本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种催化活性提高的几丁质脱乙酰基酶突变体及含有该突变体的基因、细胞及其制备方法。
背景技术：
几丁质(chitin)又称甲壳素、甲壳质等，是由n-乙酰-d葡萄糖胺(glcnac)单体通过β-1，4糖苷键链接而成的直链高分子化合物，是仅次于纤维素居世界第二的天然有机化合物。几丁质不溶于水和一般有机溶剂，难以应用。几丁质脱乙酰后形成的壳聚糖，具有良好的生物相容性和生物可降解性，广泛应用于食品、医药、轻工、印染、环保和农业等领域。
几丁质脱乙酰转化为壳聚糖的处理方法分为化学热碱法和生物酶法。化学法不仅污染严重，且反应过程不易控制，产品分子量不稳定。尤为严重的是排放物造成了巨大的环境污染，对周边生态破坏严重。生物酶法反应温和、环境友好，可以制备出高质量的壳聚糖。几丁质脱乙酰基酶(e.c.3.2.1.41)生物酶法制备壳聚糖的主要用酶，可以将几丁质的乙酰基直接脱除，但是对几丁质分子的主链不发生降解，与特定酶结合使用还可以制备具有特定乙酰基位置的产物。
我国对于几丁质脱乙酰基酶的相关研究报道较少，缺少具有自主知识产权的几丁质脱乙酰酶，并且存在产酶活力低、脱乙酰效果差等问题。由于存在这些问题，导致几丁质脱乙酰基酶在工业应用中的成本较高，生物酶法制备壳聚糖难以扩大规模。通过筛选新颖的具有较高催化活性的几丁质脱乙酰基酶产生菌可以缓解上述问题。但是，随着对几丁质脱乙酰酶微生物的筛选，菌株重复筛选率增加，难以筛选获得新颖的催化效率较高的几丁质脱乙酰酶菌株。
酶工程特别是酶的定向进化技术的快速发展，为提高几丁质脱乙酰基酶催化效率注入了生机和活力。通过利用定点突变、定点饱和突变、dna-shuffling等技术可以改善酶的催化特性，改变酶的包括最适催化温度、最适催化ph等条件、并且可以提高酶的催化效率。我国对几丁质脱乙酰基酶的研究主要集中在菌种选育、酶的纯化、表达和酶学性质、发酵工艺的改良方面，催化效率较高的几丁质脱乙酰基酶鲜有报道。
技术实现要素：
针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种催化活性提高的催化活性提高的几丁质脱乙酰基酶突变体并提供确定突变氨基酸的方法、构建所述催化活性提高的几丁质脱乙酰基酶突变体的方法以及应用基因工程菌发酵生产所述催化活性提高的几丁质脱乙酰基酶突变体的方法。本发明将海洋细菌roseivivaxatlanticus几丁质脱乙酰基酶(氨基酸序列(genbank收录号：wp_043845084.1))进行了如下突变：116位天冬酰胺q突变为精氨酸r、179位天冬氨酸突变为甘氨酸、194位组氨酸h突变为酪氨酸y、254位缬氨酸突变为亮氨酸i、282为组氨酸h突变为天冬氨酸。比突变前，突变体酶的比活力是野生型酶的2.63倍。本发明提供的几丁质脱乙酰基酶催化效率更高，更加适合工业化生产需求。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种催化活性提高的几丁质脱乙酰基酶突变体，将海洋细菌roseivivaxatlanticus几丁质脱乙酰基酶氨基酸序列如seqidno.1所示，进行了如下突变：116位天冬酰胺q突变为精氨酸r、179位天冬氨酸d突变为甘氨酸g、194位组氨酸h突变为酪氨酸y、254位缬氨酸v突变为异亮氨酸i、282为组氨酸h突变为天冬氨酸。
优选的是，催化活性提高的几丁质脱乙酰基酶突变体其氨基酸序列如seqidno.2所示，是将海洋细菌roseivivaxatlanticus几丁质脱乙酰基酶氨基酸序列如seqidno.1所示的第116位天冬酰胺q突变为精氨酸r、179位天冬氨酸突变为甘氨酸、194位组氨酸h突变为酪氨酸y、254位缬氨酸突变为亮氨酸i、282为组氨酸h突变为天冬氨酸。
本发明还提供一种编码上述催化活性提高的几丁质脱乙酰基酶突变体的基因，其核苷酸序列如seqidno.3所示。
本发明还提供.一种载体，其含有上述所述的基因。
本发明还提供.一种细胞，其含有上述所述的基因。
本发明还提供一种一种转基因细胞系，其含有上述所述的基因。
本发明还提供一种获得上述所述催化活性提高的几丁质脱乙酰基酶突变体的方法，是通过设计引物对编码几丁质脱乙酰基酶的基因进行定点突变后表达。
优选的是，是以质粒petac-his6-rac为模板设计引物进行突变并将突变后的质粒转化进入e.colidh5α进行扩增，然后以e.colibl21(de3)表达含突变基因的重组质粒。
本发明还提供一种应用基因工程菌发酵生产上述所述催化活性提高的几丁质脱乙酰基酶突变体的方法，是将含有编码突变几丁质脱乙酰基酶的基因的重组菌e.colibl21(de3)(petac-his6-racm)活化培养后接种到含有氨苄青霉素的发酵培养基中，培养至菌液od600达到0.6，加入iptg，诱导发酵。
优选的是，所述发酵培养基中含有100μgml-1氨苄青霉素，培养基组成为胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l。
