牧草盲蝽ss-coi pcr快速检测特异引物、检测方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，涉及牧草盲蝽PCR检测方法，具体涉及一种用于牧 草盲蝽SS-COI PCR快速检测的特异引物、基于该引物的PCR快速检测方法、试剂盒。 二、
【背景技术】
[0002] 牧草盲蝽（Lygus pratenszs (Linnaeus))，属半翅目，盲蝽科。俗称小臭虫。主要 寄主为棉花、苜蓿、蔬菜、果树、麻类等。分布在我国东北、华北、西北。为害棉花、甜菜、菠菜、 苜蓿、白菜、萝卜、油菜、胡萝卜等20余种作物以及杂草。
[0003] 我国北方1年生3-4代，以成虫在杂草、枯枝落叶、土石块下越冬。翌春寄主发芽 后出蛰活动，喜欢在嫩叶、嫩茎、花蕾上刺吸汁液，取食一段时间后开始交尾、产卵，卵多产 在嫩茎、叶柄、叶脉或芽内，卵期约10天。若虫共5龄，经30多天羽化为成虫。成、若虫喜 白天活动，早、晚取食最盛，活动迅速，善于隐避。发生期不整齐，6月常迀入棉田，秋季又迀 回到木本植物或秋菜上。天敌主要有卵寄生蜂、捕食性蜘蛛、姬猎蝽、花蝽等。
[0004] 牧草盲蝽以成、若虫危害，均以刺吸式口器刺伤植物组织，吸食汁液。棉苗生长点 被刺伤后，变黑而干枯，造成棉苗无头或多头；嫩叶受害后，初现黑褐色小点，后变黄枯萎， 展叶后出现穿孔、破裂或皱缩变黄。棉花幼蕾受害后变黑干枯，僵硬而脱落，俗称"荞麦粒"； 棉铃受害后，出现黑色凹陷水渍斑，纤维变黄，出现僵瓣。
[0005] 牧草盲蝽在新疆南北部均有分布，以库尔勒、阿克苏、巴楚、麦盖提等地发生较重， 严重影响棉花生长，是新疆棉区中的主要害虫之一。
[0006] 捕食性天敌对害虫具有捕食作用，可有效利用天敌对害虫进行生物防治。而研究 天敌对害虫捕食作用的方法很多，主要采用田间直接观察，消化道解剖观察、以及酶联免疫 法（ELISA)、同功酶电泳、蛋白质电泳分析等，但这些方法都有耗时长、操作复杂、费用高等 局限性。目前，国内外利用节肢动物食物网技术研究农田害虫和天敌的食物链关系，确定已 知的天敌，发现潜在的天敌，定量分析天敌对害虫的捕食作用，对农田害虫的生物防治具 有积极意义。
[0007] Species-Specific-COI PCR检测技术是在mtDNACOI技术的基础上发展起来的特 异序列扩增区域标记，是利用物种特异性COI引物（SS-COI)，根据预期DNA条带的有无来鉴 定检测样本，无需测序和序列比对，其具有灵敏度高、特异性强、重复性好、快速、简便等优 点。为研究天敌对害虫捕食作用提供了定性与定量分析的检测方法。目前该方法已经在棉 蚜等部分害虫的研究中得到应用。
[0008] 但牧草盲蝽的相关研究开展较少，在Genbank上尚未检索到牧草盲蝽COI基因片 段，也未有关于基于特异性引物SS-COI检测方法所必需的PCR扩增特异引物的报道，因此 该方法尚未在牧草盲蝽的快速检测方面得以应用。 三、
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种基于特异性SS-COI引物的牧草盲蝽PCR快速检测的所 需的特异引物、检测方法及试剂盒。
[0010] 第一，本发明根据牧草盲蝽的线粒体DNA序列，设计一对牧草盲蝽的特异性 SS-COI引物，其包括：
[0011] 正向引物 LP84-5F : 5' -GGAGCAGGGACCGGATGAAC-3 '
[0012] 反向引物 LP84-5R : 5 ' -AAAGTAATAATAATGCGGTG-3 '。
[0013] 第二，本发明还提供含有引物LP84-5F和LP84-5R的用于检测牧草盲蝽的试剂盒， 该试剂盒还包括标准阳性模板。
[0014] 第三，本发明还提供一种基于特异性SS-COI引物的牧草盲蝽快速PCR检测方法， 包括以下步骤：
[0015] (1)提取样品DNA
[0016] 在田间采集牧草盲蝽，放入离心管中将其磨碎，用试剂盒提取单头盲蝽基因组总 DNA，将DNA溶液保存于-20°C备用；
[0017] ⑵合成引物
