专利名称：糖基化谱分析的制作方法
糖基化谱分析 本发明涉及重组蛋白及其产生的领域。更具体地，本发明涉及用于测定重组产生 的多肽(如抗体)的糖基化谱(glycosylation profile)的方法，以及用于产生糖基化多 肽的方法，其中在发酵过程中测定糖基化谱。
背景技术：
多肽的糖基化谱对于许多重组产生的治疗性多肽而言是一个重要的特征。糖基化 多肽(也称为糖蛋白)在真核生物(如人)和一些原核生物中介导许多重要功能，包括催 化、信号发放、细胞间通信、激活免疫系统以及分子识别和联合。它们组成了真核生物中的 大部分非胞质蛋白(Lis，H.等，Eur. J.BiOChem.218(1993)l-27)。糖蛋白上寡糖的形成/ 附着是翻译中及翻译后的修饰，因此不受遗传控制。寡糖的生物合成是多步骤过程，涉及彼 此竞争底物的多种酶。因此，糖基化多肽包含寡糖的微不均一性的排列，产生含有相同氨基 酸骨架的一组不同的糖形。 共价结合的寡糖确实影响相应多肽的物理稳定性、折叠、对蛋白酶攻击的抗性、 与免疫系统的相互作用、生物活性和药代动力学情况。此外，一些糖形具有抗原性，促使 监管机构需要对重组糖基化多肽的寡糖结构进行分析(参阅如Paulson, J.C. ， Trends Biochem. Sci. 14(1989)272-276 ;Jenkins, N.等，Nature Biotech. 14(1998)975-981)。例 如，已经报道，糖基化多肽的末端唾液酸化提高了治疗剂的血清半衰期，而包含具有末端半 乳糖残基之寡糖结构的糖基化多肽显示从循环中的清除被提高(Smith, P.L.等，J.Biol. Chem. 268(1993)795-802)。因此，在治疗性多肽(如免疫球蛋白)的生物技术产生中，对寡 糖微不均一性性及其批次间一致性的评估是一个重要的任务。 单克隆抗体(mAb)是增长最迅速的一类蛋白质治疗剂。在2005年，共有31中基 于mAb的产品被批准用于人类治疗，例如用于治疗癌症、自身免疫和炎性疾病，或用于体内 诊断，还有许多正在进行临床试验(Walsh，G. ， Trends Biotechnol. 23 (2005) 553-558)。抗 体在其糖基化模式上与其他重组多肽具有显著差异。例如，免疫球蛋白G(IgG)是对称的多 功能糖基化多肽，分子量约150kDa，由负责抗原结合的两个相同的Fab部分和用于效应子 功能的Fc部分组成。在IgG分子中糖基化通常在297位Asn处高度保守，其位于Fc重链的 CH2结构域之间，与CH2中的氨基酸残基形成广泛接触(Sutton和Phillips, Biochem. Soc. Trans. 11 (1983) 130-132) 。 297位Asn连接的寡糖结构被不均一地加工，使得IgG存在多种 糖形。变异存在于297位Asn位点的位点占据(宏观不均一性)或糖基化位点寡糖结构的变 化中(微不均一性性)，参阅如Jenkins,N.等，Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-981 。 一 般而言，IgG mAb中更丰富的寡糖基团是脱唾液酸的双触角复合型聚糖，主要是未半乳糖基 化(agalactosylated，GO)、单半乳糖基化(Gl)或二半乳糖基化(G2)型(Jefferis，R.等， Immunol. Lett. 68(1998)47-52)。 与Fc区结合的寡糖不仅影响物理化学特性(例如结构完整性)并使蛋白酶 抗性消除或最小化，而且还是效应子功能(如补体结合、与噬菌体Fc受体结合、迅速从 循环中清除抗原-抗体复合体以及诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC))所必须的(Cox，K.M.等，Nature Biotechnol. 24(2006) 1591-1597 ;Wright and Morrison, Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32)。由于不同的糖形可与不同的生物学特性相关， 因此，富集特定糖形的能力可用于例如阐明特定糖形与特定生物功能之间的关系。因 此，非常需要产生富含特定糖形的糖基化多肽组合物。已进行了许多研究来了解环境 因素和培养条件对蛋白质糖基化及蛋白质糖基化谱的影响。已经报道，培养变量例 如溶解氧浓度(Kunkel， J. p.等，J. Biotechnol. 62(1998)55-71)、单糖可用性的变化 (Tachibana， H.等，Cytotechnology 16 (1994) 151-157)、胞内核苷酸糖的可用性(Hills, A.E.等，Biotech. Bioeng. 75(2001)239-251)、铵浓度(Gawlitzek， M.等，Biotech. Bioeng. 68(2000)637-646)、血清浓度(Parekh， R. B.等，Biochem. J. 285 (1992)839-845 ; Serrato， J. A.等，Biotechnol. A加l. Biochem. 47 (2007) 113-124)和生长速率(Robinson, D. K.等，Biotech. Bioeng. 44 (1994) 727-735)导致糖基化谱的差异。 产生治疗用途的糖基化多肽时最常用的是中国仓鼠卵巢细胞(CH0细胞)。这些细 胞产生确定的糖基化谱，并允许产生遗传稳定的高生产力细胞系。此外，它们可以高细胞密 度在无血清培养基中培养，以产生安全且可再现的生物过程。在链烷酸存在下，CHO细胞中 所表达的糖基化多肽的N-乙酰葡糖胺含量和类型受温度和摩尔渗透压浓度的影响(参阅 如US 5， 705， 364)。在美国专利申请2003/0190710中还报道，仅对温度和摩尔渗透压浓度 进行调整就可改变CH0细胞培养物中IgG糖基化重链变体的水平。 已经使用高效阴离子交换层析-脉冲安培检测法(HPAEC)和衬质辅助激光解吸与 电离-飞行时间质谱术(MALDI-T0F MS)来分析糖基化多肽的糖类部分(参阅如Fukuda， M.(编 著)Glycobiology :A PracticalApproach， IRL Press, Oxford ;Morelle， W. 禾口 Michalsky， J. C. ， Curr. Pharmaceut. Design 11(2005)2615-2645)。 Hoffstetter-Kuhn， S.等(Electrophoresis 17(1996)418-422)使用毛细管电泳和MALDI-T0F MS分析在用 N-糖苷酶F(PNGase F)使抗体去糖基化后分析单克隆抗体寡糖介导的不均一性谱。
鉴于糖基化对重组糖基化多肽功能特性的重要性以及对充分限定且一致的产品 生产过程的需要，非常需要在发酵过程中对重组产生的糖基化多肽的糖基化谱进行在线或 离线(ad-line)分析。P即ac， D.I.等(Glycobiol. 8 (1998) 445-454)报道了这样的方法， 其包括将糖基化多肽固定在聚偏氟乙烯膜上、酶消化以及糖基化谱的MALDI-T0F MS分析。 Bailey，M.等，J. Chromat. 826(2005) 177-187报道了对重组产生mAb的分析和分子表征，其
包括若干层析步骤。
发明概述 本发明的一个目的是提供在发酵过程中对重组产生的糖基化多肽的糖基化谱进
行在线分析，以获得具有所需糖基化谱的所述重组产生多肽的方法。 本发明的一个方面是重组产生糖基化异源多肽的方法，其包括以下步骤 (A)提供含有编码所述异源多肽之核酸的细胞， (B)在适于表达所述异源多肽的确定培养条件下培养(A)的细胞， (C)从培养基中获得样品， (D)使所述样品与磁性亲和珠在适于所述异源多肽与该珠结合的条件下接触，
(E)从与该磁性亲和珠结合的异源多肽中释放聚糖，而不释放所述异源多肽，
(F)纯化(E)中释放的聚糖，
