一组天然与非天然的原人参三醇型人参皂苷的合成方法与流程

本发明属于生物技术和植物学技术领域，涉及一组天然与非天然原人参三醇型人参皂苷及其制备方法，具体涉及一种利用糖基转移酶和蔗糖合成酶偶联反应催化原人参三醇(protopanaxatriol，ppt)生成多种天然与非天然人参皂苷的方法及应用。

背景技术：

人参(panaxginsengc.a.mayer)为五加科多年生宿根植物，是我国传统的名贵中草药，具有抗癌、抗肿瘤、抗晒老、提高免疫等多种生理功效，冠有“百草之王”的美誉。

人参皂苷是人参的主要活性物质，是由苷元与糖基连接构成的糖苷类化合物。根据苷元的不同，主要分为原人参二醇型人参皂苷和原人参三醇型人参皂苷。目前已从不同的人参品种中分离鉴定了包括人参皂苷rh1、f1和rg1在内的20余种原人参三醇型人参皂苷单体，这些原人参三醇型人参皂苷均以原人参三醇作为配糖体苷元，糖基(如葡萄糖、木糖、鼠李糖等)通过β糖苷键连接在原人参三醇的c6和c20位羟基上，而原人参三醇的c3位和c12位羟基不被糖基化修饰。

糖基化反应是人参皂苷生物合成途径中最后一步修饰作用，通过糖基化作用将糖基供体(如udp-葡萄糖、udp-木糖等)的糖基连接到原人参三醇的c6和c20位羟基上从而生成包括人参皂苷rh1、f1和rg1等在内的数十种原人参三醇型人参皂苷。鉴于糖基化反应对原人参三醇型人参皂苷结构及生理活性多样性的形成至关重要，因此，通过糖基化作用对原人参三醇的非天然糖基化位点(c3位羟基和c12位羟基)进行糖基化修饰，将为合成多种具有独特生理和药理活性的新型人参皂苷奠定基础。

糖基化可通过化学催化和生物催化两种方式实现，但是化学法存在立体选择性差、副反应多、污染大、产物得率低等限制因素；而糖基转移酶(udp-glycosyltransferase，ugt，ec2.4.1.17)催化的糖基化反具有催化效率高、区域以及立体选择性强、产物纯化简单等特点，在新型人参皂苷的生物合成中具有巨大的应用潜力。目前，已从人参中挖掘获得多个糖基转移酶，这些植物来源的糖基转移酶可专一性催化原人参三醇的c6和c20为羟基糖基化生产人参皂苷rh1、f1和rg1。与植物来源糖基转移酶相比，微生物来源糖基转移酶具有异源表达水平高、可溶性表达好、底物谱广、催化活性高、区域选择性差等特点，从而可以催化原人参三醇不同羟基位点糖基化合成多种天然与非天然原人参三醇型人参皂苷，这些非天然的原人参三醇型人参皂苷可能具有多种新的且更高的生理和药理活性。

技术实现要素：

本发明针对目前所存在的缺陷及不足，提供一种天然与非天然原人参三醇型人参皂苷及其制备方法，通过所述方法，将糖基转移酶与蔗糖合成酶偶联，从而实现以廉价的蔗糖为葡萄糖糖基供体，以原人参三醇为糖基受体，高效催化原人参三醇糖基化生产多种天然与非天然的人参皂苷的方法

本发明目的之一是提供一种人参皂苷，其特征在于，所述人参皂苷具有式i所示结构；

其中：r1、r2和r3代表1个葡萄糖残基或者h原子。

在优选的实施方式中，所述的人参皂苷，其特征在于，所述人参皂苷具有式ii或式iii或式iv所示结构：

本发明目的之二是提供一种制备本发明目的之一所述的任意一种人参皂苷或人参皂苷rh1的方法，其特征在于，糖基转移酶催化原人参三醇(protopanaxatriol，ppt)和尿苷二磷酸葡萄糖反应生成人参皂苷；所述糖基转移酶为糖基转移酶bs-yjic，其氨基酸序列如seqidno.1或与其具有85％同源性，优选95％同源性，更优选99％同源性的氨基酸序列。

本发明目的之三是提供一种糖基转移酶bs-yjic在催化原人参三醇生产本发明目的之一所述的任意一种人参皂苷或人参皂苷rh1中的应用。

本发明目的之四是提供一种制备本发明目的之一所述的任意一种人参皂苷或人参皂苷rh1的催化反应体系，其特征在于，所述催化反应体系包括原人参三醇、蔗糖、蔗糖合成酶、糖基转移酶和尿苷二磷酸。

在优选的实施方式中，所述的催化体系，其特征在于，所述糖基转移酶为糖基转移酶bs-yjic；优选地，所述糖基转移酶bs-yjic的编码基因来源于枯草芽孢杆菌和/或其突变体；优选地，所述糖基转移酶bs-yjic的氨基酸序列如seqidno.1或与其具有85％同源性，优选95％同源性，更优选99％同源性的氨基酸序列。

