本发明属于植物病害病原检测技术领域，具体涉及一种基于环介导等温扩增技术的烟草根结线虫病病原检测试剂盒及其使用方法。
背景技术：
烟草根结线虫病是一种严重影响烟草生产的土传性病害。近年来，用于根结线虫病防治的多数化学杀线虫剂存在高毒、高残留的弊端，已在世界范围内被普遍禁用。因此采取安全高效的根结线虫病防控方法已成为大势所趋。在烟草根结线虫病的防控过程中，选择采用合适的抗病烟草品种被认为是一项经济、高效、绿色的措施。然而，根结线虫种类繁多，不同根结线虫对寄主植物的致病能力不同，抗病品种对根结线虫的抗性范围也有限，当前国内烟草上分布最广泛危害最严重的根结线虫主要是花生根结线虫（meloidogynearenaria）、南方根结线虫（m.incognita）和爪哇根结线虫（m.javanica），这三种根结线虫的形态和分子生物学特征极为相似，但对不同烟草品种存在较大的致病性差异。因此准确、快速鉴定上述三种根结线虫是选育和利用抗病烟草品种的前提条件。
鉴定根结线虫种类最常用的方法是形态学方法，该方法通过显微操作方法切割根结线虫雌成虫会阴区角质膜，在显微镜下观察会阴区花纹的差异来确定根结线虫的种类。这种方法的优点是简便、直观，存在的弊端是：1.根结线虫种类多，许多种类的会阴花纹特点比较容易混淆，使得鉴定的准确性完全依靠操作者的经验，误判的概率较高；2.同一种类的根结线虫的会阴花纹存在个体差异，在实际操作时至少需要对20头以上的雌成虫进行观察才能确诊，费工、费时；3.形态学鉴定只适用于成虫，不适宜幼虫，而土壤中分离到的根结线虫都是以二龄幼虫的形式存在，使的该方法在实际应用中受到限制。另外，同工酶电泳方法也是根结线虫鉴定中常用的方法，该方法以根结线虫雌成虫的蛋白粗提物进行聚丙烯酰胺电泳，通过酯酶和苹果酸脱氢酶同工酶染色后根据酶带的谱型来进行种类判断，该方法部分克服了形态学鉴定的缺点，可以比较快速准确的判断根结线虫种类，但依然只能用雌成虫来作为鉴定对象。
近年来随着分子生物学技术的发展，采用pcr技术对根结线虫进行快速、准确鉴定已成为趋势。与形态学和同工酶电泳鉴定方法相比，pcr鉴定法适用范围更为广阔，根结线虫的卵、二龄幼虫和雌雄成虫皆可作为鉴定的对象。早期的pcr鉴定包括采用随机引物扩增的rapd－pcr技术或采用线虫通用引物扩增后再对扩增产物进行限制性酶切的pcr－rflp技术，它们的共同缺点是由于使用非根结线虫专用的特异引物而造成鉴定的稳定性和准确性不高。因此，国内外学者近年来开始转而采用根结线虫种类特异性pcr引物扩增来进行根结线虫的种类鉴定。徐建华等发明的《一种根结线虫快速分子检测引物及其用法》（专利号：zl03131763.4），曾建敏等发明的《一种烟草中根结线虫的鉴定方法》（专利号：zl201610585565.x）提供了烟草根结线虫病病原线虫pcr鉴定的新方法，该方法采用三对根结线虫种类特异引物对分离自烟草病根和土壤的根结线虫分别进行pcr检测，鉴定方便，准确率高，大大提高了烟草根结线虫病病原的诊断效率。但由于采用了常规pcr检测法，使得鉴定过程操作繁琐、耗时长，且需要较为昂贵的仪器设备。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种基于环介导等温扩增技术的烟草根结线虫病病原检测试剂盒；第二目的在于提供所述的基于环介导等温扩增技术的烟草根结线虫病病原检测试剂盒的使用方法。
本发明的第一目的是这样实现的，所述的基于环介导等温扩增技术的烟草根结线虫病病原检测试剂盒包括用于检测南方根结线虫的i反应液，检测花生根结线虫的a反应液，检测爪哇根结线虫的j反应液，bstdna聚合酶大片段和100×sybrgreeni染色液；
其中，i反应液的溶质及其浓度为：引物mif3和mib3各0.2μmol·l-1，引物mifip和mibip各1.6μmol·l-1，dntps（2.4mmol·l-1），tris-hcl（20mmol·l-1，ph8.8），kcl（10mmol·l-1），mgso4（6.0mmol·l-1），(nh4)2so4（10mmol·l-1），0.1%tritonx-100；
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a反应液的溶质及其浓度为：引物maf3和mab3各0.2μmol·l-1，引物mafip和mabip各1.6μmol·l-1，dntps（2.4mmol·l-1），tris-hcl（20mmol·l-1，ph8.8），kcl（10mmol·l-1），mgso4（6.0mmol·l-1），(nh4)2so4（10mmol·l-1），0.1%tritonx-100；
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j反应的溶质及其浓度为：引物mjf3和mjb3各0.2μmol·l-1，引物mjfip和mjbip各1.6μmol·l-1，dntps（2.4mmol·l-1），tris-hcl（20mmol·l-1，ph8.8），kcl（10mmol·l-1），mgso4（6.0mmol·l-1），(nh4)2so4（10mmol·l-1），0.1%tritonx-100；
