专利名称：环介导等温扩增技术LAMP检测霍乱弧菌mdh基因及其检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术应用领域，涉及一种基于环介导等温扩增技术 (loop-mediated isothermal amplification LAMP)的食源性病原体快速检测方法。
背景技术：
霍乱弧菌的检测一般采用荧光PCR基因诊断技术，但远远不能满足霍乱弧菌快速 诊断的要求。国内常用的方法为常规PCR检测，但传统PCR检测技术易出现假阳性，人为 因素大，不能达到快速准确查清细菌性食源性疾病病因的目的。基于环介导等温扩增技术 (LAMP)的检测试剂盒检测霍乱弧菌的优点是快速、特异性强、灵敏度高且成本低。不需要长 时间的温度循环，不需要PCR等昂贵的仪器，不需要繁琐的电泳紫外观察等过程。
发明内容
本发明的目的是提供一种霍乱弧菌快速检测试剂盒及其检测方法。本发明通过计 算机软件分析霍乱弧菌保守和特异性基因序列，选择霍乱弧菌的管家基因mdh gene为靶基 因，设计出四条引物与靶基因的六个区域完全匹配。mdh gene GenBank登陆号AF 343303， 所述引物与所述靶基因的95位 285位的核酸序列的一部分或其互补链互补。本发明通过 提供一种对霍乱弧菌特定基因片段具有特异性的引物组，及其用包含有上述引物组的试剂 盒检测标本中是否存在霍乱弧菌特定基因片段，进而确定标本中是否存在霍乱弧菌。本发 明的优点是快速、特异性强、灵敏度高且成本低。本发明涉及的霍乱弧菌快速检测试剂盒， 其中的试剂包括如下⑴ ⑶(1)环介导等温扩增反应液含有lOXThermopol 反应缓冲液、300 500iiMdNTP、6 10mM 硫酸镁。1. 2 1. 6iiM上游内引物、1. 2 1. 6iiM下游内引物、0. 2 0. 3iiM上游外引物、0. 2 ~ 0. 3 u M 下游外引物和0. 2 0. 6M甜菜碱；上游内引物为5-GCTTTCACAATGCCAGCGTTCATTTTGTTTCTGCGGGTGTTGCA-3、下游内引物为5-TTGCTGTGGTGTGTCCGAAGGTTTTGGGACCGTTGTGTTCACTG-3、上游外引物为GGTGCGGATGTGGTTCTG；
下游外引物为AGCACTTCGGCTGCGATA(2) Bst DNA 聚合酶:8U/u L ；(3)显色剂为10%的荧光染料SYBR GREEN I。上面所述环介导等温扩增(LAMP)反应液每管共有22 y L，其最佳组成为2. L lOXThermopol反应缓冲液、lyL 10mmol/LdNTP(四种脱氧核糖核酸的混合物)、2 y L 20pmol/ii L 上游内引物(FIP)、2iiL 20pmol/y L 下游内引物(BIP) ,1 U L 5pmol/iiL 上游外引物(F3)、liiL 5pmol/ii L 下游外引物(B3)、8yL 25mmol/LMgS04,2 u L 5mol/L 甜菜碱 和 2. 5ii LddH20。使用上述试剂盒检测霍乱弧菌的方法，依次包括下列步骤(1) (3)(1)待检样品或细菌DNA的提取提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD260/OD280在1. 6 2. 0范围内，浓度在 10 100ng/ii L范围内。(2)进行霍乱弧菌的环介导等温扩增反应A.在装有22 ii L LAMP反应液的反应管中加入2 u L待检模板DNA，于恒温95°C放 置3 5min，立即置于冰上1 3min ；B.然后在反应管中加入liiL Bst DNA聚合酶，并于恒温60 65°C扩增反应45 90min ；C.将温度调到80 95°C中止反应，3 5min后取出待检。(3)显色检测在上述待检的每个反应管中加入1 P L显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液 颜色变为绿色，说明待检样品含有或为霍乱弧菌。
