DNAladder (博迈德生物有限公司）；
[0053] 图4为芹菜组织中胡萝卜软腐果胶杆菌的LAMP检测，扩增产物在自然光下颜色变 化的观察结果；
[0054] 其中，1-3为分别为北京、河北、河南田间采集得到的芹菜软腐病病样组织总DNA， 4-10为接种不同病原菌的芹菜发病组织总DNA(菌株编号见表3)，11为健康芹菜组织DNA ;
[0055] 图5为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种菌悬液的LAMP检测，扩增产物在自然光下 颜色变化的观察结果；
[0056] 其中，阳性为软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的DNA，阴性为灭菌NA培养基对照，1-8 为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的菌悬液，菌株编号为QC14052001，菌液浓度分别为 I. 27X 108cfu/ml-l. 27 X IO1CfuZml 〇 【【具体实施方式】】
[0057] 下面结合具体实例进一步阐述发明。下列实例仅用于非限制性地说明本发明的技 术方案，而不用于限制本发明的保护范围。
[0058] 实施例1胡萝卜软腐果胶杆菌的引物特异性检测
[0059] 分别采用胡萝卜软腐果胶杆菌28株及其它蔬菜上常见真菌、细菌病害病原菌13 株（如表2)，对胡萝卜软腐果胶杆菌引物组合物进行特异性检测。其中，病原细菌菌株采 用NA培养基培养，病原真菌菌株用PDA培养基培养。随后病原细菌由NA培养基活化后转 入NB培养基在温度26-30°C与转速120-130rpm的条件下振荡培养22-26h，收集菌悬液提 取DNA。病原真菌由PDA培养基活化后转入培养基，在26-30°C与转速120-130rpm的条 件下振荡培养7d后收集菌丝体提取DNA。采用DNA提取试剂盒对病原菌进行DNA的提取。
[0060] 其中，NA培养基的组分为10g/L蛋白胨、3g/L牛肉粉、5g/L氯化钠与18g/L琼脂 粉，余量为水，PH调为7。
[0061] NB培养基的组分为10g/L蛋白胨、3g/L牛肉粉与5g/L氯化钠，余量为水，PH调为 7〇
[0062] PDA培养基的组分为200g/L马铃薯、20g/L葡萄糖及20g/L琼脂粉。
[0063] 培养基的组分为200g/L马铃薯及20g/L葡萄糖。
[0064] 上述用于特异性检测的41株病原菌均为已经公开的、公众可以获得的实验用微 生物，其中第35株菌株从在中国农业微生物菌种保藏中心购买获得，其余菌株均可从中国 农业科学院蔬菜花卉研究所购买获得。
[0065] 表2特异性检测菌株
[0070] 以上述41株病原菌基因组DNA为模板，利用本发明的引物组合物FIP/BIP/F3/B3/ LOOP及如下LAMP反应程序对上述菌株分别进行扩增，以检测该引物组合物的特异性。
[0071] LAMP反应体系如下：总体系为25 μ 1，其中浓度为20 μ mol/L的正向内引物FIP和 反向内引物BIP各2 μ 1、浓度为10 μ mol/L的环引物LOOP 2 μ 1、浓度为10 μ mol/L的正向 外引物 F3 和反向外引物 B3 各 0· 5 μ 1、0· 23mM dNTPs、0. 83mM Tris - HCl(pH8. 8)、0· 41mM KCl、0.33mM MgS04、0.41mM(NH4)2S04、33.3mM Betaine、0.2wt%Tween20、8U Bst DNA聚合酶 lyl(Bst DNAPolymerase)加人超纯净水制备得至lj。LAMP反应程序为：63°C，60min。LAMP 扩增结果通过实时浑浊仪数据输出后整理所得。
[0072] 图1给出了分别对应于41株病原菌的LAMP扩增结果，其中编号1-28表现出明显 的浑浊。如图1所示，实验证实该引物组合物可对28株不同寄主（包括白菜、芹菜、油菜、 番茄、花菜、西萌芦、黄瓜）上的不同亚种的胡萝卜软腐果胶杆菌的DNA进行扩增，同时对 13株蔬菜上的其他常见细菌、真菌性病害病原菌基因组DNA和无菌水对照均无相应扩增产 物，结果说明该引物组对胡萝卜软腐果胶杆菌的特异性良好。