(G)通过分析(F)释放和纯化聚糖来测定所述异源多肽的糖基化谱， (H)将所测定的糖基化谱与参照糖基化谱进行比较， (I)根据步骤(H)所得结果调整培养条件，任选地继续培养，禾口 (J)重复步骤(C)至(H)，以获得糖基化的异源多肽， (K)从所述培养基或细胞中回收糖基化多肽。 在一个实施方案中，所述糖基化异源多肽是免疫球蛋白，优选是单克隆免疫球蛋 白。在另一实施方案中，在步骤(D)中使用与磁性亲和珠结合的A蛋白、G蛋白或L蛋白作 为选择性结合免疫球蛋白的亲和配体。根据另一实施方案，在步骤(E)中以酶促或化学方 式(如肼解)释放聚糖。在一个实施方案中，通过用N-糖苷酶处理来释放聚糖。在另一实 施方案中，在步骤(F)中通过反相层析或阳离子交换或其组合来纯化聚糖。在另一实施方 案中，在步骤(G)中，通过MALDI-TOF MS分析或定量HPLC分离来测定步骤(E)中所得纯化 聚糖的糖基化谱。在另一实施方案中，步骤(D)至(G)使用微量滴定板以高通量方式进行。 在另一实施方案中，步骤(I)中的培养条件调整包括改变(i)养分、糖类、添加剂、缓冲化合 物、铵或溶解氧中一种或多种的浓度，或(ii)摩尔渗透压浓度、pH值、温度或细胞密度，或 (iii)生长状态。在一个实施方案中，在步骤(K)后对所述异源多肽进行纯化该异源多肽的 步骤(U。在另一实施方案中，所述异源多肽分泌到培养基中。 本发明的第二方面是提供适于测定和/或定量糖基化标志物的方法，其包括以下 步骤 (A)使含有糖基化多肽的样品接触磁性亲和珠， (B)从亲和结合的糖基化多肽中释放聚糖，而不释放该糖基化多肽， (C)纯化所释放的聚糖， (D)测定所述糖基化标志物的量，禾口 (E)将该糖基化标志物的量与参照量进行比较。 在一个实施方案中，所述样品是受试者(优选哺乳动物，更优选人，更优选患者) 的样品。在另一实施方案中，该方法在步骤(A)之前包括步骤(A-l)通过应用一种或多种 层析柱并回收糖基化异源多肽来处理得自受试者的样品。
发明详述 本发明提供了重组产生具有期望的糖基化谱的糖基化异源免疫球蛋白的方法，其 包括以下步骤 (A)提供转染有核酸的哺乳动物细胞，所述核酸包含编码所述异源免疫球蛋白的 另一核酸， (B)在适于以糖基化形式表达所述另一核酸编码的异源免疫球蛋白的条件下培养 步骤(A)的哺乳动物细胞， (C)从含有糖基化异源免疫球蛋白的培养物中获得样品， (D)使步骤(C)的样品与磁性亲和珠在适于所述糖基化异源免疫球蛋白与该珠结 合的条件下相接触，所述磁性亲和珠结合有A蛋白、G蛋白或L蛋白， (E)从结合的异源免疫球蛋白中获得聚糖，而不从所述磁性亲和珠上释放异源免 疫球蛋白， (F)纯化步骤(E)中获得的聚糖，
(G)通过测定步骤(F)中纯化聚糖的结构和组成来测定所述异源免疫球蛋白的糖 基化谱， (H)将步骤(G)测得的糖基化谱与参照糖基化谱进行比较，
(I)根据步骤(H)所得结果调整培养条件，禾口
(J)如果继续培养，则重复步骤(C)至(H)，或 (K)从细胞或培养基中回收具有期望的糖基化谱的糖基化异源多肽。
意想不到地发现，本发明的方法能够对生物加工单元(bioprocess unit)操作进 行在线跟踪和调整，以影响在获得样品的同一培养过程中产生的异源多肽的糖基化谱。这 是很重要的，例如对于重组产生免疫球蛋白的产品一致性、疗效和/或耐受性而言。在一个 实施方案中，包括从所述异源多肽中切割聚糖并回收切下的聚糖而不从磁性亲和珠上释放 异源多肽的步骤(E)，这通过除去带有结合异源免疫球蛋白的磁性亲和珠来实现。
本发明的实施将利用分子生物学、微生物学、重组DNA技术及免疫学的常规技 术，它们在本领域技术人员的能力之内。这些技术在文献中报道。参阅如Sambrook， Fritsch&Maniatis， Molecular Cloning "Laboratory Manual(1989) ;DNA Cloning, I禾口 II巻(D.N. Glover编著，1985) -Oligonucleotide Synthesis (Gait， M. J.编 著，1984) ;Nucleic acidHybridization (Hames， B. D. &Higgins， S. J编著，1984); Transcription andtranslation (Harnes， B. D. &Higgins， S.J.编著，1984) ;Animal cell culture (Freshney， R丄编 著，1986) ;Immobilized cells and enzymes(IRL Press, 1986) ;Perbal， B. ， A practical guide to molecular cloning(1984) ;Methodsin Enzymology 丛 书 (Academic Press, Inc. ) ;Gene transfer vectors formammalian cells (J. H. Miller和M. P. Calos编著，1987， Cold Spring HarbotLaboratory) ， (Wu， R.和 Grossman, L. ， Methods in Enzymology 154(1987)以及Wu， R， Methods in Enzymology 155(1987) ;Imm皿ochemicalmethods in cell and molecular biology (Mayer禾口 Walker 编 著，1987， Academic Press, London), Scopes, Protein purification-Principles andpractice， 第二片反(1987， Springer-Verlag， N. Y.);禾口 Handbook ofexperimental immunology, Volumes I-IV(D. M. Weir和C. C. Blackwell编著，1986)。
除非另外指明，否则以下术语应理解为具有以下含义 术语"多糖"表示由以糖苷键连接的单糖单元链构成的分子。"多糖"与"寡糖"之 间的区别是基于链中存在的单糖单元数。寡糖一般含有2至9个单糖单元，而多糖含有10 个或更多单糖单元。在本发明中，术语"多糖"包括由两个或更多个单糖单元组成的分子， 特别是包括其中最长的单糖链为3至9个单糖单元的分子。术语"多糖"包括直链和支链 的分子，分离的以及与多肽结合的分子，唾液酸化的和非唾液酸化的分子。
术语"单糖"表示简单糖。这样的简单糖可包含3至10个碳原子，优选5至7个碳 原子，它可以是醛糖或酮糖，与D-或L-甘油醛相比可以为D-或L-构型。单糖为例如苏糖、 赤藓糖或赤藓酮糖(4个碳原子)，或者阿拉伯糖、木糖、核糖、来苏糖、核酮糖或木酮糖(5个 碳原子)，或者阿洛糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖、古洛糖、艾杜糖、阿卓 糖、塔罗糖、阿洛酮糖、山梨糖或塔格糖(6个碳原子)，甘露庚酮糖或景天庚酮糖(7个碳原 子)或者唾液糖(sialose，9个碳原子)。优选地，术语单糖表示核糖、葡萄糖、果糖、岩藻 糖、麦芽糖、半乳糖和甘露糖。
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术语"聚糖"表示由单糖残基组成的多聚体。聚糖可以是直链的或支链的。聚糖 可见与非糖部分(如脂质或蛋白质)共价连接。与蛋白质的结合通过N-或O-连接发生。 包含聚糖的共价缀合物称为例如糖基化多肽、糖蛋白、糖肽、肽聚糖、蛋白聚糖、糖脂和脂多 糖。聚糖除了作为糖缀合物的一部分存在以外，聚糖也以游离形式存在(即，分离的形式， 而不与其他部分结合)。 术语"糖基化多肽"和"糖蛋白"在本申请中可互换使用，指具有多于IO个氨基酸 的多肽或蛋白质，其中至少一个氨基酸具有共价附着的多糖。优选地，所述多糖通过丝氨酸 或苏氨酸的羟基(0-糖基化多肽)或通过天冬酰胺的酰胺基(NH2) (N-糖基化多肽)结合。 所述糖蛋白可以是宿主细胞同源的，或者优选地与表达它的宿主细胞是异源的，即外来的 (例如CHO细胞产生的人蛋白)。 术语"糖基化"表示多糖附着到多肽上。优选地，所述多糖由2至12个通过糖苷 键连接在一起的单糖组成。 术语"N-连接糖基化"指多糖附着到氨基酸链中的天冬酰胺残基上。例如，本领域 技术人员会认识到，小鼠IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3以及人IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgA和 IgD的CH2结构域各在297位氨基酸处具有单个N-连接糖基化位点(根据Kabat，E.A.等， Sequences ofProteins of Immunological Interest, 1991进行编号)。
术语"O-连接糖基化"指糖类部分附着到氨基酸链中的丝氨酸或苏氨酸残基上。
术语"糖谱"或"糖基化谱"在本申请中可互换使用，指糖基化多肽中聚糖的特性。 这些特性优选地为糖基化位点或糖基化位点的占据，或者多肽中聚糖和/或非糖部分的身 份、结构、组成或数量，或者特定糖形的身份和数量。 本申请中使用的术语"在适于结合的条件下"及在语法上等同的形式表示目的物 质(如PEG化的红细胞生成素或抗体)在与静止相(例如离子交换材料)接触时与其结 合。这不一定表示100%的目的物质与静止相结合，而是基本上100%的目的物质与静止相 结合，例如至少50 %的目的物质与静止相结合，优选至少75 %的目的物质与静止相结合， 优选至少85%的目的物质与静止相结合，优选至少95%的目的物质与静止相结合。
术语"糖形"指附着有特定类型及分布的多糖的多肽类型，S卩，如果两个多肽中包 含具有相同数目、类型和顺序的单糖(即，具有相同的"糖基化谱")，则它们为同一糖形。
