一种基于短序列高通量测序检测肉制品材料来源的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种基于短序列高通量测序检测肉制 品材料来源的方法。
【背景技术】
[0002] 随着经济的发展和人民生活水平的提高，肉类和肉制品的消费发展极为迅猛，由 于不同品种肉类的价值差异巨大，错误标签和以次充好的现象越来越多。确定产品所用的 肉类、进行产品标签信息的验证，能够起到保护消费者权益、打击造假和错误标签，保障进 出口产品质量的作用。而确定产品所用肉类必须要有可靠而准确的肉类物种鉴别方法。
[0003] 肉类的物种鉴定，主要有形态学方法和分子生物学方法。传统的形态学鉴定方法 是在演化的背景下依据形态和结构、生理和生化特征、行为习性表现以及少量的化石资料 来构建生物物种之间的关系。传统的形态学鉴定方法只适用于完整形态的肉的样品，一旦 进行了加工，如鱼肉片、肉糜等，那些用于鉴定的特征就可能被破坏，形态学鉴定就会变得 困难，也会导致结果不准确。
[0004] 但无论如何加工，该动物的DNA始终存在和不可改变，因此采用DNA信息对肉制品 原料来源进行鉴定，是一个不错的选择。2003年，加拿大动物学家Paul Hebert等提出线 粒体细胞色素 C氧化酶亚基（COI)基因序列中碱基序列的差异能很好地区分所有的研究物 种。该种基于DNA信息鉴定区分物种的方法，具有较高的准确性。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的在于提供一种借助分子生物学手段，对肉制品进行DNA信息采 集后，基于短序列高通量测序的方法，以待测肉制品的COI序列信息对肉制品原料来源进 行检测鉴定的方法。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明的实施方式提供了一种基于短序列高通量测序检测 肉制品材料来源的方法，包含下述步骤：
[0007] (1)提取待测肉制品的基因组DNA ;
[0008] (2)设计并合成COI通用引物序列，其中，正向引物如SEQ ID NO: 1所示，反向引物 如 SEQ ID NO:2 所示：
[0009] SEQ ID N0:1 :5, -GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC-3,；
[0010] SEQ ID N0:2 :5, -TANACYTCNGGRTGNCCRAARAAYCA-3,；
[0011] 其中，W 代表 A/T、Y 代表 C/T、N 代表 A/G/C/T、R 代表 A/G。
[0012] (3)采用步骤⑵中所述的正向引物和反向引物，以步骤⑴中所提取的基因组 DNA为模板进行PCR扩增，然后对PCR产物进行纯化；
[0013] (4)对步骤（3)中纯化后PCR产物进行定量，并等量混样，构建标准文库，然后进行 高通量测序；
[0014] (5)根据步骤（4)中测序的结果，得到待测肉制品的COI序列信息，由此得出待测 肉制品的材料来源。
[0015] 本发明的实施方式采用短序列高通量测序的方法，对待测肉制品的DNA信息进行 采集，并通过COI本地数据库，对样品材料来源及比例进行检测。在以所提取的待测肉制品 基因组DNA为模板进行PCR扩增反应时，本发明在对COI保守序列进行充分分析后，选取保 守序列设计引物，并在这些引物对中挑选适合Illumia Miseq测序平台读长的引物对，最终 确定SEQ ID NO: 1所示的正向引物和SEQ ID NO: 2所示的反向引物。上述引物是适用于多 种脊椎动物和无脊椎动物的COI广谱通用引物，由于一些深加工的肉制品中材料来源多样 化，因此本发明所设计的广谱通用引物确保了后续扩增的效率及鉴定的准确性。在通过短 序列高通量测序得到待测肉制品基因组DNA的COI序列信息后，对得到的COI序列信息在 数据库中进行比对，进而得到物种信息。利用本发明的实施方式所提供的鉴定方法，可对各 种肉制品的材料组成和来源进行鉴定，由于COI基因序列中碱基序列的差异能很好地区分 物种，因此利用该方法对肉制品材料来源进行检测鉴定具有较高的准确性。
[0016] 优选地，本发明的实施方式所提供的基于短序列高通量测序检测肉制品材料来源 的方法，分别在SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2所示序列的5'端连接7碱基条形码，作为 正向引物和反向引物。本发明的实施方式为基于短序列高通量测序技术对肉制品材料来 源的检测鉴定方法，而高通量测序平台一个run的数据量很大，比如MiSeq Reagent Kit v3, 600-cycles单个run可以产生25M reads，而单个样品测序1000~30000条reads足 够分析，所以一般情况下需要几百甚至上千个样品混合后上机。为了能够很好地区分样品， 我们设计了 7碱基的条形码（barcode)加在通用引物前面，得到条形码通用引物，用于对基 因组DNA的PCR扩增，所述7碱基条形码的序列可以为ACACAGT或CAGAGTC。
[0017] 优选地，本发明的实施方式所提供的基于短序列高通量测序检测肉制品材料来源 的方法，所述步骤（3)中进行PCR扩增的反应体系组成为：基因组DNA模板2yl、5U/ul的 Q5 聚合酶 0.25 μ l、Q5Reaction Buffer (5X)、Q5GC high Enhancer (5Χ)、2· 5 μΜ dNTP 2 μ 1、10 μ M的正向引物I μ 1、10 μ M的反向引物I μ 1，加 ddH20至25 μ 1。该PCR扩增的反 应程序为：98°C预变性30s，然后以98°C变性30s、52°C退火30s、72°C延伸30s为一个循环， 进行27个循环，最后72°C延伸5min，4°C至无穷。本发明的实施方式在针对待测肉制品的 基因组DNA进行PCR扩增时，在扩增体系的组成和在扩增反应的反应程序上，都进行了实验 条件的优化，所采用的均为最适实验条件。
[0018] 优选地，本发明的实施方式所提供的基于短序列高通量测序检测肉制品材料来源 的方法，所述步骤（3)中采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化。
[0019] 优选地，本发明的实施方式中所提供的基于短序列高通量测序检测肉制品材料来 源的方法，所述步骤（4)中采用美国Biotek FLX800荧光分析仪进行定量。