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本发明的第二目的是这样实现的，是将含有待测烟草根结线虫病原线虫的dna提取液，分别加入烟草根结线虫病病原线虫lamp检测的试剂盒所包含的i反应液、a反应液和j反应液中，在bstdna聚合酶大片段的作用下进行环介导等温扩增，然后进行sybrgreenⅰ染色，可见光或紫外光下观察，如果i反应液呈现绿色表示待测样品含有南方根结线虫，呈现橘红色表示待测样品不含南方根结线虫；如果a反应液呈现绿色表示待测样品含有花生根结线虫，呈现橘红色表示待测样品不含花生根结线虫；如果j反应液呈现绿色表示待测样品含有爪哇根结线虫，呈现橘红色表示待测样品不含爪哇根结线虫。
环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)，是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换dna聚合酶(bstdnapolymerase)的作用下，60--65℃恒温扩增，15-60分钟左右即可实现109~1010倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强等特点。对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果的检测也很简单，不需要像pcr那样进行凝胶电泳，环介导等温扩增反应的结果通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，简便快捷，适合基层快速诊断。目前已成功应用于临床疾病的诊断、流行性细菌或病毒的定性定量检测等领域，但尚无应用于烟草根结线虫病病原鉴定的报道。
本发明与现有技术相比，其优点和积极效果表现在：
1.操作简单：本发明基于环介导等温扩增技术，对检测条件的要求低，只需水浴锅或恒温箱就能实现检测，利于推广应用。
2.检测效率高：本发明包含的试剂盒及方法由于不需要进行凝胶电泳，肉眼可以直接观察检测结果，因而耗时短，1.5h可以完成检测。
3.应用范围广：本发明试剂盒包含了用于南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫检测lamp检测的引物，可以同步对烟草根结线虫病常见的三种病原根结线虫进行检测。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的基于环介导等温扩增技术的烟草根结线虫病病原检测试剂盒包括用于检测南方根结线虫的i反应液，检测花生根结线虫的a反应液，检测爪哇根结线虫的j反应液，bstdna聚合酶大片段和100×sybrgreeni染色液；
其中，i反应液的溶质及其浓度为：引物mif3和mib3各0.2μmol·l-1，引物mifip和mibip各1.6μmol·l-1，dntps（2.4mmol·l-1），tris-hcl（20mmol·l-1，ph8.8），kcl（10mmol·l-1），mgso4（6.0mmol·l-1），(nh4)2so4（10mmol·l-1），0.1%tritonx-100；
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a反应液的溶质及其浓度为：引物maf3和mab3各0.2μmol·l-1，引物mafip和mabip各1.6μmol·l-1，dntps（2.4mmol·l-1），tris-hcl（20mmol·l-1，ph8.8），10mmol·l-1kcl，mgso4（6.0mmol·l-1），10mmol·l-1(nh4)2so4，0.1%tritonx-100；
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j反应的溶质及其浓度为：引物mjf3和mjb3各0.2μmol·l-1，引物mjfip和mjbip各1.6μmol·l-1，dntps（2.4mmol·l-1），tris-hcl（20mmol·l-1，ph8.8），kcl（10mmol·l-1），mgso4（6.0mmol·l-1），(nh4)2so4（10mmol·l-1），0.1%tritonx-100；
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bstdna聚合酶大片段的浓度为8u/μl。