术语"宿主细胞"涵盖可改造成产生改变糖形的目的蛋白、蛋白质片段或多肽(包 括免疫球蛋白和免疫球蛋白片段)的所有细胞系统类型。优选地，宿主细胞为真核细胞。更 优选地，所述真核细胞为哺乳动物细胞。最优选地，所述宿主细胞为CH0、BHK、PER. C6衝细胞 或HEK293细胞。 术语"抗体"、"免疫球蛋白"、"IgG"和"IgG分子"在本申请中可互换使用。术语 "免疫球蛋白"包括不同形式的抗体结构，包括但不仅限于整个抗体、抗体片段或抗体缀合 物，还指包含基本或部分由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码之一种或多种多肽 的蛋白质。术语"抗体"用于表示完整抗体及其抗原结合片段。公认的免疫球蛋白基因包 括k 、 A 、 a 、 Y 、 S 、 e禾P ii恒定区基因，以及众多的免疫球蛋白可变区基因。轻链分为 k或A类。重链分为Y 、 ii 、 a 、 S或e类，它们进而分别定义免疫球蛋白类别IgG、IgM、 IgA、IgD和IgE。典型的免疫球蛋白(如抗体)结构单位是四聚体。每个四聚体由两对多 肽链组成，每对具有一个"轻链"(约25KDa)和一个"重链"(约50-70KDa)。每个链的N端
8定义约100至120或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原结合。术语"轻链可变区(VL)" 和"重链可变区(VH)"分别指轻链和重链的可变结构域。 免疫球蛋白还包括单臂的复合单克隆抗体、单链抗体，包括单链Fv(scFv)抗体 (其中重链可变区和轻链可变区连接在一起(直接连接或通过肽接头连接)以形成连续多 肽)，以及双抗体、三抗体和四抗体(Pack,P.等，J. Mol.Biol. 246(1995)28-34 ;Pack，P.等， Biotechnol. 11 (1993) 1271-1277 ;Pack， P.等，Biochemistry 31(1992) 1579-1584)。抗体 是例如多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、Fab片段，Fab表达文库 产生的片段等。优选地，所述抗体或抗体片段或抗体变体是单克隆抗体。
术语"单克隆抗体(mAb)"或"单克隆抗体组合物"在本文中指通过培养单个细胞 和/或其后代而产生的抗体分子制备物。 术语"细胞"、"细胞系"和"细胞培养物"可互换使用，所有这些命名均包括后代。 因此，术语"转化体"和"转化细胞"包括原代受试细胞及来自于它们的培养物，与传代数无 关。还应理解，由于故意或无意的突变，全部后代在DNA内容上可能不完全相同。具有针对 最初转化细胞所筛选的相同功能或生物活性的变体后代也包括在内。 术语"表达"指在宿主细胞中发生的转录和翻译。产物基因在宿主细胞中的表达 水平可基于该细胞中存在的相应mRNA的量或该细胞中表达的结构基因所编码多肽的量来 术语"培养物"或"培养基"在本申请中表示进行宿主细胞发酵(即产生异源多肽) 的容器中的全部内容物。除了所产生的异源多肽以外，还包括培养基中存在的其他蛋白质 和蛋白质片段(例如来自添加的营养物或来自死细胞、宿主细胞、细胞片段)，以及营养介 质提供的和宿主细胞在培养中产生的所有组分。 在涉及如细胞、多核苷酸、载体、蛋白质或多肽使用时，术语"重组"一般表示该细 胞、多核苷酸或载体通过引入异源(或外来的)核酸或通过改变天然核酸而进行了修饰，或 者该蛋白质或多肽通过弓I入异源氨基酸而进行了修饰，或者该细胞来自通过引入异源核酸 而进行了修饰的细胞。重组细胞表达在天然(非重组)形式的该细胞中不可见的异源多肽 或核酸，或者表达在非重组情况下将异常表达、低表达或根本不表达的天然核酸序列。在涉 及细胞使用时，术语"重组"表示该细胞含有异源核酸和/或表达异源核酸所编码的多肽。 重组细胞可含有在天然(非重组)形式的该细胞中不可见的编码序列。重组细胞还可含有 可见于天然形式的该细胞中的编码序列，其中所述编码序列通过人工手段被修饰和/或重 新引入该细胞中。该术语还包括这样的细胞，其含有该细胞的内源核酸，所述内源核酸被修 饰而未将该核酸从细胞中移出，这样的修饰包括通过基因替换、位点特异性突变、重组及相 关技术获得的修饰。 术语"添加剂"指培养基中的组分，它们对于细胞生长而言不是必需的，但被添加 到培养基中，从而例如增强细胞的生长或存活，或者改变在所述培养基中培养之重组细胞 所产生糖基化多肽的糖基化谱。 术语"营养物"指培养基中细胞生长和/或存活所必需的组分。
术语"受试者"指动物，更优选哺乳动物，最优选人。 本发明的糖类部分将参照普遍用于描述寡糖的命名法进行描述。使用该命名法的 糖类化学综述可见于Hubbard， S. C.和Ivatt， R. J. ， Ann. Rev. Biochem. 50(1981)555-583。
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本发明的一个方面是在培养基中重组产生糖基化异源多肽的方法，其包括以下步 骤 (A)提供细胞，其包含编码所述糖基化异源多肽的至少一种核酸，在一个实施方案 中，其包含编码所述糖基化异源多肽的两种核酸， (B)在预定的培养条件下将所述细胞在无血清培养基中孵育，其中在所述培养基
中以糖基化形式获得所述糖基化异源多肽， (C)从所述培养基中获得样品，优选不包含细胞， (D)将所述样品与磁性亲和珠接触，从而将所述糖基化异源多肽与所述磁性亲和 珠结合， (E)从与磁性亲和珠结合的糖基化异源多肽上释放聚糖，而不从磁性亲和珠上释 放多肽， (F)通过液相层析纯化(E)中释放的聚糖，在一个实施方案中通过高效液相层析 在阳离子交换树脂和/或反相进行纯化， (G)通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱术(MALDI-TOF MS)分析(F)中所
得纯化聚糖，从而测定所述糖基化多肽的糖基化谱， (H)将该糖基化谱与预先确定的参照糖基化谱进行比较， (I)如果(G)中测定的糖基化谱与预先确定的参照糖基化谱不同，则根据步骤(H) 所得结果改变培养条件，并重复步骤(C)至(H)，以获得具有与参照糖基化谱一致的糖基化 谱的糖基化异源多肽，或者终止培养，
(K)回收所述糖基化异源多肽。 在本发明方法的一个实施方案中，在步骤(A)中，所述细胞是能表达该异源多肽 的重组细胞。 目的异源多肽可如下产生(a)通过表达天然内源基因，或(b)通过表达激活的内 源基因，或(c)通过表达外源基因。在本发明的一个实施方案中，所述糖基化异源多肽是重 组产生的。重组产生方法及技术为本领域技术人员所熟悉。例如，该方法包括产生/提供 编码该异源多肽的核酸，将所述核酸引入一个(或多个)表达构建体中，以及用所述表达构 建体转染宿主细胞。除了在宿主细胞中表达该异源多肽所需的一个或多个编码核酸以外， 这样的表达构建体(载体)还含有所有调节元件。"在适于表达该异源多肽的条件下"培养 宿主细胞，并从细胞或培养物上清/培养基中分离所述糖基化异源多肽。
本发明的方法适于在真核宿主细胞中产生任何糖基化异源多肽。本发明方法特别 适于产生可用于治疗的多肽。例如，所述异源多肽可选自免疫球蛋白、免疫球蛋白片段、免 疫球蛋白缀合物、抗融合肽(antifusogenicp印tide)、淋巴因子、细胞因子、激素(如EP0、 血小板生成素(TPO)) 、G-CSF、GM-CSF、白介素、干扰素、凝血因子和组织型纤溶酶原激活物。 在一个实施方案中，所述异源多肽选自包括免疫球蛋白、免疫球蛋白片段和免疫球蛋白缀 合物。 可在本发明方法中用于产生糖基化异源多肽的细胞原则上可以是任何真核细胞， 例如酵母细胞或昆虫细胞，只要该细胞向该异源多肽上附加聚糖而获得糖基化异源多肽即 可。然而，在本发明的一个实施方案中，所述真核细胞是哺乳动物细胞。优选地，所述哺 乳动物细胞是CH0细胞系，或BHK细胞系，或HEK293细胞系，或人细胞系如PER. C6 。此外，在本发明的一个实施方案中，所述真核细胞是动物或人起源的传代细胞系，例如人细胞系HeLaS3 (Puck， T. T.等，J. Exp. Meth. 103(1956)273-284)、 Namalwa(Nadkarni， J. S.等，Cancer 23 (1969) 64-79) 、 HT1080 (Rasheed， S.等，Cancer 33(1973) 1027-1033)或来自它们的细胞系。 在一个实施方案中，通过本发明方法产生的免疫球蛋白是重组免疫球蛋白。在另一实施方案中，所述免疫球蛋白是人源化免疫球蛋白或嵌合免疫球蛋白。免疫球蛋白的重组产生为本领域所熟知，并描述于例如以下文章中Makrides， S. C. ， Protein Expr.Purif. 