氨糖类产品中甲壳源致敏性物质的pcr检测技术的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种通过PCR技术检测氨糖类产品中是 否含有甲壳源致敏物质的方法。
【背景技术】
[0002] 氨基葡萄糖指的是葡萄糖的一个羟基被一个氨基取代的化合物。分子式C6H 13O5N, 俗称氨基糖，简称氨糖，又名葡萄糖胺，广泛存在于自然界，2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖通常 以N-乙酰基衍生物(如甲壳素）或以N-硫酸酯和N-乙酰-3-0-乳酸醚(胞壁酸）形式存在 于微生物、动物来源的多糖和结合多糖中。因此可以从微生物（以丝状真菌、高等真菌为主） 或甲壳类动物(虾蟹）壳中提取氨糖。
[0003] 氨基葡萄糖是形成软骨细胞的重要营养素，是健康关节软骨的天然组织成份。随 着年龄的增长，人体内的氨基葡萄糖的缺乏越来越严重，关节软骨不断退化和磨损。美国、 欧洲和日本的大量医学研究表明：氨基葡萄糖可以帮助修复和维护软骨，并能刺激软骨细 胞的生长。
[0004] 氨糖能舒缓因关节炎引起的疼痛、僵硬和肿胀：骨质疏松症使软骨耗损，最终导致 碎裂剥落，关节少了软骨的缓冲，易产生痛苦的僵硬和发炎，而氨糖有助于修复受损软骨， 刺激新软骨的生成，改善发炎症状，舒缓关节疼痛、僵硬及肿胀；能强化软骨结构，预防关节 功能失效：随着身体老化，关节组织会严重磨损，氨糖可以保护并强化软骨结构，预防因关 节老化而产生的关节功能失效；能润滑关节及维持关节功能：氨糖可制造蛋白多糖润滑关 节，防止骨关节摩擦疼痛，使关节活动自如。氨糖在美国食品药品监督管理局作为膳食添加 剂进行管理，在欧洲，氨基葡萄糖被批准为药物，以硫酸盐的形式销售。
[0005] 然而在联合国粮农组织提出的8大类引起过敏的食物中，虾、蟹等甲壳类动物及 其制品是重要的一类致敏原。因此，源自甲壳类的氨糖有可能因为虾、蟹肉（蛋白）的清除不 彻底，导致易过敏人群服用后发生过敏。所以对氨糖进行甲壳源致敏性物质的检测可以预 防相应人群的发生误服过敏，并为氨糖的原料来源鉴定提供技术基础，为产品标志提供依 据。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种利用PCR技术对氨糖产品进行检测的方法，能够快速、方便、准 确的获知氨糖及其产品中是否含有甲壳类致敏原物质。具体方法如下： (1)扩增引物序列： crustaceanI F5' -TCTAAGCTGCGTACATATCG-3' crustaceanI R5' -ATTATCACACTATTTCCTAC -3' 扩增片段长度为140bp ; crustacean2 F5' -CGCTAATCCAACAAGACAT -3' crustacean2 R5' -CCATTCTGAACAGACATCA -3' 扩增片段长度为150bp。
[0007] (2 )待测样品的DNA提取 处理方法按照 Universal Genomic DNA Extraction Kit TaKaRa，Ver. 3.0,抽提样品 DM。
[0008] (3) PCR 扩增 PCR反应采用25 μ L体系，按以下组分配制PCR反应液：10 X PCR缓冲液2 μ L，10 μ mol/ L的正向和反向引物各I yL，dNTP (10mmol/L)2yL，Taq DNA聚合酶（5U/yL)0. 2yL，模板 DNA (含 50±10ngDNA)lyL，加 dH20 补足 25yL。PCR 反应条件如下：94°C3min，94°C lmin， 66°C lmin，72°C lmin，35个循环；72°C 7min结束反应。4°C保存反应产物，产物采用2%琼 脂糖凝胶电泳进行观察。
[0009] 本发明的优点：首次提出使用PCR方法检测氨糖中可能存在的甲壳源致敏物质， 为提供高质量的氨糖提供了快速、方便的方法。
[0010]
【具体实施方式】
[0011] 实施例1采用虾、蟹壳制备的氨基葡萄糖样品检测 将虾、蟹壳通过水解、脱色、浓缩、结晶、烘干的方法制备氨基葡萄糖(参考中国专利[0012] 结果显示，两种引物均扩增出明显的相应条带，提示在氨糖制备过程中，可能残留 虾、蟹肉（蛋白质）未清除干净，对于特定人群是潜在的致敏源。