本发明所述的基于环介导等温扩增技术的烟草根结线虫病病原检测试剂盒的使用方法，是将含有待测烟草根结线虫病原线虫的dna提取液，分别加入烟草根结线虫病病原线虫lamp检测的试剂盒所包含的i反应液、a反应液和j反应液中，在bstdna聚合酶大片段的作用下进行环介导等温扩增，然后进行sybrgreenⅰ染色，可见光或紫外光下观察，如果i反应液呈现绿色表示待测样品含有南方根结线虫，呈现橘红色表示待测样品不含南方根结线虫；如果a反应液呈现绿色表示待测样品含有花生根结线虫，呈现橘红色表示待测样品不含花生根结线虫；如果j反应液呈现绿色表示待测样品含有爪哇根结线虫，呈现橘红色表示待测样品不含爪哇根结线虫。
下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：
实施例1
烟草根结线虫病病原线虫lamp检测试剂盒的制备
（1)用于三种烟草根结线虫病病原线虫鉴定的lamp引物的设计：根据美国国家生物技术信息中心（ncbi）公布的南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫基因组序列信息，采用primerexplorerv4软件lamp引物。设计了用于上述三种根结线虫鉴定的lamp引物各一组，分别为：
南方根结线虫lamp引物：
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花生根结线虫lamp引物：
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爪哇根结线虫lamp引物：
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（2）i反应液的制备：所述的i反应液的溶质及其浓度为：引物mif3和mib3各0.2μmol·l-1，引物mifip和mibip各1.6μmol·l-1，dntps（2.4mmol·l-1），tris-hcl（20mmol·l-1，ph8.8），kcl（10mmol·l-1），mgso4（6.0mmol·l-1），(nh4)2so4（10mmol·l-1），0.1%tritonx-100。
（3）a反应液的制备：所述的a反应液的溶质及其浓度为：引物maf3和mab3各0.2μmol·l-1，引物mafip和mabip各1.6μmol·l-1，dntps（2.4mmol·l-1），tris-hcl（20mmol·l-1，ph8.8），kcl（10mmol·l-1），mgso4（6.0mmol·l-1），(nh4)2so4（10mmol·l-1），0.1%tritonx-100。
(4）j反应液的制备：所述的j反应的溶质及其浓度为：引物mjf3和mjb3各0.2μmol·l-1，引物mjfip和mjbip各1.6μmol·l-1，dntps（2.4mmol·l-1），tris-hcl（20mmol·l-1，ph8.8），kcl（10mmol·l-1），mgso4（6.0mmol·l-1），(nh4)2so4（10mmol·l-1），0.1%tritonx-100。
（5）烟草根结线虫病病原线虫lamp检测试剂盒的组成：所述的试剂盒由检测南方根结线虫的i反应液，检测花生根结线虫的a反应液，检测爪哇根结线虫的j反应液，浓度为8u/μl的bstdna聚合酶大片段，100×sybrgreenⅰ染色液组成，各组份均单独包装。
实施例2
烟草根结线虫病样品dna提取
从洗净烟草根结线虫病的病根样品上剪取根结10-20个置于经高压灭菌的研钵中，加入液氮研磨成粉末转入预先加有100μl的100ng·μl-1的蛋白酶k溶液1.5ml的离心管中，60℃水浴1h后95℃加热10min，12000r·min-1离心1min，所得的上清液即为用于pcr检测的dna提取液。
实施例3
应用烟草根结线虫病病原线虫lamp检测试剂盒进行检测
取3支经无菌处理的0.2ml的pcr管，分别加入加入烟草根结线虫病病原线虫lamp检测的试剂盒所包含的i反应液、a反应液和j反应液各取22μl；在各管中依次加入烟草根结线虫病样品dna提取液2μl和bstdna聚合酶大片段1μl；混合均匀后，将pcr管置于60-65℃恒温水浴中保温45min，82℃保温5min。保温结束后，每管中加入2ul100×sybrgreenⅰ，混匀后紫外照射下观察颜色变化；如果i反应液呈现绿色表示待测样品含有南方根结线虫，呈现橘红色表示待测样品不含南方根结线虫；如果a反应液呈现绿色表示待测样品含有花生根结线虫，呈现橘红色表示待测样品不含花生根结线虫；如果j反应液呈现绿色表示待测样品含有爪哇根结线虫，呈现橘红色表示待测样品不含爪哇根结线虫。
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<110>云南省烟草农业科学研究院
<120>一种基于环介导等温扩增技术的烟草根结线虫病病原检测试剂盒及其使用方
法
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