基于环介导等温扩增技术检测胡萝卜软腐果胶杆菌的方法、其引物组合物及检测试剂盒的制作方法
【专利说明】基于环介导等温扩增技术检测胡萝卜软腐果胶杆菌的方 法、其引物组合物及检测试剂盒 【技术领域】
[0001] 本发明基因检测诊断领域，具体涉及一种基于环介导等温扩增技术检测胡萝卜软 腐果胶杆菌的方法，其涉及的引物组合物、所述引物组合物的应用及胡萝卜软腐果胶杆菌 的检测试剂盒。 【【背景技术】】
[0002] 胡萝卜软腐果胶杆菌（Pectobacterium carotovorum)是引起蔬菜细菌性软腐病 的一种世界性流行病害，其宿主范围十分广泛，可以引起多种园艺作物例如芹菜、胡萝卜、 番茄、黄瓜、马铃薯、甜瓜等发生软腐病并带来巨大的经济损失。由于胡萝卜软腐果胶杆菌 的致病性较强，病害一但发生很难防治，且市场上缺乏针对细菌性软腐病的专一性杀菌剂， 因此目前该病害的防治以预防为主。对于预防病害的发生，早期的病原菌检测技术显得尤 为重要。
[0003] 植物病原微生物检测通常采用形态学、生理生化及分子技术手段。随着生物信息 及DNA测序技术的发展，分子检测技术的应用正在向检测广度及深度多层次进行深入。目 前常用的病原菌分子检测技术包括：普通PCR、荧光定量PCR、免疫测定法等。这些检测技术 的应用通常因昂贵的实验仪器及苛刻的实验条件而受到一定的限制，很难实现病害病原微 生物的田间现场检测。
[0004] 目前用于检测软腐果胶杆菌的方法包括普通PCR、巢式PCR及荧光定量PCR等，该 类检测方法需要依赖精密的温度循环装置，检测过程复杂，检测时间较长，不能满足病原菌 快速检测的需要。
[0005] 例如中国发明专利申请CN 102559901A公开了一种特异性检测胡萝卜软腐果胶 杆菌的PCR方法，以致病菌果胶裂解酶基因特异的引物对待测样品进行PCR扩增，最后 电泳鉴定。并公开其特异性引物包括正向引物：5' -CTATAGCGGTAATGAAG-3'，反向引物： 5' -TTACCGACGCCAGCATAG-3'。
[0006] 然而，该技术中所用引物未进行实验验证，也没有对引物进行灵敏性检测，且特异 性检测中仅涉及了 3种其它对照菌株，其灵敏性及特异性存在争议。而且，其PCR扩增方法 只能对菌株提取后的DNA进行检测，不能实现菌悬液的直接检测。更重要的是该方法检测 所需要的时间在2小时以上，扩增产物不能直接目视检测，必须通过琼脂糖凝胶电泳进行 检测，操作繁复。
[0007] 2000年，日本荣研化学株式会社开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法即环介导等 温扩增技术（Loop-Mediated IsothermalAmplification，LAMP)，其特点是针对革E基因的 6 个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件（63°C左右）保温60分 钟左右，即可完成核酸扩增反应。LAMP反应的结果可以通过电泳检测形成梯形条带，也可以 通过加入不同种类的核酸染料进行目视观察。然而，目前尚缺乏将LAMP技术应用于胡萝卜 软腐果胶杆菌检测的技术的设想及验证。 【
【发明内容】
】
[0008] 本发明的目的是克服现有技术缺陷，针对现有的胡萝卜软腐果胶杆菌的生物学检 测方法耗时长、操作复杂、准确性差等缺陷，并针对PCR检测技术必须依赖热循环仪器、因 此无法快速检测胡萝卜软腐果胶杆菌从而存在推广困难的问题，提供了一种胡萝卜软腐果 胶杆菌的新型检测方法及实现该方法的特异性引物及检测试剂盒。
[0009] 本发明基于将环介导等温扩增技术应用至胡萝卜软腐果胶杆菌检测的思路，提供 了用于检测胡萝卜软腐果胶杆菌（Pectobacterium carotovor um)的引物组合物，所述引 物组合物由以下组成：
[0010] 正向内引物 FIP: 5 ' -CCTGAGAGCCGGCTTTCAGCTGCTGACGCCGAAAGAGT-3 '，
