无菌水色色的橙色色色的粉色色37<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>几乎立刻观察到颜色变化(1到2分钟)。实施例4证明了利用实施例1-3的指示剂快速检测各种革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物的能力。还测试了其它指示剂，包括铬蓝B、硝基蓝、茜素氨羧络合剂、地衣红、四甲基-对-苯二胺(TMPD)、尼罗红、羊毛铬蓝黑B、酚红、茜素红S、胭脂红酸、Fe(111)03、天青石蓝、柯凡克试剂、铬天青S、通用指示剂3-10、甲基橙、部花青540和氯化铁III卟啉。测试的革兰氏阳性微生物是金黄色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、表皮葡萄球菌、枯草杆菌和粪肠球菌，测试的革兰氏阴性微生物是大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克氏杆菌和奇异变形杆菌。以类似实施例1的方式制备指示剂样品。除非另有说明，将指示剂溶于二甲基甲酰胺(DMF)。用移液管将每种指示剂溶液转移到两片分开的VWR滤纸上并使其干燥。将带有干燥指示剂的一片滤纸样品切成大致相等的五部分以测试那五种革兰氏阳性微生物。将另一片滤纸样品切成四等份以测试那四种革兰氏阴性微生物。用移液管将100微升l(fCFU/mL的每种微生物样品转移到它们各自的滤纸样品部分上。表5表示来自对革兰氏阳性微生物的观察，表6表示来自对革兰氏阴性微生物的观察。表5.对革兰氏阳性微生物颜色变化的观察<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>颜色变化w/表皮葡萄球菌颜色变化w/粪肠球菌颜色变化w/嗜酸乳杆菌酚红黄色橙色，有发黄色，有橙黄色，有橙黄色，有橙发绿色的黄指示剂初始颜色颜色变化w/枯草杆菌颜色变化w/金黄色葡萄球菌颜色变化w/表皮葡萄球菌颜色变化w/粪肠球菌颜色变化w/嗜酸乳杆菌黄色的中心色边缘带色边缘带色边缘带色，有橙色的边缘带茜素红s黄色发棕色的粉色浅棕色浅棕色浅棕色浅的发绿色的棕色胭脂红酸*发红色的桃色淡紫色更淡的紫色更淡的紫色发紫色的桃色发黄色的桃色Fe(III)C3白色没有变化没有变化未作测试未作测试没有变化天青石蓝暗的淡紫色,监,监,监CN101784896A眾s步38/6S<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>*溶于水除了甲基橙、尼罗红、四甲基-对-苯二胺(TMPD)和部花青540之外，同样立刻观察到颜色变化(1到2分钟)。实施例5证明了利用一组指示剂快速地检测上呼吸道细菌性病原体的能力。测试的指示剂为茜素红S、通用指示剂3-10、尼罗红、铬蓝B、铁III卟啉，羊毛铬蓝黑B、铬天青S、地衣红、茜素氨羧络合剂、酚红、胭脂红酸、甲基橙和TMPD。测试的上呼吸道感染病原体为流感嗜血杆菌、腔隙莫拉氏菌、化脓性链球菌、肺炎链球菌、出芽短梗霉菌和微紫青霉菌。以类似实施例1的方式制备指示剂样品。除非另有说明，将指示剂溶于二甲基甲酰胺(DMF)。观察每一个测试的样品的指示剂中的颜色变化并记录。表7表示来自上呼吸道感染病原体的观察。表7.对上呼吸道感染病原体的颜色变化<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>*溶于水除了甲基橙、尼罗红和四甲基-对-苯二胺(TMPD)之外，几乎立刻观察到颜色变化(1到2分钟)。实施例6用铬天青、茜素氨羧络合剂、铬蓝B和酚红溶液(均溶于DMF)处理滤纸(可从VWRInternational获得)。将样品悬干以蒸发掉溶剂。使用胰酶解酪蛋白大豆肉汤(TSB)培养基，以及在一些情况下使用无菌水以十倍稀释度稀释白色念珠菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的溶液。对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，浓度范围从108CFU/mL(储备液)降至1(^CFU/mL，对于白色念珠菌浓度范围从1(fCFU/mL(储备液)降至10tFU/mL。TSB和水用作对照溶液。将每种溶液的lOOyL等份施加在样品上。颜色变化概括在表8-12中。