[0073] 实施例2胡萝卜软腐果胶杆菌的引物灵敏性检测
[0074] 以2014年由北京地区采集的芹菜寄主上分离得到的（编号为QC14052001)胡萝 卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种菌株DNA为模板用于引物灵敏性检测。该目标菌株DNA提取后 进行浓度测定，随后10倍梯度稀释制备成1. 92 X IO1ng/ μ 1-1. 92 X 10 6ng/ μ 1，分别编号 为1-8,纯水对照编号为9,按照实施例1记载的反应体系及反应过程进行LAMP反应。
[0075] 如图2所示，检测结果显示该LAMP检测技术对胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的 检测在浓度范围1. 92 X IO1ng/ μ 1-5. 8 X 10 3ng/ μ 1结果良好，表明对胡萝卜软腐果胶杆菌 胡萝卜亚种菌株DNA样本的检测灵敏度达到1. 92 X 10 3ng/ μ 1。
[0076] 实施例3发病芹菜组织样本中胡萝卜软腐果胶杆菌的检测
[0077] 对自然发病的芹菜组织（分别采集自北京、河北、河南田间，编号1-3)及人工接种 的芹菜组织（编号4-10,如表3所示）进行取样，样本为带有典型软腐病发病症状的芹菜茎 段，发病症状包括茎杆呈现湿腐状且变黑发臭，同时选取未发病区域的健康芹菜组织作为 阴性对照样本（编号11)。
[0078] 表3芹菜寄主人工接种的病原菌
[0079]
[0080] 样本收集后分别进行反复清洗，采用75vol %乙醇进行表面消毒，随后无菌水反复 清洗，利用离心柱型植物基因组DNA提取试剂盒（购买自北京天根公司）分别进行植株组 织提取、纯化DNA，按照实施例1记载的反应体系和反应过程进行LAMP检测。
[0081] 如图3所不，编号1-6表现出明显的阳性克隆，编号7-11未观察到明显反应。扩增 结果显示LAMP检测体系可以准确地检测到发病植株组织中带有的胡萝卜软腐果胶杆菌， 包括不同采集地的自然发病样本或人工接种样本均表现出明显的阳性克隆，此外接种其它 非目标菌株及健康芹菜组织的DNA均无阳性克隆。LAMP检测的阳性扩增产物在1. 2%的琼 脂糖凝胶电泳上呈现梯形条带，而阴性扩增产物没有条带。
[0082] 此外，在添加了钙黄绿色核酸染料的LAMP检测产物中，自然光下编号1-6的阳性 扩增产物为绿色，而编号7-11的阴性扩增产物为浅红色，如图4所示。综合以上结果说明 本发明的LAMP检测体系特异性高，不受寄主DNA的影响，也不受采集地或发病手段影响。
[0083] 实施例4胡萝卜软腐果胶杆菌菌悬液的直接检测
[0084] 将2014年由北京地区采集的芹菜寄主上分离得到的（编号为QC14052001)胡 萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种菌株在NA培养基内在26-30°C与转速120-130rpm的条 件下振荡培养12h后，采用紫外分光光度计测量菌悬液浓度。得到最高菌悬液浓度为 I. 27X 10scfu/ml，随后经十倍梯度稀释分别制备成I. 27X 10scfu/ml-l. 27X lOkfu/ml的 菌悬液，分别编号为样品1-8。各取不同浓度的菌悬液lml，经95°C金属浴处理5min后，取 2 μ 1菌悬液按照实施例1记载的反应体系和反应过程进行LAMP检测。
[0085] 如图5所示，扩增结果显示编号1-5的I. 27X 10scfu/ml-l. 27X 104cfu/ml的菌悬 液检测结果为阳性（扩增产物为绿色），其余为阴性（扩增产物为浅红色）。由此可见本发 明的LAMP检测技术对胡萝卜软腐果胶杆菌菌悬液的最高检测灵敏度可达到I. 27 X IO4Cfu/ ml 〇
[0086] 由此可见，本发明的引物组合物及检测试剂盒特异性高、灵敏度好，对不同寄主上 的不同亚种的胡萝卜软腐果胶杆菌特异性好，对DNA样本的检测灵敏度达到1.92X 10 3ng/ μ 1，对菌悬液灵敏度可达到I. 27X 104cfu/ml，明显优于现有技术的其他检测手段；与传统 PCR相比，本发明的检测方法及试剂盒结果可视，操作简单，成本低廉；有效实现多种植物 发病组织总DNA中的胡萝卜软腐果胶杆菌检测，且可对胡萝卜软腐果胶杆菌菌悬液进行直 接检测，为病害的田间直接诊断奠定基础，且为病害的早期预测预报提供方法和依据。