17 Q999) 183-202 ;Geisse， S. ， Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282 ;Kaufman，R. J. ，Mol. Biotechnol. 16(2000) 151-161 ;以及Werner， R. G. ，Drug Res. 48 (1998) 870-880。对于免疫球蛋白的产生，通过标准方法将编码轻链或重链或其片段的一种或多种核酸插入表达载体中。表达在本领域中合适的真核宿主细胞中进行，例如CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞或酵母细胞。在一个实施方案中，在从细胞或者裂解后的细胞上清或者培养基中回收抗体。 在NS0细胞中的表达描述于例如Barnes, L. M.等，Cytotechnology32(2000) 109-123;和Barnes, L.M.等，Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270。 瞬时表达描述于例如Durocher， Y.等，Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9。可变结构域的克隆描述于0rlandi， R.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837 ;Carter， P.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(1992)4285-4289;禾口 Norderhaug， L.等，J. Immunol Meth. 204(1997)77-87。 一种瞬时表达系统(HEK 293)描述于Schlaeger， E. J.和Christensen， K. ， Cytotechnology30 (1999)71-83 ;禾口 Schlaeger， E. J. ;Immunol. Methods194(1996)191-199。 在本发明方法的步骤(B)中，所述细胞在表达糖基化异源多肽的确定或预定的培养条件下培养。本申请中使用的术语"预定的培养条件"表示被开发用于培养宿主细胞以产生具有确定糖基化谱的糖基化异源多肽的培养条件。重组细胞克隆一般可以任何期望的方式培养。根据本发明的这一方面添加的营养物包括必需氨基酸(如谷氨酰胺或色氨酸)或/和糖类，以及任选地非必需氨基酸、维生素、微量元素、盐或/和生长因子如胰岛素。在某些实施方案中，营养物包括至少一种必需氨基酸和至少一种糖类。在本发明的某些方面中，这些营养物以溶解态称量(meter)到发酵培养物中。在一个实施方案中，在细胞的整个生长期(培养)中添加营养物，即，取决于培养基中测得的选定参数的浓度(这称之为补料培养)。 本发明的细胞培养物在适用于所培养细胞的培养基中制备。在本发明的一个实施方案中，所培养的细胞是CH0细胞。适用于哺乳动物细胞的培养条件是已知的(参阅如Cleveland, W. L等，J. Immunol. Methods 56(1983)221-234)。此外，可根据经验确定特定细胞系所需的营养物和生长因子及其浓度，而无需过度试验，如"Mammalian cell culture",Mather(编著，Plenum Press :NY， 1984) ;Animal cell culture :A Practical Approach,第二片反；Rickwood， D.禾卩Hames， B. D.编著，Oxford University Press :NewYork， 1992 ;Barnes, D.，和Sato， G. ， Cell, 22 (1980) 649中所述。 术语"在适于表达的条件下"表示用于培养表达糖基化异源多肽之细胞的条件，其是已知的或可由本领域技术人员容易地确定。本领域技术人员已知，这些条件可根据所培
11养细胞的类型和所表达多肽的类型而变化。 一般而言，将细胞在0. 01至107升的体积中，在一定温度下(例如2(TC至40°C )培养足以允许有效产生缀合物的时间(如4至28天)。
"多肽"是包含由通过肽键连接的氨基酸组成的多聚体，其是天然产生或合成产生的。少于约20个氨基酸残基的多肽可称为"肽"，而由两个或更多个多肽组成或者包含多于IOO个氨基酸残基的一个多肽的分子可称为"蛋白质"。多肽可包含非氨基酸组分，例如糖类基团/聚糖、金属离子或羧酸酯。非氨基酸组分可由表达该多肽的细胞添加，并可根据细胞类型而变化。多肽在本文中根据其氨基酸骨架结构或其编码核酸来定义。添加(如糖类基团) 一般不标出，但仍可存在。 在一个实施方案中，营养物溶液可补充有一种或多种选自以下类别的组分血浆组分、生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或EGF)、激素、盐、无机离子、缓冲剂、核苷和碱基、蛋白质水解产物、抗生素、脂质(如亚油酸)。在一个实施方案中，所述营养物溶液是无动物血清的。 在本发明的一个实施方案中，所述培养是悬浮培养。此外，在另一实施方案中，所述细胞在含有低血清含量(如最高约1% (v/v))的培养基中培养。在一个优选实施方案中，所述培养是无血清培养，例如在无血清低蛋白发酵培养基中培养(参阅如WO 96/35718)。含有适当添加剂的市售培养基如Ham' s F10或F12 (Sigma)、基本必需培养基(MEM，Sigma) 、RPMI-1640 (Sigma)或Dulbecco修改的Eagle培养基(DMEM， Sigma)是示例性的营养物溶液。必要时，任何这些培养基中均可补充上述组分。 本发明方法允许在大于约1升、优选大于约10升、优选50升至10000升的培养体积中培养。此外，本发明方法允许进行高细胞密度发酵，这是指细胞浓度在生长期后(即收获时)高于1 X 106个细胞/ml，在一个实施方案中高于5X 106个细胞/ml，或者细胞干重高于100g/l，在一个实施方案中高于200g/l。 用于大规模或小规模生产糖基化多肽的细胞培养方法可用于本发明的内容中。可以使用的方法包括但不仅限于流式床生物反应器、空心纤维生物反应器、滚瓶培养或搅动水箱式生物反应器系统，在后两种系统中，使用或不使用微载体。系统可以以分批、补料分批、分批次、连续或连续灌注模式运行。在本发明的某些实施方案中，以分批次过程来实施培养，根据培养物的需求补料，其中在生长期后收获培养液的一部分，剩余的培养液保留在发酵罐中，然后用新鲜培养基补足工作体积。本发明方法允许以极高的产率收获期望的糖基化多肽。因此，收获时的浓度为例如至少300mg/l，在一个实施方案中为500mg/l，在一个实施方案中为1000mg/l，在另一实施方案中为1500mg/l。 根据本发明的另一实施方案，建议用补料分批或连续细胞培养条件来增强细胞培养物中生长期哺乳动物细胞的生长。在生长期中，细胞在使生长尽可能大的条件和时间下培养。培养条件(如温度、PH、溶解氧(D02)等)是用于具体宿主的那些，并为本领域技术人员所知。 一般而言，用酸(如C02)或碱(如Na2C03或NaOH)或基于HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N' -2-乙磺酸)的缓冲体系将pH调整至约6. 5至7. 5的水平，使用NaHC03进一步缓冲并用稀释NaOH调整。培养哺乳动物细胞(如CHO细胞)的合适温度范围为约2(TC至4(TC，在一个实施方案中为25t:至38t:，在另一实施方案中为3(rC至37t:。在一个实施方案中，。02为5-90%空气饱和度。摩尔渗透压浓度可通过改变氯化钠、氨基酸、水解产物或氢氧化钠的浓度来调节，在本发明的一个方面中的值为320至380mOsm。
根据本发明，在细胞培养物的生产期中控制细胞培养环境。用于待产生的糖基化多肽的培养条件通过以下参数来定义
1.基本培养基 营养物的浓度和类型、任选的血浆组分、生长因子、盐和缓冲剂、核苷和碱基、蛋白
质水解产物、抗生素和脂质、合适的载体， 2.已知改变糖基化谱的参数 糖类的类型和浓度、溶解氧、铵浓度、pH值、摩尔渗透压浓度、温度、细胞密度、生长速率 3.任选的其他添加剂 其他添加剂为例如剌激细胞生长和/或增强细胞存活和/或以任何期望方向操作糖基化多肽的糖基化谱的非必需化合物。添加剂包括血清组分、生长激素、肽水解产物、小分子(如地塞米松(dexamethason)、皮质醇、离子螯合剂等)、无机化合物(如Selene等)和已知影响糖基化谱的化合物(如丁酸盐或奎尼定(参阅如US 6，506，598)、链烷酸(US5， 705， 364)或铜(EP 1092037)。在一个方面中，上述1、2和3项列出的所有参数和化合物为无血清参数，在另一实施方案中，为无动物来源组分的参数。 在本发明的一个方面中，糖类为单糖和/或二糖如葡萄糖、葡糖胺、核糖、果糖、半乳糖、甘露糖、蔗糖、乳糖、甘露糖-1-磷酸、甘露糖-1-硫酸或甘露糖_6-硫酸。在本发明的一个方面中，发酵过程中培养基中所有糖的总浓度为0. lg/1至10g/l，在一个实施方案中为2g/1至6g/1。根据细胞的相应需求添加糖类混合物(参阅如US 6， 673， 575)。