表8:对白色念球菌在TSB培养基中的稀释物的响应染料初始颜色106CFU/ml105CFU/ml104CFU/ml103CFU/ml102CFU/ml101CFU/mlTSB对照酚红鲜艳的黄色橙色略微暗些的橙色略微暗些的橙色略微暗些的橙色略微暗些的橙色略微暗些的橙色暗橙色铬蓝B鲜艳的粉色发紫色的蓝色略微暗些的发紫色的蓝色略微暗些的发紫色的蓝色略微暗些的发紫色的蓝色略微暗些的发紫色的蓝色略微暗些的发紫色的蓝色发紫色的暗蓝色茜素氨羧络合剂鲜艳的黄色发棕色的紫色略微暗些的发棕色的紫色略微暗些的发棕色的紫色略微暗些的发棕色的紫色略微暗些的发棕色的紫色略微暗些的发棕色的紫色发棕色的暗紫色铬天青玫瑰色发绿色的黄色略微暗些的发绿色的黄色略微暗些的发绿色的黄色略微暗些的发绿色的黄色略微暗些的发绿色的黄色略微暗些的发绿色的黄色发黄色的绿色表9:对金黄色葡萄球菌在TSB培养基中的稀释物的响应108CFU/ml107106105104103102TSB染料初始颜色(未稀释)CFU/迈1CFU/迈1CFU/迈1CFU/迈1CFU/迈1CFU/迈1对照酚红鲜艳的黄鲜艳的黄橙色略微暗略微暗略微暗略微暗略微暗暗橙色色色些的橙些的橙些的橙些的橙些的橙色色色色色46<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>表11:对大肠杆菌在TSB培养基中的稀释物的响应<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>因此，观察到的微生物引起的颜色变化不同于单独的培养基的颜色变化，尽管对于稀释溶液的差别更加有些细微。不打算受理论限制，相信对于稀释溶液的更细微的差别部分由于没有给予微生物适应培养基的时间(实验是在稀释后很快进行的)。相比之下，含有微生物的储备液已经在培养基中24小时了。实施例7同样采用了一组病毒在Gibraltar实验室(Fairfield,NJ)对选择的染料进行了测试。所采用的染料说明于下表13中。表13:用于病毒测试的染料<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>编号染料18胭脂红酸19红紫素20大黄素21天然红221，4-二羟基蒽醌23核固红24通用指示剂溶液3-1025柯凡克试剂染料溶解于DMF中，并涂覆到二十五个滤纸样品上。样品悬干并分成两组，且被施加到两种染料处理的滤纸样品上用于此研究。对于第一组，在每一种染料样品的第一组上测试单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、2型腺病毒、5型腺病毒、冠状病毒和DMEM对照。对于第二组，在第二染料样品上测试其余病毒以及DMEM和CAF对照。通过取50iiL等份的每种病毒或对照，将其施加到样品上进行测试。立即拍照，并在数分钟后拍照以记录观察到的颜色变化。所得到的颜色变化概括于表14和15中。表14:第一组病毒<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>还采用了NIHImage(ImageJ)分析数码照片用于强度分析。表16和17提供了最令人感兴趣的染料目录和对每一类型病毒的相对强度。表16:所选择的染料对病毒的平均强度值<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>6表17:所选择的染料对病毒的平均强度值<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>通常，对于每一种染料的颜色变化看起来分成两组。疱疹病毒和腺病毒趋向产生类似类型的颜色变化，而冠状病毒、鼻病毒和流感病毒也产生类似类型的颜色变化。令人感兴趣的是，疱疹病毒和腺病毒都由双链DNA组成，含有脂质细胞膜，大小类似，且在形状上为二十面体。冠状病毒、鼻病毒和各种流感病毒都含有RNA，尽管形状不同(流感病毒为螺旋状，鼻病毒为二十面体，而冠状病毒为不对称的)。这些溶液的pH值也倾向于一起同样分组。尽管HSV-l、HSV-2、Adeno2、Adeno5、冠状病毒和鼻病毒都在DMEM(pH=7.5)中培养，每种含生物的溶液具有不同的pH，表明该生物分泌代谢产物或其它因子，这些代谢产物或其它因子的影响影响到它们的环境。表18提供了一列pH记录值(采用ColorpHastpH试纸条获得)。表18:pH值<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>尽管pH似乎在观察到的颜色变化中起到了作用，但它似乎不是唯一的影响因素。测试的许多染料并不已知为传统的pH指示剂，但是被离子所影响。例如羊毛铬蓝黑B，为一种金属滴定染料，通常在高pH值(约10.0)使用。在金属离子存在时，颜色从蓝色变化到红色。对于微生物检测，该染料在其红色状态下使用，在特定微生物存在时观察到变成蓝色。该作用可能是PH依赖的；然而，在具有相对类似pH值的样品之间，例如鼻病毒和流感病毒，存在独特的差别。采用ImageJ的强度分析证实了，一般来说，鼻病毒倾向于比流感病毒具有较弱强度的颜色变化。基于这些结果，羊毛铬蓝黑B和醌茜素可能在不同种类的流感病毒、鼻病毒之间进行区分是有用的。铬蓝B也可能适合用于副流感病毒的诊断。尽管本发明已经就其具体实施方式进行了详细的描述，应当理解本领域技术人员在获得前述内容的认知之后，可以容易的构想这些实施方式的改变、变化和等同物。因此，本发明的范围应该被评估为所附权利要求及其等同物的范围。