具体实施例方式下列实施例进一步说明本发明，但不应当作对本发明的限制。实施例1按下列配方制作霍乱弧菌的环介导等温扩增试剂盒(1) LAMP 反应液2. 5u L 10XThermopol反应缓冲液、1 U L 10mmol/L dNTP(四种脱氧核糖核酸的 混合物)、2111^2(^11101/111^上游内引物(FIP)、2iiL 20pmol/ii L 下游内引物(BIP)、lyL 5pmol/ii L 上游外引物(F3)、liiL 5pmol/y L 下游外引物(B3)、8yL 25mmol/LMgS04,2 u L 5mol/L 甜菜碱和 2. 5 ii L ddH20。其中所述的上游内引物5-GCTTTCACAATGCCAGCGTTCATTTTGTTTCTGCGGGTGTTGCA-3、下游内引物5-TTGCTGTGGTGTGTCCGAAGGTTTTGGGACCGTTGTGTTCACTG-3上游外引物5-GGTGCGGATGTGGTTCTG-3、下游外引物5-AGCACTTCGGCTGCGATA-3其中混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP dATP dGTP dCTP =1:1:1:1。(2) BStDNA 聚合酶8U/ ii L ；(3)显色剂为10%的荧光染料SYBRGREEN I。按照以下(1) (3)程序进行检测(1)样品DNA的提取检测霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，菌种为标准菌株M045。使用PE公司液体工作 站提取样品DNA，DNA OD260/OD280能够达到1. 8，浓度达到20ng/y L
(2)进行菌样的环介导等温扩增反应A.在装有22 ii L LAMP反应液的反应管中加入2 u L待检模板DNA，于，95°C放置 5min，立即置于冰上lmin ；B.在上述反应管中加入1 P L Bst DNA聚合酶，并于恒温水浴上65°C扩增反应1 小时；C.将水浴调到80°C中止反应，3min后取出待检；(3)显色检测在上述待检的每个反应管中加入1 P L显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液 颜色变为绿色，说明待检样品为霍乱弧菌。实施例2按下列配方制作霍乱弧菌的环介导等温扩增试剂盒(1) LAMP 反应液2. 5u L lOXThermopol 反应缓冲液、liiL 10mmol/L dNTP(四种脱氧核糖核酸 的混合物)、2 y L20pmol/u L上游内引物(FIP)、2 u L20pmol/u L下游内引物(BIP) UuL 5pmol/ii L 上游外引物(F3)、liiL 5pmol/y L 下游外引物(B3)、8 y L25讓ol/LMgS04、2 y L 5mol/L 甜菜碱和 2. 5 ii L ddH20。其中所述的上游内引物、下游内引物、上游外引物、下游外引物同上。上述混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比同上。(2) BStDNA 聚合酶8U/ ii L ；(3)显色剂为10%的荧光染料SYBRGREEN I。按照以下(1) (3)程序进行检测(1)样品DNA的提取检测霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，菌种为标准菌株M045。使用水煮法提取样品 DNA，DNAOD260/OD280 能够达到 1. 8，浓度达到 20ng/ii L。(2)进行菌样的环介导等温扩增反应A.在装有22 ii L LAMP反应液的反应管中加入2 u L待检模板DNA，于，95°C放置 5min，立即置于冰上lmin ；B.在上述反应管中加入1 P L BstDNA聚合酶，并于恒温水浴上65°C扩增反应1小 时；C.将水浴调到80°C中止反应，3min后取出待检；(3)显色检测在上述待检的每个反应管中加入1 P L显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液 颜色变为绿色，说明待检样品为霍乱弧菌。核苷酸序列表<110>深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心<120>环介导等温扩增技术LAMP检测霍乱弧菌mdh基因及其检测试剂盒<160>4<210>1
<211>44
5