[0011] 反向内引物 BIP: 5' -CCTGGAACGATGACCCGTCTTCCTTGTGACGCAGATTGTGGA-3'，
[0012] 正向外引物 F3:5 ' -GCTGGATGACAAGCCAGTG-3 '，
[0013] 反向外引物 B3:5' -CGGATGCGGTCTTTCCCTA-3'，
[0014] 环引物 LOOP: 5 ' -ACCAGGCGGGACAGTATCG-3 '。
[0015] 本发明还涉及上述引物组合物在检测胡萝卜软腐果胶杆菌中的应用。
[0016] 进一步地，本发明提供上述引物组合物在环介导等温扩增反应中检测软腐果胶杆 菌的应用。
[0017] 本发明还提供一种胡萝卜软腐果胶杆菌的环介导等温扩增反应检测试剂盒，所述 试剂盒含有上述的引物组合物。
[0018] 优选地，所述试剂盒包含检测溶液以及荧光染料；其中，所述检测溶液含有40 μΜ 正向内引物FIP、40yM反向内引物ΒΙΡ、5μΜ正向外引物F3、5yM反向外引物Β3、20μΜ 环弓丨物 L00P、0.23mM dNTPs、0.83mM Tris - HCl(pH8.8)、0.41mM KCl、0.33mM MgS04、 0· 41mM(NH4)2S04、33. 3mM 三甲铵乙内酯、0· 2wt% Tween20、8U Bst DNA 聚合酶。
[0019] 在本发明中，所述荧光染料可采用钙黄绿素。
[0020] 本发明的试剂盒具有良好的特异性和敏感度，特别对胡萝卜软腐果胶杆菌DNA样 本的检测灵敏度达到I. 92X 10 3ng/μ 1，或对胡萝卜软腐果胶杆菌菌悬液的检测灵敏度达 到 1. 27 X 104cfu/ml〇
[0021] 本发明还提供一种检测胡萝卜软腐果胶杆菌的方法，取待检微生物DNA或菌悬 液，以该DNA或菌悬液为模板，通过上述引物组合物及含有所述引物组合物的检测溶液进 行环介导等温扩增，通过扩增结果得到检测结果。
[0022] 优选地，在进行上述检测时，环介导等温扩增反应条件为63°C，60min。
[0023] 本发明还提供胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种pmrA基因序列作为靶标在环介导 等温扩增反应中检测软腐果胶杆菌的应用。
[0024] 以下将更详细地阐述本发明的技术方案。
[0025] 1、提取病原菌总DNA和植物总DNA
[0026] 采用细菌DNA提取试剂盒（购买自北京天根公司）提取胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝 卜亚种病原菌总DNA，利用离心柱型植物基因组DNA提取试剂盒（购买自北京天根公司）由 发病植株组织提取总DNA，提取DNA保存于-20°C备用。
[0027] 2、特异性引物设计
[0028] 为避免LAMP反应中出现假阳性结果或对非目标菌株产生非特异性扩增，本发明 通过系统分析胡萝卜软腐果胶杆菌的总基因组序列信息，筛选并明确采用胡萝卜软腐果 胶杆菌胡萝卜亚种特异性PmrA基因序列作为靶标，利用LAMP引物在线设计软件http:// primerexplorer. jp/e/针对该序列设计了胡萝卜软腐果胶杆菌特异性LAMP引物组。通过 Blastn program (http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)比较所设计的引物序列与 其它生物种属没有显著同源性。上述各引物在胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种特异性PmrA 基因序列上的具体位置如下：
[0029] 表1:引物序列信息
[0031] 其中正向外引物F3和反向外引物B3在普通PCR反应及荧光定量PCR反应下扩 增片段大小为17〇bp。胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum)的pmrA基因序列已向公众公开，在GenBank中的登录号为 AB447882. 1。