本发明通过定点突变改造几丁质脱乙酰基酶基因，使所编码的几丁质脱乙酰基酶催化活性增加；突变酶酶的比活力是野生型酶的2.63倍(几丁质脱乙酰基酶酶活单位定义：每小时几丁质脱乙酰酶催化底物产生1μg对硝基苯胺所需要的酶液的体积定义为一个酶活力单位。)酶的其它催化特性基本不变，本发明提供的几丁质脱乙酰基酶更加适合工业化生产需求，满足社会生产的要求。
本发明的有益效果是：提供一种催化活性提高的几丁质脱乙酰基酶突变体及其制备方法，在噬菌体抗体库中筛选并鉴定得到特异性抗mlaa-34的单克隆单链抗体scfv，首次表达纯化出了mlaa-34蛋白，为单抗制备提供了抗原蛋白。利于基因工程的方法，在全人源噬菌体抗体库中淘选并鉴定出抗mlaa-34全人源单抗。获得了特异性结合高表达mlaa-34的肿瘤细胞株的全人源单克隆单链抗体scfv。全人源单克隆单链抗体scfv解决了鼠源抗体的免疫原性问题，单链抗体scfv由抗体可变区的重链和轻链由linker连接而成，分子量小，穿透力强，更利于应用。
具体实施方式
本发明中的重组几丁质脱乙酰基酶纯化方法，按照ni-ntapurificationsystem(美国invitrogen公司nvitrogentmk95001)说明书操作。细胞膜可溶性物直接上ni-nta柱，依次用含不同浓度咪唑(50mmol/l、100mmol/l、150mmol/l、200mmol/l)的洗脱液洗脱，收集洗脱峰，同步收集样品并进行酶活力与蛋白含量的测定。
重组蛋白质含量测定采用改良型lowry法蛋白浓度测定试剂盒(上海生工，c504041-1000)。
本发明要解决的第一个技术问题是，提供一种催化活性提高的几丁质脱乙酰基酶突变体。
所述突变体是以genbank收录号为wp_043845084.1所示的几丁质脱乙酰基酶为基础，将116位天冬酰胺q突变为精氨酸r、179位天冬氨酸d突变为甘氨酸g、194位组氨酸h突变为酪氨酸y、254位缬氨酸v突变为异亮氨酸i、282位组氨酸h突变为天冬氨酸d。
本发明要解决的第二个技术问题是，提供确定突变氨基酸的方法，通过blast对比roseivivaxatlanticus几丁质脱乙酰基酶序列和序列相似度高于80％的几丁质脱乙酰基酶序列，找到不同的氨基酸位点，进一步通过swiss-model模拟roseivivaxatlanticus几丁质脱乙酰基酶的三级结构，发现179位天冬氨酸d、194位组氨酸h、254位缬氨酸v位于接近催化中心的无规卷曲结构中、116位天冬酰胺、q282位组氨酸h较接近催化中心，突变后能够改变催化结构域，并改变底物结合能力和催化效率。
本发明要解决的第三个技术问题是，提供构建所述催化活性提高的几丁质脱乙酰基酶突变体的方法，是通过设计引物对编码几丁质脱乙酰基酶的基因进行定点突变后表达。所述构建方法，根据roseivivaxatlanticus几丁质脱乙酰基酶dna序列(nz_jalz01000017)进行生物合成，构建表达质粒petac-his6-rac，以含有几丁质脱乙酰基酶质粒为模板，设计引物进行突变并将突变后的质粒转化进入e.colidh5α进行扩增，然后以e.colibl21(de3)表达含突变基因的重组质粒，得到活性提高的突变体。
本发明要解决的第四个技术问题是，提供应用基因工程菌发酵生产所述催化活性提高的几丁质脱乙酰基酶突变体的方法，是将含有编码突变几丁质脱乙酰基酶的基因的重组菌e.colibl21(de3)(petac-his6-racm)活化培养后接种到含有100μgml-1氨苄青霉素的发酵培养基中，装液量为30ml/250ml，于37℃，200rmin-1培养至od600为0.6，加入终浓度0.5mmiptg，28℃，诱导发酵24h。所用培养基组成为：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l，ph7.0。
实施例1突变表达质粒的构建及重组大肠杆菌的获得
根据野生型酶基因设计引物，并引入酶切位点，所用引物如下：p1：5’-cggaattcatgaaccgttacccgcgtgac-3’(引入酶切位点ecori)；p2：5’-cccattgttaagccagagcttccagacgc-3’(引入noci酶切位点)。
以合成的dna序列为模板进行pcr，pcr反应体系为：ddh2o(17.5μl)，buffer(2.5μl)，mg2+(2.5μl)，dntp(0.5μl)，p1(0.5μl)，p2(0.5μl)，模板(1μl)，taq酶(0.2μl)。pcr程序：94℃预变性5min，然后94℃30s，54℃40s，72℃70s，循环35次；72℃延伸10min。扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳进行检测后测序。
将上述pcr扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳、纯化，与pmd18-t连接后转化e.colidh5α，从阳性菌落中提取重组质粒pmd18-t-cad。
pmd18-t-rac和表达载体petac双酶切后，1％的琼脂糖凝胶电泳回收酶切片段，将酶切后的胶回收产物混合后16℃连接过夜。