通过向培养基中添加NH4C1来改变铵浓度(Gawlitzek， M.等，Biotech.Bioeng. 68(2000)637-646)。 在用于产生重组糖基化多肽的本发明方法的步骤(C)中，从粗发酵液中获得样品，并在该方法的步骤(D)中，将样品与磁性亲和珠孵育。 使用本领域成熟的技术，从培养基中回收目的糖基化多肽。在本发明的某些实施方案中，目的糖基化多肽作为分泌多肽从培养基中回收，或从宿主细胞裂解物中回收。
如果目的糖基化多肽是异源多肽，则可选择仅结合该异源多肽从而在单个步骤中将其与培养物中的其他多肽分离的磁性亲和珠。因此，在一个实施方案中，步骤(D)的特征为将步骤(C)获得的上述样品与磁性亲和珠接触，从而仅有糖基化异源多肽与所述磁性亲和珠结合，由此将所述糖基化异源多肽与培养物中的其他多肽分离，这通过在单个步骤中除去所述样品以及未结合的化合物来实现。在一个实施方案中，所述糖基化异源多肽占所述结合多肽的多于75wt^，或多于所述结合多肽的多于85wt^，或多于所述结合多肽的95wt%。"异源多肽"指在给定的宿主细胞中不天然存在的多肽或多肽群。特定宿主细胞的异源DNA分子可含有来自宿主细胞物种的DNA(即，内源DNA)，只要宿主DNA与非宿主DNA(即，外源DNA)结合即可。例如，这样的DNA分子被认为是异源DNA分子所述DNA分子含有与包含启动子的宿主DNA区段有效连接的编码多肽的非宿主DNA区段。反过来说，异源DNA分子可包含与外源启动子有效连接的内源结构基因。非宿主DNA分子编码的肽或多肽是"异源"肽或多肽。 采样可以自动或手动进行。在本发明的某些实施方案中，采样步骤自动进行。样
13品体积为lOOiU至1000 iU。在一个实施方案中，获得的样品是纯化的。在一个实施方
案中，用于纯化糖基化异源多肽的方法选自透析、在免疫亲和柱或离子交换柱上分级、乙醇
沉淀、反相高效液相层析(HPLC)、在二氧化硅或阳离子交换树脂(如DEAE)上层析、层析 聚焦、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、硫酸铵沉淀、凝胶过滤(例如在 SEPHADEX G-75⑧上)或在蛋白结合膜(如PVDF膜、尼龙膜或聚四氟乙烯(PTFE)膜)上印 迹。可使用蛋白酶抑制剂(如苯甲基磺酰氟(PMSF))在纯化过程中抑制蛋白酶解降解。本 领域技术人员会认识到，也适用于目的糖基化多肽的已知纯化方法可需要进行修改，以补 偿在重组细胞中表达后糖基化多肽特征的变化。 在本发明的一个实施方案中，纯化方法包括将重组糖基化多肽与磁性亲和珠结 合，从而将糖基化多肽与杂质迅速分离。通过由琼脂糖或惰性聚合物材料包围的铁核，所 述珠在磁场中的行为类似于磁体，而在撤去磁场后不保留剩磁。本发明的发明人发现，这 使纯化过程简化并縮短，因为不需要柱或离心，这与例如传统琼脂糖亲和法不同(Smith, C. ， NatureMethods 2(2005)71-77)。具体地，亲和结合和吸附动力学发生的时间为对含 有溶质的液体进行缓慢柱洗脱所需时间的几分之一，参阅如Chaiken， I.等，Analytical Biochemistry, 201 (1992) 197-210。因此，通过本发明方法，可对培养产生的糖基化异源多 肽的瞬时糖基化谱进行迅速测定，其中所述测定所需的时间特别短。因此，本发明在一个方 面中提供了在培养中在生产过程中对糖基化异源多肽的糖基化谱进行在线或实时测定的 方法，从而允许在需要时在培养过程中调整培养条件，以获得具有参照样品糖基化谱一致 的糖基化谱的糖基化异源多肽。磁珠的另一优点是它们可以以微量滴定板的形式使用，允 许将所述系统自动化。因此，本发明的另一方面是在培养过程中自动化测定糖基化异源多 肽的糖基化谱。因此，上述优点提高了产生糖基化多肽之糖基化谱的速度。
例如，可通过与结合有A蛋白、G蛋白或L蛋白的磁珠一起孵育来纯化抗体。为此， 将截短形式的重组A蛋白、G蛋白或L蛋白与非多孔磁性颗粒共价偶联。蛋白A对许多物 种(包括人、兔和小鼠)的IgG亚类显示高亲和力。蛋白质通过稳定并在宽pH范围内具有 渗漏抗性的连接来偶联。这允许从腹水、血清或细胞培养物上清中免疫磁性纯化IgG。在一 个实施方案中，从细胞培养上清中纯化所述IgG。例如，一般可通过与磁性亲和珠一起孵育 来纯化糖基化多肽，所述磁性亲和珠上结合有对糖基化多肽具有特异性的去糖基化抗体、 凝集素或特定标签。使用去糖基化抗体作为亲和分子使得其后可以分析糖基化多肽的糖基 化谱，而无需先裂解抗体-糖基化多肽复合体。此外，蛋白A磁珠可用于从细胞粗裂解物中 免疫沉淀靶蛋白，其中使用与所述珠结合的选定的去糖基化一抗。 在另一实施方案中，步骤(D)包括离心步骤，以从培养液中除去细胞和颗粒状细 胞碎片。在另一实施方案中，在步骤(E)之前，步骤(D)包括除去结合有糖基化多肽的磁珠 周围的溶液。 在本发明方法的步骤(E)中，以酶促或化学方法从糖基化多肽中释放聚糖，而蛋
白质仍与磁珠结合。由于缺少从磁珠上释放糖基化多肽的洗脱步骤，与本领域已知方法相
比，测定糖基化谱的速度被显著提高。已经发现，在切割聚糖之前从磁珠上洗脱糖基化多肽
并不是要求保护的方法的必要步骤，并且可以省略而不损害对糖基化谱的分析。 用于分析糖基化多肽中聚糖的实施方案主要包括使用本领域已知的任何化学或
酶促方法或其组合将聚糖从非糖部分上切下。在本发明的某些实施方案中，所述化学去糖
14基化方法是肼解。在另一些实施方案中，可通过碱性硼氢化物处理或三氟甲磺酸(TFMS)处 理从糖基化多肽中除去聚糖。在后一情况下，去糖基化多肽可再溶解在8M尿素中，其后进 行进一步分析。 用于切割聚糖的酶促方法包括对N-或0-连接糖具有特异性的方法。这些酶促方 法包括使用内切糖苷酶，例如选自内切糖苷酶F(EndoF)或内切糖苷酶H(Endo H)或内切糖 苷酶N(Endo N)或内切糖苷酶D(Endo D)或N_聚糖酶F (PNGaseF)或其组合。N_糖苷酶F 也称为PNGase F，是从N_连接糖基化多肽中在最内侧GlcNAc与高甘露糖杂合及复合寡糖 的天冬酰胺残基之间进行切割的酰胺酶。在本发明的某些实施方案中，使用切割所有哺乳 动物N-聚糖结构的PNGaseF来切割N_聚糖。 通过本发明方法分析的聚糖还可以在额外的步骤中与聚糖降解酶接触。在一个实 施方案中，步骤(E)还包括将所述释放的聚糖与聚糖降解酶接触。聚糖降解酶的实例本领 域已知，包括外切糖苷酶，或N-聚糖酶，或神经氨酸酶I，或神经氨酸酶III，或半乳糖苷酶 I，或N-乙酰葡糖胺酶I，或a -岩藻糖苷酶II和III，或唾液酸酶，或甘露糖苷酶，或其组合。 在另一实施方案中，该步骤(E)还包括将聚糖依次或同时与多于一种聚糖降解酶 接触。在一些实施方案中，酶促消化是依次进行的，从而不立即除去全部(单)糖。经消化 的聚糖可在每个消化步骤后进行分析，以获得糖基化谱(参阅如WO 2006/114663)。
在另一实施方案中，可使用胰蛋白酶或内蛋白酶(如Arg C、Lys C和Glu C)在测 定目的糖基化多肽的糖基化谱之前获得肽消化物。 在另一实施方案中，去糖基化步骤包括在切割聚糖之前使糖基化异源多肽变性和 /或去折叠。在另一实施方案中，变性剂选自去污剂或尿素或盐酸胍或热。在另一实施方案 中，在变性后还原糖基化异源多肽。在另一实施方案中，用还原剂还原糖基化异源多肽。在 某些实施方案中，还原剂选自DTT或P-巯基乙醇或TCEP。在另一实施方案中，在还原后用 烷化剂将糖基化异源多肽烷基化。在某些实施方案中，烷化剂选自碘乙酸或碘乙酰胺。可 对蛋白质进行碘化和/或还原，而蛋白质仍结合在磁珠上。 在产生重组蛋白的方法的步骤(F)中，对酶促或化学释放的聚糖进行纯化，以用 于进一步分析。在本发明的某些实施方案中，从样品中除去除聚糖以外的全部成分。在 本发明的某些实施方案中，通过反相液相层析或阳离子交换层析进行聚糖纯化。例如， 在化学切割或酶消化之后使用用于分离聚糖和蛋白质的市售树脂或层析材料和/或药 筒(cartridge)系统来纯化样品。这些树脂、材料和药筒包括离子交换树脂和纯化柱，如 GlycoCleanH、S和R药筒。在一些实施方案中，将GlycoClean S与GlycoClean H联合用于 纯化。这种固相提取(SPE)药筒含有用于在质谱(MALDI-T0F)分析之前除去蛋白质并使所 释放聚糖脱盐的多孔石墨碳(PGC)基质。在另一实施方案中，使用强阳离子交换树脂(AG 50W-X2)。 通过利用不同的纯化方法，可以适用于不同的材料。