人微小miR-210-3p干扰片段的构建方法及其应用与流程

本发明属于生物技术及基因工程领域，具体涉及一种抑制黑色素瘤细胞增殖的人微小mir-210-3p(hsa-mir-210-3p)的干扰片段的构建方法及其应用。
背景技术：
：恶性黑色素瘤死亡率高，放化疗不敏感，晚期患者5年生存率低于5％。我国黑色素瘤发病率及死亡率逐年上升，且发病年龄呈年轻化趋势。尽管分子靶向治疗药物的出现为黑色素瘤临床治疗带来突破性进展，但令人遗憾的是，ctla-4单抗、pd-1单抗、braf抑制剂和mek抑制剂等多种靶向治疗药物均未在国内上市，且价格高昂，耐药率高。因此，寻找黑色素瘤新的治疗靶点尤为重要。微小rna(microrna，简称mirna)是一类长约22个核苷酸的非编码小分子rna，由约70～90个碱基大小的具发夹结构的单链rna前体(pre-mirna)经dicer酶加工后生成。其通过与靶mrna分子3`非编码区域(3’utr)完全或不完全互补配对，降解mrna或抑制其翻译，在个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动中发挥重要作用。mirna具有高组织特异性、高敏感性，不易降解，易于检测等特性，是理想的分子治疗靶标。microrna-210-3p(mir-210-3p)是缺氧敏感的mirna，参与细胞周期进程的改变、能量产生不足、细胞凋亡、血管生成等进程调控。然而，其在黑色素瘤中的作用尚不明确，可能是黑色素瘤治疗的潜在靶标，为了验证mir-210-3p在黑色素瘤细胞中的功能，迫切需要利用基因工程技术构建mir-210-3p干扰片段，并验证其在黑色素瘤细胞增殖中的作用。技术实现要素：本发明的目的是，提出人微小mir-210-3p(hsa-mir-210-3p)的干扰片段的构建方法及其在黑色素瘤细胞增殖方面的应用。其中所述的mir-210-3p全称为：人微小核糖核酸-210-3`端(hsa-mir-210-3p)。本发明的目的通过以下技术方案实现：一、可特异性抑制hsa-mir-210-3p表达的核苷酸片段的构建方法；s1，设计与成熟hsa-mir-210-3p互补的rna单链序列(hsa-mir-210-3p干扰序列)引物，化学合成该引物。其中，利用mirbase(http://www.mirbase.org/)数据库，获得成熟hsa-mir-210-3p的核苷酸序列(hsa-mir-210-3pmimat0000267)。s2，设计可特异性干扰hsa-mir-210-3p的核苷酸序列，并合成其编码基因序列。s3，用pcr扩增及化学反应的方法，利用“模板序列”合成hsa-mir-210-3p的干扰序列；二、采用如上构建方法构建的hsa-mir-210-3p干扰片段，其特征在于：可与成熟hsa-mir-210-3p互补配对，形成双链结构，进而抑制hsa-mir-210-3p的功能。说明：利用本方法合成的干扰片段，为转录后抑制mirna功能，不能通过pcr扩增的方法检测，其干扰效应及功能需通过以下第三部分方案实现。三、研究人微小mir-210-3p的干扰片段在抑制黑色素瘤细胞增殖方面的应用，包括如下步骤。s4，利用石蜡组织mirna提取试剂盒，分别提取恶性黑色素瘤组织及良性色素痣组织的mirna。分装，-80℃冰箱保存。s5，mirna反转录为cdna：按下表组份配制rt-pcr反应液(冰上进行)，反应条件如下：37℃15min(反转录)；85℃5sec(反转录酶的失活反应)；4℃保存。s6，mirnareal-timepcr反应：室温融化2╳mircutemirnapremix。同时，准备好所需正反向引物。将试剂置于冰上，按下表所述配置反应体系，反应条件如下：1╳循环，94℃2min(起始模板变性)；35-45╳循环：94℃20sec。s7，分别合成hsa-mir-210-3p上下游引物，利用mirnareal-timepcr试剂盒，检测上述恶性黑色素瘤组织及良性色素痣组织中mir-210-3p的表达情况。(以保守序列u6作为内对照)mir-210-3p引物序列：正向引物：tcagtctgtgcgtgtgacagc反向引物：gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacatctgc内对照u6引物序列：正向引物：ctcgcttcggcagcaca反向引物：aacgcttcacgaatttgcgt反应体系：室温融化2╳mircutemirnapremix。同时，准备好所需正反向引物。将试剂置于冰上，配置反应体系：反应条件如下：1╳循环，94℃2min(起始模板变性)；35-45╳循环：94℃20sec(pcr循环中模板变性)，60℃34sec(退火延伸)；4℃，保存。