【主权项】
1?用于检测胡萝卜软腐果胶杆菌（Pectobacterium carotovorum)的引物组合物，其 特征在于所述引物组合物由以下组成： 正向内引物 FIP: 5 ' -CCTGAGAGCCGGCTITCAGCTGCTGACGCCGAAAGAGT-3 '， 反向内引物 BIP: 5 ' -CCTGGAACGATGACCCGTCTTCCTTGTGACGCAGAITGTGGA-3 '， 正向外引物 F3:5 ' -GCTGGATGACAAGCCAGTG-3 '， 反向外引物 B3:5 ' -CGGATGCGGTCTTTCCCTA-3 '， 环引物 LOOP: 5 ' -ACCAGGCGGGACAGTATCG-3 '。2. 权利要求1所述的引物组合物在检测胡萝卜软腐果胶杆菌中的应用。3. 权利要求1所述的引物组合物在环介导等温扩增反应中检测软腐果胶杆菌的应用。4. 胡萝卜软腐果胶杆菌的环介导等温扩增反应检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒含 有根据权利要求1所述的引物组合物。5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含检测溶液以及荧光染 料；其中，所述检测溶液含有40 yM正向内引物FIP、40 yM反向内引物BIP、5yM正向外引 物 F3、5 yM反向外引物 B3、20 yM环引物 L00P、0. 23mM dNTPs、0. 83mM Tris - HCl(pH8. 8)、 0? 41mM KC1、0. 33mM MgS04、0. 41mM(NH4)2S04、33. 3mM 三甲铵乙内酯、0? 2wt % Tween20、8U Bst DNA聚合酶。6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述荧光染料是钙黄绿素。7. 权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于对胡萝卜软腐果胶杆菌DNA样本的 检测灵敏度达到I. 92X 10 3ng/y 1，或对胡萝卜软腐果胶杆菌菌悬液的检测灵敏度达到 1. 27 X 104cfu/ml〇8. -种检测胡萝卜软腐果胶杆菌的方法，其特征在于取待检微生物DNA或菌悬液，以 该DNA或菌悬液为模板，通过权利要求1所述的引物组合物及权利要求5所述的检测溶液 进行环介导等温扩增。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于环介导等温扩增反应条件为63°C，60min。10. 胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种PmrA基因序列作为靶标在环介导等温扩增反应 中检测软腐果胶杆菌的应用。
【专利摘要】本发明涉及基于环介导等温扩增技术检测胡萝卜软腐果胶杆菌的方法、其引物组合物及检测试剂盒，其中，用于检测胡萝卜软腐果胶菌的LAMP引物组由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、环引物LOOP组成。本发明的引物组合物及检测试剂盒特异性高、灵敏度好，明显优于现有技术的其他检测手段；与传统PCR相比，本发明的检测方法及试剂盒结果可视，操作简单，成本低廉；能有效实现多种植物发病组织总DNA中的胡萝卜软腐果胶杆菌检测，且可对胡萝卜软腐果胶杆菌菌悬液进行直接检测，为病害的田间直接诊断奠定基础。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68, C12Q1/04
【公开号】CN105018631
【申请号】CN201510493403
【发明人】石延霞, 晋知文, 李宝聚, 谢学文, 柴阿丽
【申请人】中国农业科学院蔬菜花卉研究所
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年8月12日