例如，离子交换树脂以不同名 称提供，并来自多个公司，如阳离子交换树脂Bio-Rex (如70型)、Chelex (如100型)、 Macro-Pr印⑧(如CM、High S、25S型)、AG (如50W、MP型)，均来自BioRad Laboratories ; WCX 2，来自Ciphergen ;Dowex MAC_3，来自Dow chemical company ;Mustang C禾口 Mustang S，来自Pall Corporation ;Cellulose CM(如23、52型)、hyper-D、 partisphere，来自Whatman pic. ;Amberlite IRC(如76、747、748型)、Amberlite GT 73、 Toyopearl (如SP、 CM、650M型)，均来自TosohBioscience GmbH ;CM 1500和CM 3000，来自BioChrom Labs ;SP-S印haroseTM、CM-S印haroseTM，来自GE Healthcare ;Poros树脂，来自PerS印tive Biosystems ;Asahipak ES(如502C型)、CXpak P、 IEC CM(如825、2825、5025、 LG型)、 IEC SP(如420N、825型)、IEC QA (如LG、825型)，来自Shoko America Inc. ;50W阳离子 交换树脂，来自EichromTechnologies Inc.;以及例如阴离子交换树脂，如Dowex 1，来自 Dowchemical company ;AG (如1、2、4型)、Bio-Rex 5、 DEAE Bio-Gel 1、 Macro-Pr印⑧ DEAE，均来自BioRad Laboratories ;阴离子交换树脂1型，来自Eichrom Technologies Inc. ;Source Q、 ANX S印harose 4、 DEAES印harose (如CL_6B、 FF型)、Q S印harose、 Capto Q、Capto S，均来自GE Healthcare ;AX-300，来自PerkinElmer ;Asahipak ES_502C、 AXpakWA(如624、 G型)、IEC DEAE，均来自Shoko America Inc. ;Amberlite IRA_96、 Toyopearl DEAE、 TSKgel DEAE，均来自Tosoh BioscienceGmbH ;Mustang Q，来自Pall Corporation.在膜型离子交换材料中，结合位点可见于流通孔壁中，而不藏在扩散孔中，使 得物质可通过对流(而不是扩散)进行转移。膜型离子交换树材料以不同名称提供，来自 多个公司，例如Sartorius(阳离子SartobindTM CM、 Sartobind S，阴离子SartobincT Q);或Pall Corporation(阳离子-Mustang S、MustangTMC，阴离子-Mustang Q)或Pall BioPharmaceuticals。优选地，所述膜型阳离子交换材料为Sartobind CM或Sartobind S或Mustang S或Mustang C。 在另一实施方案中，通过透析或者通过用乙醇或丙酮沉淀污染蛋白并移出含有聚 糖的上清来纯化聚糖。用于除去蛋白质、去污剂(来自变性步骤)或/和盐的其他实验方 法包括本领域已知的方法。 在另一实施方案中，如下纯化聚糖使聚糖与磁珠亲和结合或与磁性反相珠(如 C18珠)结合，除去盐和蛋白质，其后从珠上洗脱聚糖。 也适用于本发明的一般性层析方法及其用途为本领域技术人员所知。参阅如 Chromatography,第五片反，Part A-Fundamentals and Techniques, Heftma皿，E.(编著)， Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992) ;Advanced Chromatographic and Electromigration Methods inBiosciences， Deyl， Z.(编著)，Elsevier Science BV， Amsterdam, TheNetherlands， (1998) ^Chromatography Today, Poole， C. F. 禾卩 Poole， S. K. ， Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991) ;Scopes， ProteinPurification-Principles and Practice(1982) ;Sambrook， J. 等(编 著)， Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第二片反，Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. ，1989 ;或Current Protocolsin Molecular Biology, Ausubel， F. M.等(eds) ， John Wiley&Sons， Inc. ， New York。 例如，为了纯化重组产生的异源免疫球蛋白，常利用不同柱层析步骤的组合。 一般 而言，蛋白A亲和层析后是一个或两个额外的分离步骤。最后的纯化步骤是所谓的"精制 步骤"，用于除去痕量杂质和污染物，如聚集的免疫球蛋白、残余的HCP (宿主细胞蛋白质)、 DNA(宿主细胞核酸)、病毒或内毒素。为进行该精制步骤，常使用流通模式的阴离子交换材 料。 所述亲和材料可以是例如蛋白A亲和材料、蛋白G亲和材料、疏水电荷诱导层析材
16料(HCIC)或疏水相互作用层析材料(HIC，例如苯-琼脂糖、氮杂-arenophilic树脂或间氨 基苯基硼酸)。优选地，疏水亲和材料是蛋白A材料或HCIC材料。 在该方法的步骤(G)中，测定重组产生蛋白质的糖基化谱。有若干技术可用于测 定糖基化异源多肽(糖蛋白)的糖基化谱，用于分析糖基化多肽之糖基化谱的任何分析方 法均可使用。术语"分析糖基化谱"表示获得可用于确定糖蛋白的糖基化位点或/和糖基 化位点占据，或/和聚糖或/和糖蛋白的非糖部分的身份或/和结构或/和组成或/和数 量，以及特定糖形的身份及数量的数据。 可用于分析糖基化谱的方法可选自质谱、核磁共振(NMR，如2D-NMR)、层析法或 电泳法。示例性质谱法为FAB-MS、 LC-MS、 LC_MS/_MS、 MALDI-MS、 MALDI-T0F、 TANDEM-MS、 FTMS或电喷雾电离四极飞行时间-MS(ESI-QTOF-MS ;参阅如Miithing， J.等，Biotech. Bioeng. 83(2003)321-334) 。 NMR法为例如C0SY、T0CSY或N0ESY。电泳法为例如CE-LIF (参 阅如Mechref，Y.等，Electrophoresis 26(2005)2034-2046)。在本发明的某些实施方 案中，层析方法为高效阴离子交换层析-脉冲安培计检测(HPAEC;参阅如Field, M.等， Anal. Biochem. 239 (1996) 92-98)、弱离子交换层析(WAX)、凝胶渗透层析(GPC)、高效 液相层析(HPLC)、正相高效液相层析(NP-HPLC)、反相HPLC (RP-HPLC)或多孔石墨碳 HPLC(PGC-HPLC)。 在另一些实施方案中，使用结构和/或组成和/或身份已知的聚糖标准品的校准 曲线来定量聚糖。 可用于在从蛋白质释放后分析聚糖的糖组成的其他方法包括涉及用化学或荧光 标记对糖进行标记的方法。这些方法为荧光辅助糖类电泳(FACE)、HPLC或毛细管电泳(CE， 参阅如Rhomberg， E.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(1998)4176-4181)。
在一些实施方案中，通过质谱测量来补充HPLC，测定糖基化谱。在有大量样品可 用时，作为能解析更复杂聚糖之结构的单独的不相关技术，补充性质谱数据(如MALDI、ESI 或LC/MS)可用于例如验证HPLC测定的糖基化谱。在本发明的某些实施方案中，用于标准聚糖的分析方法包括使用MALDI-T0F MS。
其中未修改的聚糖信号强度代表其在样品中的相对摩尔分数，使得可对中性及唾液酸化的
聚糖信号进行相对定量。用于分析寡糖的MALDI MS技术还描述于(Juhasz，P.和Biema皿，
K. ， Carbohydr. Res. 270(1995) 131-147 ;Venkataraman， G等，Science 286 (1999)537-542 ;
Rhomberg， E.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 4176-4781 ;Harvey， D. J. ， Mass.