[0013] 实施例2采用真菌菌丝体提取的几丁质制备的氨基葡萄糖样品检测 利用几丁质制备氨基葡萄糖，步骤如下：微生物发酵产几丁质酶；获取粗酶液；浓缩酶 液；生产N-乙酰氨基葡萄糖（具体方法参考中国专利公开号CN104388496A)。采用试剂盒 Universal Genomic DNA Extraction Kit TaKaRa，Ver. 3.0提取其中的DNA，然后进行PCR。 PCR条件见下： 扩增引物序列：crustaceanl F5'-TCTAAGCTGCGTACATATCG-3'，crustaceanl R5'-ATTATCACACTATTTCCTAC -3'，扩增片段长度为 140bp;crustacean2 F5' -CGCTAATCCAACAAGACAT -3'，crustacean2 R5' -CCATTCTGAACAGACATCA -3'，扩增片段 长度为150bp。 PCR反应采用25 μ L体系，按以下组分配制PCR反应液：10XPCR缓冲液 2 41^，1〇4111〇1/1的正向和反向引物各141^(1犯13(10臟〇1/1)2 41^丁&9〇嫩聚合酶（51]/ 4 1〇0.2 4 1^，模板0嫩（含50±10即0嫩）14 1^，加(1!120补足25 4匕？0?反应条件如下： 94°C 3min，94°C lmin，66°C lmin，72°C lmin，35 个循环；72°C 7min 结束反应。4°C保存反应 产物，产物采用2%琼脂糖凝胶电泳进行观察。
[0014] 结果显示，两种引物均未扩增出相应条带，该氨糖对甲壳类过敏人群是安全的。
[0015] 实施例3市售氨糖产品的检测 购买市售氨糖产品，分别为：样品1盐酸氨基葡萄糖胶囊，样品2硫酸氨基葡萄糖钾胶 囊，样品3氨糖软骨素加钙片，样品4氨糖软骨素透明质酸胶囊。采用试剂盒Universal Genomic DNA Extraction Kit TaKaRa，Ver. 3.0 提取其中的 DNA，然后进行 PCR。PCR 条件 见下： 扩增引物序列：crustaceanl F5'-TCTAAGCTGCGTACATATCG-3'，crustaceanl R5'-ATTATCACACTATTTCCTAC -3'，扩增片段长度为 140bp;crustacean2 F5' -CGCTAATCCAACAAGACAT -3'，crustacean2 R5' -CCATTCTGAACAGACATCA -3'，扩增片段 长度为150bp。 PCR反应采用25 μ L体系，按以下组分配制PCR反应液：10XPCR缓冲液 2 41^，1〇4111〇1/1的正向和反向引物各141^(1犯13(10臟〇1/1)2 41^丁&9〇嫩聚合酶（51]/ μ UO. 2 μ L，模板 DNA (含 50± IOngDNAM μ L，加 ClH2O 补足 25 μ L。PCR 反应条件如下： 94°C 3min，94°C lmin，66°C lmin，72°C lmin，35 个循环；72°C 7min 结束反应。4°C保存反应 产物，产物采用2%琼脂糖凝胶电泳进行观察。
[0016] 结果见下表
该结果提示，样品1、样品2、样品4中的氨糖均来源于甲壳类提取，对易过敏人群是不 安全的；样品3的氨糖未见扩增条带，可以安全使用。
【主权项】
1. 一种利用PCR技术对氨糖产品进行检测的方法，可以根据结果判断氨糖中是否含有 甲壳类致敏源，具体特征为PCR引物如下所示： crustacean I F5> -TCTAAGCTGCGTA CA TA TCG- 3>，crustacean1 R5'-ATTATCACACTAITTCCTAC-3'，扩增片段长度为 140bp ;crustacean2 F5'-CGCTAATCCAA CAAGACAT-3'，crustacean2 R5'-CCAITCTGAACAGACATCA-3'，扩增片段长度为 150bp〇2. 如权利要求1所述的方法，其特征为PCR条件如下：采用25 y L体系，按以下组分配 制PCR反应液=IOXPCR缓冲液2 yL，IOy mol/L的正向和反向引物各I yL，dNTP( IOmmol/ U2yL，Taq DNA聚合酶（5U/yU〇.2yL，丰莫板 DNA (含 50±10ngDNA) lyL，加 dH20 补足 25 y L ; 94°C 3min，94。。Imin，66。。Imin，72。。Imin，35 个循环；72 cC 7min 结束反应；4cC 保 存反应产物，产物采用2%琼脂糖凝胶电泳进行观察。
【专利摘要】本发明提供了一种利用PCR技术对氨糖产品进行检测的方法，能够快速、方便、准确的获知氨糖及其产品中是否含有甲壳类致敏原物质。样品抽提DNA后，利用本发明提供的PCR引物及条件进行扩增，琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。结果阳性提示含有甲壳类致敏源，阴性表示不含。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105018627
【申请号】CN201510482785
【发明人】史劲松, 耿燕, 龚劲松, 钱建瑛
【申请人】江南大学
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年8月10日