[0020] 优选地，本发明的实施方式中所提供的基于短序列高通量测序检测肉制品材料来 源的方法，所述步骤（4)中采用Illumina文库构建试剂盒进行标准文库的构建。
[0021] 优选地，本发明的实施方式所提供的基于短序列高通量测序检测肉制品材料来 源的方法，其特征在于，所述步骤（4)中采用Illumina MiSeq测序平台进行高通量测序。 MiSeq测序平台具有读长较长、数据产出量高的特点，因此较适合用于本发明的实施方式 中。
[0022] 优选地，本发明的实施方式所提供的基于短序列高通量测序检测肉制品材料来源 的方法，述步骤（4)中根据待测肉制品的COI序列信息得出待测肉制品的材料来源的方法 是：将待测肉制品的COI序列信息，与已知物种的COI基因序列进行比对，从而得出待测肉 制品的材料来源。
【附图说明】
[0023] 图1是实施例1中提取得到的待测肉制品基因组DNA的电泳检测图；
[0024] 图2是实施例1中待测肉制品基因组DNA的PCR扩增产物的电泳检测图。
【具体实施方式】
[0025] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实 施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中， 为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基 于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方 案。
[0026] 实施例1罐头肉制品的材料来源鉴定
[0027] 1、取肉制品罐头，对罐头内的肉制品进行DNA提取，提取时采用美国Axygen生物 科技有限公司的DNA提取试剂盒进行，提取操作步骤为：
[0028] 1)取20mg肉制品，移入冰水浴预冷的研钵中，快速、用力研磨成匀浆。
[0029] 2)加入 350 μ I Buffer PBS 和 0· 9 μ I RNase A 后温和地研磨 30s。
[0030] 3)收集350 μ 1研磨好的组织匀浆并转入2ml离心管。如匀浆体积不足350 μ 1， 补充PBS至350 μ 1。
[0031] 4)加入150 μ I Buffer C-L和20 μ 1蛋白酶Κ。立即漩涡振荡Imin混合均匀。短 暂离心后，将离心管置56°C水浴IOmin。（不要将蛋白酶K直接加到Buffer C-L中）。
[0032] 5)加入 350 μ I Buffer P-D，漩涡振荡 30s 混合均匀，12, OOOXg 离心 lOmin。
[0033] 6)将DNA制备管置于2ml离心管中，将步骤5中的混合液移至制备管中， 12, OOO Xg 离心 Imin0
[0034] 7)弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，加入500 μ I Buf fer Wl， 12, OOO Xg 离心 Imin0
[0035] 8)弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，加入700 μ I Buffer W2， 12, OOOXg离心lmin，以同样的方法，用700 μ I Buffer W2再洗涤一次。
[0036] 9)弃滤液，将制备管置回原来的2ml离心管中，12, OOOXg离心lmin。
[0037] 10)将DNA制备管置于另一洁净的I. 5ml离心管中，在制备管膜中央加100-200 μ 1 Eluent或去离子水，室温静置lmin，12, OOO X g离心Imin洗脱DNA。
[0038] 对上述提取得到的基因组DNA做电泳检测，电泳结果如附图1所示。
[0039] 2、设计并合成广谱通用引物序列（SEQ ID N0:3所示的正向引物和SEQ ID N0:4 所示的反向引物）如下：
[0040] SEQ ID N0:3 :5' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3' ；
[0041] SEQ ID N0:4 :5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'。
[0042] 3、采用上述的正向引物和反向引物，以所提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩 增，PCR扩增反应体系的组成为：
[0043] DNA 模板 2 μ 1、Q5Polymerase (5U/ul) 0· 25 μ 1、Q5Reaction Buffer (5 X)、Q5GC high Enhancer(5X)、2.5yM dNTP 2μ1、10μΜ 的上、下游引物各 ΙμL、加 ddH20 至 25μ1〇
[0044] PCR扩增的条件为：98°C预变性30s，然后98°C变性30s、52°C退火30s、72°C延伸 30s，共27个循环，最后72°C延伸5min, 4°C至无穷。
[0045] PCR产物采用美国AxyPrep生物科技有限公司的DNA胶回收试剂盒纯化，PCR扩增 产物的电泳图如附图2所示。
[0046] 4、使用美国Biotek FLX800荧光分析仪进行定量，并等量混样，用illumina TruSeq DNA PCR-Free LT Sample Preparation Kit进行标准文库构建，并在miseq平台上 机测序。
[0047] 由高通量测序结果可得到待测肉制品的以下COI序列（SEQ ID NO:5)信息：
[0048] GGCCGGTATAGTGGGCACTGCCCTCAGACTCTTAATTCGAGCTGAACTAGGCCAACCAGGTAGATTAAT TGGAAACGACCAAATTTATAATGTGATCGTCACAGCCCATGCATTTGTCATAATTTTCTTCATAGTGATACCGATCA TGATCGGGGGGTTTGGGAATTGACTACTGCCCCTAATGTTAGGAGCCCCAGACATAGCATTCCCCCGAATGAATAAC ATAAGCTTCTGGCTTTTACCCCCATCCCTAACTCTTCTGCTATCAAGGGGGTTAGTTGAAAGAGGTGTTGGGACAGG ATGAACTGTATATCCCCCCCTCTCTGCAGGAATTGCCCACGCAGGAGCCTCAGTAGACCTTGGAATCTTTTCTCTAC ACCTAGCAGGTGTATCATC