Spectrom. Rev. 18(2000)349-450)。 本发明的实验条件在以下实施例中描述。 基质化合物和样品制备方法对分析物在MALDI MS中的离子响应有重大影响。在 本发明的某些实施方案中，基质制剂为2， 5- 二羟基苯甲酸(DHB)。在一些实施方案中，基质 制剂是含有或不含精胺的咖啡酸。在另一些实施方案中，基质制剂是含有精胺的DHB。例 如，精胺可以300mM的浓度存在于基质制剂中。基质制剂还可以是DHB、精胺和乙腈的组合。 MALDI MS也可以在Nafion和ATT (6-氮杂_2-硫代胸腺嘧啶)存在下进行。在另一些实 施方案中，可使用以下基质0_氰基-4-羟基-肉桂酸(4-11(1^)、4-羟基-3-甲氧基肉桂 酸(FA)、3-羟基妣啶甲酸(HPA)、5-甲氧基唾液酸(MSA)、DHB/MSA、DHB/MSA/岩藻糖、DHB/ Isocarbostyril(HIC)，或US 5， 045， 694和US 6， 228， 654中所述那些。除了基质以外，样品制备方法(如氯化钠浓度(对于非衍生寡糖)、蒸发环境(空气还是真空)和重结晶条件 (使用不同有机溶剂))可影响总体分析的灵敏度，因此必须进行控制。
此外，在使用MALDI-TOF MS分析样品时，也可以修改仪器参数。这些参数包括 导线电压、加速电压、网格值或/和负模式还是正模式。在本发明的某些实施方案中，对 于阳离子模式的未修饰聚糖的MALDI-TOFMS，本发明的最佳质谱测定数据记录范围为大于 (over)200m/z，对于改进的数据质量为大于m/z 1000。对于阴离子模式的未修饰聚糖的 MALDI-TOF质谱，本发明的最佳质谱数据记录范围为大于m/z 200，对于改进的数据质量为 大于m/z 1000。 优选的范围取决于样品聚糖的大小。具有高分支或多糖含量或者具有高唾液酸化
水平的样品优选在含有阴离子模式所述较高上限的范围中进行分析。优选组合所述界限以
形成具有最高和最低大小或者最低下限和最低上限的范围，其他界限类似地提高大小。 质谱的聚糖分析范围包括测定糖基化多肽中糖基化位点的占据、聚糖和/或非糖
部分的身份、结构、组成和/或数量，以及特定糖形的身份和数量。为此，使用聚糖文库。在
一些实施方案中，使用组合的分析型计算机平台来实现彻底的聚糖表征。 在另一实施方案中，该方法还包括以计算机生成的数据结构来记录模式。 在该方法的步骤(H)中，将糖基化多肽的糖基化谱与期望的预定参照糖基化谱进
行比较。这可以手动或自动进行。在本发明的某些实施方案中，使用Excel macro进行自
动化分析。 在该方法的步骤(I)中，根据步骤(G)获得的结果(S卩，当步骤(G)测定的糖基化 谱与预定的参照糖基化谱不同时)，将步骤(A)的细胞克隆在改变的培养条件下培养。接 着，将步骤(C)至(H)重复数次，在一个实施方案中重复2至20次，在另一实施方案中重 复2至10次，或每日重复，以最终获得与预定的参照糖基化谱一致的糖基化多糖。例如，如 果检测到该糖基化多肽仅含有少量的某种单糖，则特别向培养基中加入该单糖(参阅如US 6， 673， 575)。 在本发明方法的步骤(I)中，对培养条件的修改选自改变所提供营养物、缓冲剂、 添加剂、糖类或铵的类型和浓度，或溶解氧的浓度，或摩尔渗透压浓度，或pH值，或温度，或 细胞密度，或生长阶段。可以单独或组合地改变所有这些参数，以获得具有参照糖基化多肽 的糖基化模式的糖基化异源多肽。所有这些参数可手动或自动控制。例如，通过改变氯化 钠、不同氨基酸、水解产物或氢氧化钠的浓度来改变摩尔渗透压浓度，通过添加酸或碱来改 变pH值，例如从pH 6. 9改变至pH 7. 2，通过例如添加谷氨酰胺和/或NH4Cl来调节铵浓度。
在一个实施方案中，糖基化多肽的纯化、聚糖的去糖基化和纯化以及其后的 MALDI-TOF MS分析在微量滴定板中以高通量形式进行，允许将所述系统自动化。所述高通 量形式可使用标准多孔形式，如48孔板或96孔板。例如，本发明的方法可以高通量形式使 用，其中使用微孔板和微孔板读数器(例如Tecan SafireTM、 Infinite 或SunriseTM、TeCan Trading AG、 CH)以平行监测多个培养。 意想不到的是，与本领域已知的方法相比，使用本发明方法可以减少测定糖基化 异源多肽的糖基化谱所需的时间。具体地，从仍结合在磁性亲和珠上的糖基化多肽中释放 聚糖，这有效地减少了分析时间。本发明方法允许在发酵过程中调整培养条件，以获得期望 的糖基化谱。此外，本发明方法可以96孔微量滴定板的形式进行，从而可以完全自动化，例如使用Tecan机器人系统。 蛋白质翻译后糖基化的高度动态过程(其中糖类机构应答于细胞信号或细胞阶 段而迅速发生变化)在一些严重的人类疾病中产生关键的信息标志物。例如，已知类风湿 性关节炎患者中的糖类结构可显著改变，特定的糖类在胰腺癌和结肠癌中用作肿瘤相关标 志物(Nishimura， S. I.等，Angew. Chem. Int. Ed 44(2005)91-96)。 因此，本发明还涉及适用于诊断的方法，其包括测定和/或定量疾病的糖基化标 志物。所述方法包括要求保护的糖基化多肽生产方法的步骤。 因此，本发明的一个方面是确定和/或定量糖基化标志物的方法，其包括以下步 骤 (A)使得自患者的含有糖基化多肽的样品接触磁性亲和珠，以使所述糖基化多肽 与所述磁性亲和珠结合， (B)从样品中除去带有结合的糖基化多肽的磁性亲和珠， (C)从与磁性亲和珠结合的糖基化多肽中释放聚糖，而不从磁性亲和珠上释放该 多肽， (D)测定所述糖基化标志物的量，禾口 (E)将该糖基化标志物确定的量与参照糖基化标志物的量进行比较。 在另一实施方案中，该方法在步骤(A)之前包括步骤(A-l)，通过应用一种或多种
层析柱来纯化样品。在一个实施方案中，该方法在步骤(C)之后和步骤(E)之前包括步骤
(D)，以纯化释放的聚糖。 待用上述方法分析的样品可以是例如机体组织或体液(如全血清、血浆、滑液、 尿、精液或唾液、痰、泪液、CSF)、粪便、组织或细胞的样品。待分析的糖基化多肽可以是样品 中的全部糖基化多肽，一部分或仅一种糖基化多肽(已知为一种或多种特定疾病的一种或 多种诊断标志物)。 本申请中使用的术语"糖基化标志物"表示至少由三种单糖组成的多糖，其量在某 些疾病中发生改变(增加或减少)。 在一个实施方案中，所述与疾病状态相关的模式是与癌症相关的模式，所述癌症
为例如前列腺癌、黑素瘤、膀胱癌、乳腺癌、淋巴瘤、卵巢癌、肺癌、结肠直肠癌或头颈癌。在
另一些实施方案中，所述与疾病状态相关的模式是与免疫疾病、神经退行性疾病(如传染
性海绵状脑病、阿尔茨海默病或神经病)、炎症、类风湿性关节炎、囊性纤维化或感染(病毒
或细菌感染)相关的模式。在另一实施方案中，所述方法是用于监测预后的方法，并且已知
的模式与疾病的预后相关。在另一实施方案中，该方法是监测药物治疗的方法，并且已知的 模式与药物治疗相关。 在一个实施方案中，将测得的糖基化谱与推定为健康的另一受试者的对照糖基化 谱进行比较，以测定特定疾病的一种或多种糖基化标志物。在一个实施方案中，糖基化谱 的比较可包括比较谱中的峰值比。在鉴定多于一种糖基化标志物时，可以选择与诊断为患 有特定疾病的受试者的一种或多种参数具有最高相关性的一种或多种标志物(也参阅US 2006/0270048)。 有不同的方法已成熟，并广泛用于蛋白质回收和纯化，例如用微生物蛋白进行亲 和层析(如蛋白A或蛋白G亲和层析)、离子交换层析(如阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式的交换)、亲硫吸附(如使用P-巯基乙醇和其 他SH配体)、疏水相互作用或芳香吸附层析(例如用苯基_琼脂糖、氮杂-arenophilic树 脂或间氨基苯基硼酸)、金属螯合亲和层析(如，使用Ni (II)_和Cu(II)-亲和物质)、大 小排阻层析和电泳法(如凝胶电泳、毛细管电泳)(Vijayalakshmi， M. A. ， A卯l. Biochem. Biotech. 75(1998)93-102)。 提供以下实施例和附图以帮助理解本发明，本发明的真实范围在所附权利要求书 中公开。应该理解，可对所述方法进行改变而不偏离本发明的精神。
附图简述
图1用于重组产生具有确定糖基化谱的抗体A的本发明方法的示例性方案。
图2在产生单克隆抗CCR5抗体的过程中通过PNGase F从样品中释放的寡糖的 MALDI-T0F MS。如实施例2所述，释放抗体的N-连接寡糖，并使用DHB基质，通过阳离子模 式的MALDI-TOF MS进行分析。 图3在补料分批培养中产生单克隆抗CCR5抗体的过程中跟踪选定的聚糖，在培养 过程中不改变培养pH。在不同的时间点，通过PNGase F消化后的MALDI-TOF MS来测定所 产生的与磁性亲和珠结合的抗体的糖基化谱。显示了发酵过程中选定的不同聚糖结构的相 对量。■ Man5， Man6， ▲ Man7， Man8。 图4在补料分批培养中产生单克隆抗CCR5抗体的过程中跟踪选定的聚糖，在培养 过程中改变培养条件。在不同的时间点，通过PNGase F消化后的MALDI-TOF MS来测定所产 生的与磁性亲和珠结合的抗体的糖基化谱。在培养过程中，在第8天将pH由7. 2变成6. 9。 显示了发酵过程中选定的不同聚糖结构的相对量。■ Man5， Man6， ▲ Man7，參Man8。