转化dh5a，将重组菌株涂布于含有50ug/ml的卡那霉素固体lb培养基内，37℃倒置培养过夜，随机挑选若干个菌落于含有50ug/ml卡那霉素的液体lb培养基内，37℃摇瓶培养过夜，提取质粒petac-his6-rac，测序验证后转化e.colibl21(de3)。
通过blast对比roseivivaxatlanticus几丁质脱乙酰基酶序列和序列相似度高于80％的几丁质脱乙酰基酶序列，找到不同的氨基酸位点，进一步通过swiss-model模拟roseivivaxatlanticus几丁质脱乙酰基酶的三级结构，发现179位天冬氨酸d、194位组氨酸h、254位缬氨酸v位于接近催化中心的无规卷曲结构中、116位天冬酰胺、q282位组氨酸h较接近催化中心，突变后能够改变催化结构域，并改变底物结合能力和催化效率。
以含有几丁质脱乙酰基酶质粒petac-his6-rac为模板，设计引物进行突变并将突变后的质粒转化进入e.colidh5α进行扩增，然后以e.colibl21(de3)表达含突变基因的重组质粒，得到活性提高的突变体。并将突变后的质粒转化进入e.colidh5α进行扩增，然后以e.colibl21(de3)表达含突变基因的重组质粒，得到活性提高的突变体。
上述所述用于定点突变的引物是：
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116primera：ggcgtgcctcatcgcctcgagctgtt
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282primera：gatccagacgtcgtcgtgggcggccacgtggt
pcr管中加入10mmol/lmgcl22.5μl，10×pcrbuffer5μl，2.5μmol/ldntp4μl，taq(5u/μl)0.25μl，上游引物和下游引物(10μmol/l)各1μl，模板dna1μl，最后加双蒸水至50μl，混合后瞬间离心，置于pcr仪上95℃变性5min，然后94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸10min反应结束。
扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳进行检测后测序。将上述pcr扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳、纯化，并和表达载体petac双酶切后，1％的琼脂糖凝胶电泳回收酶切片段，按基因片段与载体的摩尔比为3混合后16℃连接过夜。转化dh5α，将重组菌株涂布于含有50ug/ml的卡那霉素固体lb培养基内，37℃倒置培养过夜，随机挑选若干个菌落于含有50ug/ml卡那霉素的液体lb培养基内，37℃摇瓶培养过夜，提取质粒petac-his6-racm，测序验证后转化e.colibl21(de3)。
实施例2突变表达载体的转化
所用培养基组成：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l，ph7.0。
将含有编码突变几丁质脱乙酰基酶的基因的重组菌e.colibl21(de3)(petac-his6-cad)活化培养后接种到含有100μgme-1氨苄青霉素的发酵培养基中，装液量为30ml/250ml，于37℃，200rmin-1培养；菌体生长到od600＝0.6，加入终浓度0.5mmiptg，30℃，诱导发酵24h。180r/min诱导表达5h。4℃、10000r/min冷冻离心5min收集菌体。
蒸馏水重悬菌体，以超声波细胞粉碎仪破碎菌体(200w，超3s，停7s，共超声5min)，4℃，10000r/min离心20min，收集上清液作为粗酶液。
按照ni-ntapurificationsystem(美国invitrogen公司nvitrogentmk95001)说明书一步纯化重组酶
几丁质脱乙酰基酶活力检测：比色管中加入35℃预保温的浓度为0.05mol/l的ph8.0的tris-hcl缓冲溶液3ml、浓度为200mg/l的4-硝基乙酰苯胺溶液1ml、几丁质脱乙酰酶液1ml，在35℃下水浴反应15min后沸水浴终止酶促反应，用蒸馏水定容至10ml，混匀，3000r/min离心10min，测定上清液在400nm处的吸光值(a400)。无活性的酶液为空白对照。
和野生型重组酶相比，突变后的比活力剂催化活性提高2.63倍。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
序列表
序列表
<110>江苏澳新生物工程有限公司
<120>一种几丁质脱乙酰基酶突变体及其制备方法
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<213>海洋细菌几丁质脱乙酰基酶(roseivivaxatlanticus)
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