[0032] 3、环介导等温扩增反应（LAMP反应）
[0033] LAMP反应体系为：总体系为25 μ 1，其中浓度为20 μ mol/L的正向内引物FIP和反 向内引物BIP各2 μ 1、浓度为10 μ mol/L的环引物LOOP 2 μ 1、浓度为10 μ mol/L的正向外 引物 F3 和反向外引物 B3 各 0· 5 μ 1、0· 23mM dNTPs、0. 83mMTris - HCl (ρΗ8· 8)、0· 41mMKCl、 0.33mMMgS04、0. 4ImM (NH4)2SO4'33. 3mMBetaine(三甲铵乙内酯）、0· 2% Tween20、8U Bst DNA聚合酶I μ I (BstDNAPolymerase)、钙黄绿素核酸染料I μ 1，加入超纯净水制备得到。 LAMP反应程序为：恒温63°C，60min。
[0034] 4、胡萝卜软腐果胶杆菌LAMP检测试剂盒的制备
[0035] 基于胡萝卜软腐果胶杆菌LAMP检测技术的试剂盒包括胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝 卜亚种标准阳性DNA模板、环介导等温扩增反应液。
[0036] 标准阳性DNA模板由胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的标准菌株进行DNA提取获 得。
[0037] 本发明提供的胡萝卜软腐果胶杆菌LAMP检测试剂盒，针对胡萝卜软腐果胶杆菌 胡萝卜亚种特异性PmrA基因设计引物。采用恒温装置，可用于胡萝卜软腐果胶杆菌灵敏、 快速、准确的检测。此LAMP检测方法多次重复试验误差值小，复现性良好，引物组合物的检 测灵敏度极限为〇. 19fg/ μ L菌株DNA。
[0038] 本发明具有以下优点：
[0039] 1)特异性高，鉴定速度快
[0040] 引物扩增胡萝卜软腐果胶杆菌的特异性序列，LAMP检测特异性高。普通PCR及 荧光定量PCR的检测周期需要2h以上，本发明扩增全程仅需60min，检测速度快，明显优于 PCR方式。
[0041] 2)操作简便、成本低廉
[0042] 与传统PCR相比，本发明的LAMP检测方法结果不需要进一步进行琼脂糖凝胶电泳 检测，在反应前添加钙黄绿素荧光染料可以直接使结果可视化，操作更加简单。此外该LAMP 检测只需要在恒温装置上便能完成反应，不需要昂贵的实验仪器，检测成本低廉。
[0043] 3)实用性强、应用范围广
[0044] 可以检测多种植物发病组织总DNA中的胡萝卜软腐果胶杆菌，且可对胡萝卜软腐 果胶杆菌菌悬液进行直接检测，为病害的田间直接诊断奠定基础，且为病害的早期预测预 报提供方法和依据。 【【附图说明】】
[0045] 图1为引物组合物特异性检测的结果；
[0046] 其中，LAMP扩增曲线中纵轴为浑浊度，横轴为反应时间；
[0047] 其中，1-28为胡萝卜软腐果胶杆菌DNA (菌株编号见表2) ;29~31为黄单胞杆菌、 32-33为丁香假单胞杆菌、34为菊苣假单胞杆菌、35为菊欧文式菌、36为密执安棒形杆菌、 37为劳尔氏菌、38为是嗜酸菌属甜瓜种、39为茄病镰刀菌、40为核盘菌、41为芹菜尾孢菌的 对应DNA、42为无菌水对照；
[0048] 图2为引物组合物灵敏性检测的结果；
[0049] 其中，LAMP扩增曲线中纵轴为浑浊度，横轴为反应时间；
[0050] 其中，1-8为软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的DNA，浓度分别为I. 92X IO1ng/ μ 1-5. 8 X 10 6ng/ μ I ;N为无菌水对照；
[0051] 图3为芹菜组织中胡萝卜软腐果胶杆菌的LAMP检测，扩增产物在1. 2%琼脂糖凝 胶中进行电泳的结果；
[0052] 其中，1-3为分别为北京、河北、河南田间采集得到的芹菜软腐病病样组织总DNA， 4-10为接种不同病原菌的芹菜发病组织总DNA(菌株编号见表3)，11为健康芹菜组织DNA， M为5000bp