实施例 实施例1 产生单克隆抗CCR5抗体 根据成熟的方法产生生产重组抗CCR5抗体的细胞(参阅如Olson， W.C.等， J. Virol. 73(1999)4145-4155 ;Samson， M.等，J. Biol. Chem. 272(1997)24934-24941 ; EP 1322332 ;W0 2006/103100 ;W0 2002/083172)并在受控的生物反应器环境中 在无血清培养基中培养(补料分批培养)(参阅如Meissner， P.等，Biotechnol. Bioeng. 75(2001) 197-203)。将温度保持在37"，pH设置为6. 9或7. 2，溶解氧浓度保持在 35%。在发酵开始时，细胞密度为5X105个细胞/ml。在发酵过程中的特定时间点，从培养 物中取出含有重组抗体的样品进行分析。
实施例2 分析含有抗体的样品的糖基化谱 对每个样品，将包被有蛋白G的磁性亲和珠(MagnaBind Protein G， Pierce)用 250 ii 1蛋白G IgG结合缓冲液(Protein G IgG Binding buffer,Pierce)洗涤3次。每次 洗涤步骤后，完全除去结合缓冲液。接着，将200 每种样品和100 结合缓冲液加入制 备好的磁性亲和珠中。接着将溶液在室温下孵育1小时。其后，将液体完全除去。接着将孵 育后的珠用含有2mMTRIS-HCl和150mM NaCl，pH 7. 0的250 y 1溶液洗涤两次，以除去非特 异性结合的材料。其后，将珠用超纯水洗涤3次。每次洗涤步骤之后，将液体完全除去。接
20着向珠中加入60 ii 1超纯水和2 ii 1 PNGase F溶液(lOOmU溶于100 y 1超纯水中)。消化 在37t:下进行4小时。消化后，将2. 2iUl. 5M乙酸溶液加入20 样品中，在室温下再孵 育3小时，以将葡基胺转化成还原形式。接着使用弱阳离子交换材料纯化聚糖。对每个样 品单独准备柱。将阳离子交换材料(AG⑧50W-X8树脂，BIO-RAD)用超纯水洗涤3次。然后 将900ii1经洗涤的树脂装入层析离心柱中(Micro Bio-Spin， BIO-RAD)。将柱以lOOOXg 离心1分钟以除去过量的水。接着将22. 2iU每种样品上样至准备好的柱的表面。将柱以 lOOOXg再离心1分钟。现在液体中含有纯化的糖结构。接着将样品与sDHB基质(1.6mg 2，5-二羟基苯甲酸和0. 08mg 5-甲氧基唾液酸溶于125iU超纯乙醇和125iill0mM NaCl 溶液中)以l : 2的比例混合。接着将l. 5iU化合物直接点样到MALDI-TOF靶上。使样 品干燥，以用于后续的MALDI-TOF分析。使用阳离子反射模式的MALDI-TOF质谱进行测量。
结果 在图3中，显示了在补料分批培养中产生单克隆抗CCR5抗体的过程中选定聚糖的 情况。PH设定为6.9。 Man5含量在发酵过程中稳步提高，在培养15天后相对量为约20X。 在图4中，显示了在改变的环境条件下同一抗体的糖基化谱pH在发酵开始时设定为7. 2。 发酵开始8天后将pH改变成6. 9。与图3所示实验中获得的数据相比，Man5的相对量在发 酵的最后几天中下降，导致较低的最终Man5相对含量(16% )。
2权利要求
用于在发酵过程中对重组产生的糖基化多肽的糖基化谱进行在线分析的方法，其包括以下步骤(A)从培养产生所述糖基化异源多肽的真核细胞的培养基中获得样品，(B)使所述样品与磁性亲和珠在适于所述异源多肽与所述珠结合的条件下接触，(C)从与所述磁性亲和珠结合的异源多肽中释放聚糖，而不从所述磁性亲和珠上释放所述异源多肽，(D)通过高效液相层析纯化(C)中释放的聚糖，(E)通过衬质辅助激光解吸与电离-飞行时间质谱分析(D)中纯化的聚糖，从而测定所述异源多肽的糖基化谱。
2. 用于重组产生糖基化异源多肽的方法，其包括以下步骤(A) 提供含有编码所述异源多肽的核酸的细胞，(B) 在适于表达所述异源多肽的条件下培养所述细胞，(C) 从所述细胞的培养基中获得样品，(D) 使所述样品与磁性亲和珠在适于所述异源多肽与所述磁性亲和珠结合的条件下接触，(E) 从与所述磁性亲和珠结合的所述异源多肽中释放聚糖，而不释放所述异源多肽，(F) 纯化步骤(E)中释放的聚糖，(G) 测定所述异源多肽的糖基化谱，(H) 将所测定的糖基化谱与参照糖基化谱进行比较，(I) 根据步骤(H)所得结果调整培养条件，任选地继续进行培养和步骤(J)，或者终止 培养并获得所述糖基化异源多肽，和(J)重复步骤(C)至(H)，以获得糖基化的异源多肽。
3. 根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述糖基化异源多肽是免疫球蛋白。
4. 根据权利要求3的方法，其特征在于所述磁性亲和珠是其上结合有A蛋白、G蛋白或 L蛋白的磁性亲和珠。
5. 根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述聚糖的释放是通过N-糖苷酶 进行的酶促释放。
6. 根据权利要求1至4中任一项的方法，其特征在于所述聚糖的释放是通过肼解进行 的化学释放。
7. 根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述对释放的聚糖的纯化通过使用 反相层析树脂和/或阳离子交换层析树脂进行的高效液相层析来进行。
8. 根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述对异源多肽糖基化谱的测定通 过对释放和纯化的聚糖进行衬质辅助激光解吸与电离_飞行时间质谱分析或定量高效液 相层析分离来进行。
9. 根据权利要求2的方法，其特征在于步骤(D)至(G)使用微量滴定板以高通量形式 进行。
10. 根据权利要求2的方法，其特征在于所述对培养条件的调整包括对以下一种或多种的改变(i) 营养物、糖类、添加剂、缓冲剂、铵、溶解氧的浓度，或/和(ii) 摩尔渗透压浓度、pH值、温度或细胞密度，或/和(iii) 生长状态。
11. 根据权利要求2的方法，其特征在于所述方法包括额外的步骤(K) :(K)从培养基 或细胞中回收所述糖基化异源多肽。
12. 根据权利要求11的方法，其特征在于所述方法在步骤(K)之后包括额外的步骤(L):(L)纯化所述异源多肽。
13. 根据权利要求2的方法，其特征在于所述步骤(E)是(E) 通过从样品中除去具有结合的异源免疫球蛋白的磁性亲和珠而从异源多肽中释放 聚糖，并回收释放的聚糖而不从磁性亲和珠上释放异源多肽。
14. 根据权利要求2的方法，其特征在于所述步骤(F)是(F) 通过在阳离子交换树脂或反相上进行高效液相层析来纯化(E)中释放的聚糖。
15. 根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述细胞是CHO细胞，或BHK细胞， 或HEK细胞。
16. 根据权利要求2的方法，其特征在于根据测定的糖基化谱而在细胞培养全程中连 续添加营养物。
17. 根据权利要求2的方法，其特征在于所述培养基和营养物溶液是无动物血清的。
18. 根据权利要求2的方法，其特征在于所述培养是悬浮培养。
19. 根据权利要求2的方法，其特征在于生长期后的细胞浓度大于1X106个细胞/ml 或大于5 X 106个细胞/ml ，或者细胞的细胞干重大于100g/l或大于200g/l 。
20. 根据权利要求2的方法，其特征在于发酵过程中所有糖的总浓度为0. lg/1至10g/1。
21. 根据权利要求20的方法，其特征在于培养基中所有糖的总浓度为2g/l至6g/l。
22. 根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述糖基化异源多肽分别占步骤 (B)或(D)中所述结合多肽的大于75wt^。
23. 根据权利要求2的方法，其特征在于步骤(E)还包括使所述释放的聚糖与聚糖降解 酶接触。
24. 根据权利要求2的方法，其特征在于所述去糖基化步骤(E)包括在切割聚糖之前使 该糖基化异源多肽变性和/或去折叠。
25. 根据权利要求24的方法，其特征在于在变性后使所述糖基化异源多肽还原。
26. 用于定量哺乳动物细胞所表达的糖基化标志物的方法，其包括以下步骤(A) 使来自哺乳动物细胞、细胞培养上清、细胞裂解物或样品的含有糖基化多肽的样品 接触磁性亲和珠，(B) 通过N-糖苷酶从亲和结合的糖基化多肽中酶促释放聚糖，而不释放该糖基化多肽，(C) 通过HPLC和/或阳离子交换层析纯化所释放的聚糖，(D) 通过LC-MS、 MALDI-TOF或定量HPLC测定所述糖基化标志物的量，(E) 通过将所述糖基化谱与参照谱进行比较来定量糖基化标志物。
全文摘要
本发明提供了用于产生糖基化异源多肽的方法，其包括以下步骤从粗发酵液中获得样品，将该样品与磁性亲和珠一起孵育，从固定的糖基化多肽中释放聚糖，测量糖基化谱，将该糖基化谱与该重组糖基化多肽的期望糖基化谱进行比较，根据获得的糖基化谱改变培养条件，以及重复该方法以获得具有期望的糖基化谱的糖基化异源多肽。使用相似的方法，可以鉴定和定量诊断标志物。
文档编号C12P21/00GK101784670SQ200880104294
公开日2010年7月21日 申请日期2008年8月20日 优先权日2007年8月31日
发明者D·罗伊施, M·哈伯格 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司