mirnareal-timepcr结果的计算：研究采用2-△△ct相对定量法来计算hsa-mir-210-3p在各黑色素瘤组织细胞及良性色素痣组织细胞中的表达水平，以u6为内源性对照。△ct＝各黑色素瘤组织细胞中hsa-mir-210-3p的ct值—对应样品u6的ct值；△△ct＝(各黑色素瘤组织细胞细胞中hsa-mir-210-3p的ct值-对应样品u6的ct值)—(良性色素痣对照细胞中hsa-mir-210-3p的ct值-对应样品u6的ct值)；而后，以relativeexpression(fold-change)＝2-△△ct表示各黑色素瘤组织细胞细胞中hsa-mir-210-3p表达水平同良性对照组之间的差异。s8，利用细胞mirna提试剂盒分别提取多株黑色素瘤细胞(a2058、g316、hs852.t、hs895.t)中mirna。(1)保证细胞生长状态，待细胞融合度约80％-90％时，直接在培养板中加入裂解液充分裂解细胞，提取mirna；(2)mirna3`末端加poly处理：在冰上预冷的rnasefree的反应管中，加入以下试剂至总体积20ul(最后加入e.colipoly(a)polymerase)。按下表组份配制反应液(冰上进行)：轻轻混匀上述反应液，短暂离心后在37℃反应60min，产物可直接进入下游实验，也可短暂放于-20℃保存，如长期保存则存于-80℃。(3)poly(a)修饰的mirna逆转录反应：按下表组份配制反应液(冰上进行)：轻轻混匀上述反应液，短暂离心后在37℃反应60min，产物可直接进入下游实荧光定量检测，也可存于-20℃保存。s9，利用mirnareal-timepcr试剂盒，检测上述恶性黑色素瘤细胞中mir-210-3p的表达情况(同前述)。s10、取对数生长的恶性黑色素瘤细胞a2058，加入稀释后的前述人微小核糖核酸210-3p干扰片段(hsa-mir-210-3p-inhibitor)，37℃的co2培养箱中培养72h。s11、细胞增殖试验检测利用mir-210-3p干扰片段(hsa-mir-210-3p-inhibitor)抑制mir210-3p表达后细胞增殖能力：本发明的有益效果如下：1.本发明公开了一种人微小mir-210-3p(hsa-mir-210-3p)的干扰片段的构建方法；2.本发明构建的干扰片段(rna单链)可批量扩增，满足hsa-mir-210-3p相关的多个分子生物学研究；3.本发明构建的干扰片段具有抑制人皮肤黑色素瘤细胞增殖的功能附图说明如下具体实施方式将结合上述附图进一步说明本发明。图1为云南省肿瘤医院肿瘤人黑色素瘤组织中及良性色素痣组织样本mir210-3p表达情况：如图所示：mir-210-3p在人黑色素瘤组织中较良性色素痣显著高表达。图2为ncbi基因表达数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geoprofiles/)中，mir-210-3p在人黑色素瘤组织中及良性色素痣中的表达情况(gds1989/230710_at/mir210-3phg)：如图所示：mir-210-3p在人黑色素瘤组织中较良性色素痣显著高表达。图3为在黑色素瘤细胞a2058利用hsa-mir-210-3p干扰片段抑制mir-210-3p表达后，mts试验检测细胞增殖能力，结果显示：在黑色素瘤细胞系a2058抑制mir-210-3p后，细胞增殖能力较未处理组(nt)、阴性对照组(nc)及无关序列组(mock)增殖能力显著下降。图4为在黑色素瘤细胞g361中，利用hsa-mir-210-3p干扰片段抑制mir-210-3p表达后，mts试验检测细胞增殖能力，结果显示：在黑色素瘤细胞系g361中，抑制mir-210-3p后，细胞增殖能力较未处理组(nt)、阴性对照组(nc)及无关序列组(mock)增殖能力显著下降。图5为流式细胞周期检测，在黑色素瘤细胞a2058中，利用hsa-mir-210-3p干扰片段抑制mir-210-3p表达后，a2058细胞发生细胞周期g2/m期阻滞。具体实施方式一种有效抑制黑色素瘤细胞增殖的mir-210-3p干扰核苷酸序列的构建方法，其包括如下步骤：(1)利用mirbase(http://www.mirbase.org/)数据库，获得成熟hsa-mir-210-3p的核苷酸序列(hsa-mir-210-3pmimat0000267)，具体序列如下：66-cugugcgugugacagcggcuga-87(2)利用primerpremier5.0软件设计引物，所设计引物除满足引物设计原则外，其pcr产物应包括全长hsa-mir-210-3p干扰序列。hsa-mir-210-3p干扰序列具体序列如下：ucagccgcugucacacgcacag(4)取处于对数期的恶性黑色素瘤细胞a2058，用trizol裂解法提取总rna。