<212>DNA<213>人工序列<221>prim_bind<222>(1)... (44)<400>1GCTTTCACAATGCCAGCGTTCATTTTGTTTCTGCGGGTGTTGCA 44<210>2<211>44<212>DNA<213>人工序列<221>prim_bind<222>(1)... (44)<400>2TTGCTGTGGTGTGTCCGAAGGTTTTGGGACCGTTGTGTTCACTG 44<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<221>prim_bind<222>(1)... (18)<400>3GGTGCGGATGTGGTTCTG 18<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<221>prim_bind<222>(1)... (18)<400>4AGCACTTCGGCTGCG ATA 18
权利要求
一种霍乱弧菌快速检测试剂盒，其特征在于其中的试剂包括下列(1)～(3)(1)环介导等温扩增反应液包括10×Thermopol反应缓冲液、300～500μM dNTP、6～10mM硫酸镁(MgSO4)、1.2～1.6μM上游引内物(FIP)、1.2～1.6μM下游内引物(BIP)、0.2～0.3μM上游外引物(F3)、0.2～0.3μM下游外引物(B3)和0.2～0.6M甜菜碱；其中10×Thermopol反应缓冲液含有200mM pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷 盐酸(Tris HCL)、100mM氯化钾(KCL)、100mM硫酸铵((NH4)2SO4)、20mM硫酸镁MgSO4和1％曲拉通X 100(TritonX 100)；其中上游内引物5 GCTTTCACAATGCCAGCGTTCATTTTGTTTCTGCGGGTGTTGCA 3、下游内引物5 TTGCTGTGGTGTGTCCGAAGGTTTTGGGACCGTTGTGTTCACTG 3、上游外引物5 GGTGCGGATGTGGTTCTG 3、下游外引物5 AGCACTTCGGCTGCGATA 3、(2)BstDNA聚合酶8U/μL；(3)显色剂为10％的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
2.根据权利要求1中所述的霍乱弧菌快速检测试剂盒，其特征是上述的dNTP内的四种 脱氧核糖核酸的质量比为dUTP dATP dGTP dCTP = 1 1 1 1。
3.使用上述试剂盒检测霍乱弧菌的方法，其特征是依次包括下列步骤(1) (3)(1)待检样品或细菌DNA的提取提取待检样品核酸，其中提取的样品DNAOD260/OD280 在1.6 2. 0范围内，浓度在10 100ng/ y L范围内；(2)进行霍乱弧菌的环介导等温扩增反应:A.在装有22yLLAMP反应液的反应管中 力口入2 ii L待检样品模板DNA，于恒温95°C放置3 5min，立即置于冰上1 3min ；B.然后 在反应管中加入1 P L BStDNA聚合酶，并于恒温65°C扩增反应45 90min ；C.将温度调到 80°C中止反应，3 5min后取出待检；(3)显色检测在待检的上述每个反应管中加入1PL显色剂，直接用肉眼观察颜色变 化，反应液颜色变为绿色，说明待检样品含有或为霍乱弧菌。
全文摘要
本发明属于生物技术应用领域，用于测定微生物，涉及一种基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术的霍乱弧菌快速检测技术。本发明通过计算机软件分析霍乱弧菌保守和特异性基因序列，设计出四条引物完全与识别的靶序列中六个结合区匹配，该方法利用一种链置换DNA聚合酶-Bst(Bacillus stearothermophilus)DNA polymerase在恒温(65℃)的条件下反应1小时即可完成核酸扩增反应，通过荧光染色直接目测比色就可以得到清晰的反应结果，进而确定标本中是否存在霍乱弧菌。该试剂盒内有环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、显色剂；反应液含有反应缓冲液、dNTP、硫酸镁、上游内引物、下游内引物、上游外引物、下游外引物和甜菜碱；检测霍乱弧菌的方法包括细菌DNA的提取、霍乱弧菌的环介导等温扩增、显色检测。其特点是特异性、敏感性高、检测时间短和检测成本比普通PCR低。
文档编号G01N21/78GK101892293SQ20091010746
公开日2010年11月24日 申请日期2009年5月22日 优先权日2009年5月22日
发明者万志刚, 刘慧玲, 匡燕云, 叶卫翔, 吕敬章, 宋志强, 朱海, 洪小柳, 范放, 赵芳, 马淑棉, 黄李华 申请人:深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心