[0018] 合成上述特异性SS-COI引物LP84-5F和LP84-5R。
[0019] (3) PCR 扩增
[0020] 以步骤⑴提取的DNA为模板，利用上述引物LP84-5F和LP84-5R进行PCR扩增 反应；PCR反应体系以20 μ L计为：
[0021]
[0022] PCR反应条件为：94°C预热3分钟；之后94°C 30秒，58 °C 30秒，72 °C 1分钟，共45 个循环；72°C延伸10分钟。
[0023] (4)分析PCR产物
[0024] 对PCR扩增产物用1 %琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后，于凝胶成像系统 中，如出现大小为220bp的DNA条带（SEQ ID No. 3)，则表明样品为牧草盲蝽。
[0025] 本发明是通过DNA条形码技术中的通用引物
[0026] L印Fl : (5' -ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG-3'）和
[0027] L印Rl : (5 ' -AAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3'）扩增出牧草盲蝽的 COI 产物，与 绿盲蝽、苜蓿盲蝽和黑食蚜盲蝽等昆虫的序列进行比对，设计一对特异引物，该引物特异性 强，只针对牧草盲蝽扩增出清晰、单一的长度为220bp的特异性条带，而对棉田中的其它昆 虫无扩增效果。采用SS-COI PCR技术检测牧草盲蝽，该技术操作简单、快速，可在3个小时 内完成检测，且具有较高的灵敏度，DNA最低检出浓度为0. 175ng/μ L。该引物及其检测方 法和试剂盒用于植保领域牧草盲蝽优势天敌确定及食物链分析，特异性强，准确率高，方便 快捷。 四、
【附图说明】
[0028] 图1为本发明实施例中牧草盲蝽的特异性引物LP84-5F/LP84-5R的PCR检测结 果；其中，M :100bp DNA ladder ;1-70为表1中序号所对应昆虫的扩增结果，-为阴性对照。
[0029] 图2为本发明实施例中牧草盲蝽的特异性引物LP84-5F/LP84-5R的DNA浓度梯度 检测结果；其中，M:100bp DNA ladder ;1-6为牧草盲蝽的DNA原模板浓度548ng/yL依次 5倍稀释浓度梯度，7为阴性对照。 五、
【具体实施方式】
[0030] 以下实例均按照常规分子生物学实验条件，以及按照产品说明书建议的条件进行 操作。
[0031] 第一部分，引物LP84-5F/LP84-5R对牧草盲蝽的扩增
[0032] (1)牧草盲蝽基因组的制备
[0033] 在棉田采集牧草盲蝽，将单头牧草盲蝽放入I. 5mL离心管中将其磨碎，用OMEGA Insect Genomic DNA Kit提取试剂盒（OMEGA公司，美国）提取单头盲蝽基因组的总DNA。 将DNA溶液保存于-20°C备用，进行PCR扩增时吸取1 μ L溶液作为DNA模板。
[0034] (2)合成检测牧草盲蝽的特异性SS-COI引物
[0035] 特异性SS-COI引物序列如下：
[0036] LP84-5F :5' -GGAGCAGGGACCGGATGAAC-3'（SEQ ID No. 1)
[0037] LP84-5R :5，-AAAGTAATAATAATGCGGTG-3'（SEQ ID No. 2)
[0038] (3) PCR 扩增
[0039] PCR反应体系以20 μ L计为：
[0040]
[0041] PCR反应条件为：94°C预热3分钟；之后94°C 30秒，58 °C 30秒，72 °C 1分钟，共45 个循环；72°C延伸10分钟。
[0042] (4) PCR产物鉴定
[0043] 取8 yL PCR扩增产物，用I %琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后，于凝胶成 像系统中，根据扩增产物的大小来鉴定牧草盲蝽。如出现大小为220bp的DNA扩增条带，即 为牧草盲蝽（SEQ ID No. 3)。