权利要求一种用于快速检测上呼吸道测试样品中微生物的方法，该方法包括将测试条与上呼吸道测试样品相接触，所述测试条包含至少一种广谱指示剂，该广谱指示剂在细菌存在时显示第一光谱响应而且在病毒存在时显示第二光谱响应，所述测试条还包含含有至少一种区分性指示剂的阵列，该阵列在一种微生物存在时显示第三光谱响应并且在另一种微生物存在时显示第四光谱响应；观察所述广谱指示剂的第一光谱响应或第二光谱响应，存在第二光谱响应表明样品中存在病毒；和之后，观察所述阵列的第三光谱响应或第四光谱响应。2.权利要求1所述的方法，其中所述广谱指示剂是溶剂化显色指示剂。3.权利要求2所述的方法，其中所述溶剂化显色指示剂为N-酚盐甜菜碱。4.权利要求3所述的方法，其中所述N-酚盐甜菜碱为雷查德染料。5.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述区分性指示剂含有pH-敏感性指示剂。6.权利要求5所述的方法，其中所述pH-敏感性指示剂为酞、羟基蒽醌、芳基甲烷、芳香族偶氮或上述物质的衍生物。7.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述区分性指示剂含有金属络合指示剂。8.权利要求7所述的方法，其中所述金属络合指示剂为芳香族偶氮化合物。9.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述光谱响应为视觉上可观察的。10.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述光谱响应在测试条与样品接触后约30分钟或更短时间，优选在测试条与样品接触后约5分钟或更短时间产生。11.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述阵列在革兰氏阴性细菌存在时显示第三光谱响应，而在革兰氏阳性细菌存在时显示第四光谱响应。12.权利要求11所述的方法，其中所述革兰氏阳性细菌包括化脓性链球菌、肺炎链球菌或它们的混合物。13.权利要求11所述的方法，其中所述革兰氏阴性细菌包括腔隙莫拉氏菌、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体或它们的混合物。14.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述阵列在一种病毒存在时显示第四光谱响应并且在另一种病毒存在时显示第五光谱响应。15.权利要求14所述的方法，其中所述阵列在鼻病毒存在时显示第四光谱响应。16.权利要求15所述的方法，其中所述阵列在流感病毒A、流感病毒B、流感病毒C存在或它们混合存在时显示第五光谱响应。17.权利要求16所述的方法，其中所述阵列在人副流感病毒存在时显示第五光谱响应。18.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述阵列含有2到50个单个阵列地址，优选3到40个单个阵列地址。19.一种用于快速检测上呼吸道测试样品中的微生物的试剂盒，该试剂盒包含用于从宿主上呼吸道收集测试样品的器具；禾口含有至少一种广谱指示剂的测试条，所述广谱指示剂在细菌存在时显示第一光谱响应和并且病毒存在时显示第二光谱响应，所述测试条还包含含有至少一种区分性指示剂的阵列，该阵列在一种微生物存在时显示第三光谱响应并且在另一种微生物存在时显示第四光谱响应。20.权利要求19所述的试剂盒，其中所述广谱指示剂为N-酚盐甜菜碱。21.权利要求20所述的试剂盒，其中所述N-酚盐甜菜碱为雷查德染料。22.权利要求19到21中任一项权利要求所述的试剂盒，其中所述区分性指示剂含有pH-敏感性指示剂、金属络合指示剂或两者。23.权利要求19到22中任一项权利要求所述的试剂盒，其中所述器具为拭子。全文摘要本发明提供了一种用于快速评估上呼吸道病症的方法。更具体的，该方法包含将从宿主上呼吸道获得的样品与测试条相接触。该测试条含有指示剂，该指示剂在细菌、霉菌、酵母菌或其它微生物存在时提供广谱响应，该广谱响应不同于病毒存在时它的响应。这使得就该测试样品是被病毒感染还是被其它某微生物感染进行快速和简单的评估。为了帮助临床医师确认治疗的确切疗程，获得关于存在的特定种类微生物的更多信息也可能是理想的。就这一点，该测试条含有一种或多种区分性指示剂的任何阵列，该阵列在不同种类微生物存在时提供特定光谱响应。例如，该阵列在革兰氏阴性细菌存在时可以提供特定光谱响应，但是在革兰氏阳性细菌存在时提供完全不同的光谱响应。同样，该阵列在鼻病毒(与普通感冒有关)存在时可以提供特定光谱响应，但在流感病毒存在时提供不同的响应。因此，对指示剂提供的光谱响应进行检测可以实现在不同种类微生物之间进行快速的区分。文档编号C12Q1/04GK101784896SQ200880104335公开日2010年7月21日申请日期2008年5月19日优先权日2007年8月30日发明者C·塞尔,J·G·麦唐纳,J·利,K·汤普森,S·M·马丁申请人:金伯利-克拉克环球有限公司