在更优选的实施方式中，所述的催化体系，其特征在于，所述蔗糖合成酶来源于拟南芥、大豆、亚硝酸单胞菌或嗜酸性喜温硫杆菌中的任意一种或至少两种的组合，优选为拟南芥、大豆或嗜酸性喜温硫杆菌中的任意一种或至少两种的组合；优选地，所述蔗糖合成酶的氨基酸序列如seqidno.2-6中的任意一种或与seqidno.2-6中的任意一种具有85％同源性，优选95％同源性，更优选99％同源性的氨基酸序列。

在更优选的实施方式中，所述的催化体系，其特征在于，所述蔗糖合成酶为来自拟南芥的蔗糖合成酶atsusy，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

在最优选的实施方式中，所述的催化体系，其特征在于，所述糖基转移酶的浓度为1mu/ml-1000mu/ml，蔗糖合成酶的浓度为1mu/ml-1000mu/ml。

在具体实施方式中，所述的催化体系，其特征在于，所述糖基转移酶的浓度为160mu/ml，蔗糖合成酶的浓度为200mu/ml。

本发明目的之五是，糖基转移酶bs-yjic在催化原人参三醇生产目的之一所述任意一种人参皂苷或人参皂苷rh1的用途，所述原人参三醇以及合成的天然与非天然原人参三醇型人参皂苷的结构式如图1所示。

本发明的目的之六是提供一种催化原人参三醇合成目的之一所述任意一种人参皂苷或人参皂苷rh1的合成方法，其特征在于，以原人参三醇为底物，以尿苷二磷酸葡萄糖为糖基供体，利用底物专一性以及区域选择性较差的糖基转移酶为催化剂，催化原人参三醇(protopanaxadiol)的c3位、c6位和c12位羟基糖基化，从而合成目的之一所述天然与非天然的原人参三醇型人参皂苷。所述原人参三醇以及合成的天然与非天然原人参三醇型人参皂苷的结构式如图1所示；所述的天然与非天然原人参三醇型人参皂苷的合成方法，其特征在于，原人参三醇可从人参、西洋参、三七等人参属植物中提取获得、人参皂苷水解获得、微生物工程菌发酵获得或者这些方式组合获得，糖基化反应体系包括，所述原人参三醇为浓度0.1-10mm，所述糖基转移酶为0.1mu-100mu/ml；酶反应的温度为20-60℃，缓冲液ph设定为5-9，反应体系中可以选择无添加金属离子，也可以添加mg²⁺和mn²⁺，反应时间为0.1h-48h；优选的所述原人参三醇浓度为2mm，所述糖基转移酶为5mu/ml；酶反应的温度为35℃，缓冲液ph设定为8.0，反应体系中添加10mm的mgcl2，反应时间为0.5h。

本发明目的之七是提供一种糖基转移酶bs-yjic，该糖基转移酶来自枯草芽孢杆菌bacillussubtilis168，bs-yjic可以催化原人参三醇(protopanaxadiol)的c3位、c6位和c12位羟基糖基化，从而合成目的之一所述天然与非天然的原人参三醇型人参皂苷，所述原人参三醇以及合成的天然与非天然原人参三醇型人参皂苷的结构式如图1所示。糖基转移酶bs-yjic的核酸序列如序列表seqidno1所示，本发明包括序列表seqidno1所示核酸序列总一部分取代、插入或则缺失等全部情况，优选的与seqidno1所示核酸序列的同源性有70％以上、更优选80％以上、进一步优选有90％以上同源性核酸序列；糖基转移酶bs-yjic的氨基酸序列如序列表1所示，本发明包括序列表中序列2的氨基酸中一部分被取代、插入或缺失等全部情况，优选包含具有与序列表中序列2的氨基酸序列有70％以上、更优选有80％以上、进一步优选有90％以上同源性的氨基酸序列。该酶可以通过构建表达载体，转化至若干宿主菌株中进行表达与纯化，所选择的宿主菌株包括大肠杆菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌、谷氨酸棒杆菌等，优选大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌进行表达。