[0044] 第二部分，引物LP84-5F/LP84-5R对牧草盲蝽的特异性扩增效果
[0045] 利用引物LP84-5F/LP84-5R，以牧草盲蝽DNA为模板，以牧草盲蝽同域的35种其他 昆虫（见表1)为对照进行SS-COI PCR扩增，结果如图1所示，1、2泳道对应的牧草盲蝽扩 增出了 220bp的目的条带，表明根据牧草盲蝽线粒体DNA COI基因设计的SS-COI引物的特 异性强，其220bp序列如SEQID No. 3所示。
[0046] 表1引物特异性检测中所涉及的昆虫种类
[0049] 第三部分，引物LP84-5F/LP84-5R对牧草盲蝽最低检出量的测定
[0050] (1)牧草盲蝽DNA模板的制备
[0051 ] 按第1部分的方法提取单头牧草盲蝽基因组DNA，然后原模板浓度548ng/ μ L以5 倍进行递减稀释至检测不出条带，取1 μ L作为PCR检测的模板，进行PCR反应，其反应体系 同第一部分所述。
[0052] 利用引物LP84-5F/LP84-5R做最低检出量的测定，牧草盲蝽的DNA最低检出浓度 为0. 175ng/yL，结果如图2所示。
[0053] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
[0054] 第四部分，试剂盒制作
[0055] 制作含有引物LP84-5F和LP84-5R的用于检测牧草盲蝽的试剂盒，本试剂盒包括 前述第一部分的所有材料，还包括标准阳性模板。
【主权项】
1. 一种用于牧草盲蝽SS-COI PCR快速检测的特异引物，其特征在于该引物为： 正向引物LP84-5F: 5' -GGAGCAGGGACCGGATGAAC-3 ' 反向引物LP84-5R: 5' -AAAGTAATAATAATGCGGTG-3 '。2. -种基于特异性SS-C0I引物的牧草盲蝽PCR快速检测方法，其特征在于所述的检测 步骤为： (1) 提取样品DNA 在田间采集牧草盲蝽，放入离心管中将其磨碎，用试剂盒提取单头盲蝽基因组总DNA， 将DNA溶液保存于-20°C备用； (2) 合成引物 合成如权利要求1所述的特异性SS-C0I引物； (3) PCR扩增 以步骤⑴提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物LP84-5F和LP84-5R进行PCR扩增反应；PCR反应体系以20 y L计为：PCR反应条件为：94°C预热3分钟；之后94°C30秒，58°C30秒，72°C1分钟，共45个循 环；72°C延伸10分钟。 (4)分析PCR产物 对PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后，于凝胶成像系统中， 如出现大小为220bp的DNA条带，则表明样品为牧草盲蝽。3. -种基于特异性SS-C0I引物的用于快速检测牧草盲蝽的试剂盒，其特征在于该试 剂盒的引物为如权利要求1所述的特征引物，并且该试剂盒还包括牧草盲蝽DNA标准阳性 模板。
【专利摘要】牧草盲蝽SS-COI？PCR快速检测特异引物、检测方法及试剂盒。根据牧草盲蝽的线粒体DNA序列，设计一对牧草盲蝽的特异性SS-COI引物LP84-5F和LP84-5R，该引物只对牧草盲蝽具有特异性扩增效果，扩增产物大小为220bp，DNA最低检出浓度为0.175ng/μL。该引物及其检测方法和试剂盒用于植保领域牧草盲蝽优势天敌确定及食物链分析，特异性强，准确率高，方便快捷。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105018629
【申请号】CN201510483157
【发明人】王冬梅, 丁瑞丰, 刘建, 李海强, 徐遥, 阿克旦, 李号宾, 潘洪生, 陆宴辉, 王剑, 汪飞, 张燕红, 邓菲菲
【申请人】新疆农业科学院植物保护研究所
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年8月3日