(5)寡脱氧核苷酸退火：将合成好的脱氧核苷酸稀释为1ug/ul，取相应的正义链和反义链各5ul退火形成双链，反应如下：反应体系为：1ug/ul正义寡核苷酸链5μl1ug/ul反义寡核苷酸链5μlddh2o9.5μltotal25μl反应条件：95℃，5分钟，缓慢降至室温。梯度pcr扩增：设计pcr程序。反应结束后，产物进行2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。(6)将300ulpcr产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，电泳后于紫外光下切取目的条带，目的条带为mir-210-3p干扰序列的编码基因，然后用胶回收试剂盒进行胶回收。(7)将胶回收产物用dna纯化试剂盒进行纯化。(8)将纯化后的dna序列为模板，利用pcr扩增及化学合成的方法，合成hsa-mir-210-3p的干扰序列；pcr反应体系：(9)为了验证hsa-mir210-3p干扰片段在皮肤黑色素瘤细胞中的应用，我们检测了hsa-mir-210-3p在黑色素瘤组织及其良性对照组织(良性色素痣)中的表达情况。为了实现此目的，我们收集了云南省肿瘤医院的黑色素瘤组织及良性色素痣组织各5例，并利用实时荧光定量pcr技术(real-timepcr)检测其mir-210-3p的表达情况。如图2所示，我们研究发现，mir-210-3p在人黑色素瘤组织中较良性色素痣显著高表达。(10)为了更充分的说明mir-210-3p在黑色素瘤组织中的表达情况，我们利用生物信息学技术，在ncbi基因表达谱数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geoprofiles/)中分析mir-210-3p在人黑色素瘤组织中和良性色素痣组织中的表达情况，如图3所示：mir-210-3p在人黑色素瘤组织中较良性色素痣显著高表达。(11)为了研究我们构建的mir-210-3p干扰片段对黑色素瘤细胞增殖功能的影响，我们在黑色素瘤细胞a2058和g361中，利用mir-210-3p干扰片段抑制mir-210-3p表达，利用mts试验检测细胞增殖能力。具体步骤如下：1.对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，1500rpm离心5min，弃上清；用1ml完全培养基重悬细胞；2.取20ul混匀的细胞悬液，用200ul台盼蓝稀释，滴在计数板对细胞计数；3.根据细胞生长快慢决定铺板细胞密度(96孔板，约2000细胞/孔，150ul培养基/孔)4.将铺板细胞置37℃，5％co2培养箱培养；5.铺板后第二天观察细胞状态，每天加入30μl/孔mts试剂，置37℃，5％co2培养箱孵育2h；6.在荧光扫描仪上490nm波长处检测甲臜产物量；7.根据扫描所得的od值，进行统计绘图，制作细胞增殖曲线；如图3所示，在黑色素瘤细胞系a2058中，导入mir-210-3p干扰核苷酸片段后，细胞增殖能力较未处理组(nt)、阴性对照组(nc)及无关序列组增殖能力显著下降。同理，如图4所示在黑色素瘤细胞系g361中，导入mir-210-3p干扰片段后，细胞增殖能力较未处理组(nt)、阴性对照组(nc)及无关序列组增殖能力显著下降。(12)在mts证实mir-210-3p干扰片段可抑制黑色素瘤细胞a2058增殖功能的情况下，为了进一步探讨mir-210-3p干扰片段对黑色素瘤细胞周期功能的影响，我们利用流式细胞周期检测导入mir-210-3p干扰片段后的黑色素瘤细胞a2058细胞周期分布情况。具体操作如下：1.待各实验组细胞生长至融合率约为80％时，弃细胞培养上清，pbs洗涤细胞一次，胰酶消化细胞，完全培养基终止，收集细胞于15ml离心管中，每组设3个复孔；2.将15ml离心管1200rpm离心5min，弃去上清；3.4℃预冷的pbs(ph7.2～7.4)洗涤细胞2次,1500rpm离心5min，弃上清液，收集细胞；4.4℃预冷的70％乙醇重悬并固定细胞12h；5.1500rpm离心5min去固定液，pbs洗涤细胞沉淀一次；6.细胞染色液配制：40×pi母液(2mg/ml)：100×rnase母液(10mg/ml)：1×pbs＝25:10:1000；7.细胞染色：根据细胞量，加入一定体积的细胞染色液(1～1.5ml)重悬，使上机时细胞通过率为200～350cell/s；8.300目的筛网过滤于流式上机管中，上机检测；如图5所示：在黑色素瘤细胞系a2058中，导入mir-210-3p干扰片段抑制mir-210-3p后，a2058细胞发生g2/m期阻滞。以上所述实施例，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12