与现有技术相比，本发明利用微生物来源糖基转移酶bs-yjic为催化剂，以原人参三醇为底物，催化原人参三醇(protopanaxadiol)的c3位、c6位和c12位羟基糖基化，从而合成人参皂苷rh1(产物4)以及非天然人参皂苷3-o-β-d-glucopyranosyl-20(s)-protopanaxatriol(产物5)、3-o-β-d-glucopyranosyl-12-o-β-d-glucopyranosyl-20(s)-protopanaxadiol(产物3)、3-o-β-d-glucopyranosyl-6-o-β-d-glucopyranosyl-20(s)-protopanaxatriol(产物2)和3-o-β-d-glucopyranosyl-6-o-β-d-glucopyranosyl-12-o-β-d-glucopyranosyl-20(s)-protopanaxatriol(产物1)。鉴于糖基化是人参皂苷合成途径中最重要的合成步骤，且对人参皂苷药理及结构多样性的形成至关重要，因此利用本发明挖掘的糖基转移酶bs-yjic催化原人参三醇合成的多种天然与非天然原人参三醇型人参皂苷极大的丰富了人参皂苷的种类，这些人参皂苷可能同其它天然人参皂苷一样具有多种独特的药理活性。另外，本发明利用糖基转移酶bs-yjic和蔗糖合成酶作为偶联催化剂，以廉价的蔗糖作为糖基供体，从而可以在体外高效合成1.7g/l人参皂苷rh1(产物4)以及1.5g/l非天然人参皂苷3-o-β-d-glucopyranosyl-20(s)-protopanaxatriol(产物5)、5.8g/l非天然人参皂苷3-o-β-d-glucopyranosyl-12-o-β-d-glucopyranosyl-20(s)-protopanaxadiol(产物3)、0.25g/l的非天然人参皂苷3-o-β-d-glucopyranosyl-6-o-β-d-glucopyranosyl-20(s)-protopanaxatriol(产物2)和0.38g/l非天然人参皂苷3-o-β-d-glucopyranosyl-6-o-β-d-glucopyranosyl-12-o-β-d-glucopyranosyl-20(s)-protopanaxatriol(产物1)，该反应只需12h即可完成，而酵母工程菌发酵7天生成人参皂苷rh1和f1的产量分别仅为93mg/l和42mg/l；本发明可极大的提高所述天然与非天然人参皂苷的生产效率以及产量，有助于降低本发明中所述天然与非天然原人参三醇型人参皂苷的生产成本，从而为所述天然与非天然原人参三醇型人参皂苷的工业化生产奠定基础。

本发明中的相关定义：

天然人参皂苷rh1命名为产物4，具有以下结构式：

非天然人参皂苷3-o-β-d-glucopyranosyl-6-o-β-d-glucopyranosyl-12-o-β-d-glucopyranosyl-20(s)-protopanaxatriol命名为产物1，具有以下结构式：

非天然人参皂苷3-o-β-d-glucopyranosyl-6-o-β-d-glucopyranosyl-20(s)-protopanaxatriol命名为产物2，具有以下结构式：

非天然人参皂苷3-o-β-d-glucopyranosyl-12-o-d-glucopyranosyl-20(s)-protopanaxadiol命名为产物3，具有以下结构式：

非天然人参皂苷3-o-β-d-glucopyranosyl-20(s)-protopanaxatriol命名为产物5，具有以下结构式：

糖基转移酶bs-yjic为氨基酸序列为seqidno：1的酶。

蔗糖合成酶atsusy为氨基酸序列为seqidno：2的酶。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为原人参三醇及其糖基化产物结构式。

图2为糖基转移酶bs-yjic与蔗糖合成酶atsusy偶联催化原人参三醇糖基化过程示意图。

图3为糖基转移酶bs-yjic和蔗糖合成酶的表达与纯化后的sds-page蛋白胶图。

图4为高效液相色谱-质谱联用分析糖基转移酶bs-yjic催化原人参三醇糖基化产物图。

图5为高效液相色谱分析糖基转移酶bs-yjic与蔗糖合成酶atsusy偶联反应催化原人参三醇糖基化产物图。

图6为糖基转移酶bs-yjic与蔗糖合成酶atsusy偶联反应催化原人参三醇合成天然与非天然原人参三醇型人参皂苷的产物积累曲线。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

以下结合实施例进一步详述本发明。

本发明及实施例中提到的百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(w/w，单位g/100g)百分比浓度，质量/体积(w/v，单位g/100ml)百分比浓度，体积/体积(v/v，单位ml/100ml)百分比浓度，和摩尔浓度(mm)。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《molecularcloning：alaboratorymanual》(sambrook，j.，russell，davidw.，molecularcloning：alaboratorymanual，3rdedition，2001，ny，coldspringharbor)。

各实施例中所用相同名称的材料或试剂如无特别说明即为相同的。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为实施本发明时对生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

本发明中所用引物由江苏金唯智生物技术有限公司合成。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

本发明中酶活性测定方法及酶活性单位定义如下：

蔗糖合成酶酶活性测定：在200μl反应体系中含有蔗糖合成酶(10μg)，udp(0.5mm)，蔗糖(300mm)，tris-hcl缓冲液(50mm，ph7.5)，30℃水浴反应0.5h，快速煮沸5min，终止反应，进行高效液相色谱检测果糖的生成。蔗糖合成酶酶活性单位(u)定义为，每微克蔗糖合成酶每分钟催化蔗糖水解所生成的果糖的微摩尔含量。

糖基转移酶酶活性测定：在200μl反应体系中含有原人参三醇(1mm)，尿苷二磷酸葡萄糖(5mm)，tris-hcl缓冲液(50mm，ph7.5)，3μg糖基转移酶bs-yjic，35℃水浴反应0.5h，加入200μl甲醇终止反应，进行高效液相色谱检测原人参三醇的消耗量。糖基转移酶酶活性单位(u)定义为，每微克糖基转移酶每分钟所消耗的原人参三醇的微摩尔含量。

实施例1、糖基转移酶bs-yjic与蔗糖合成酶atsusy的克隆、表达与纯化

糖基转移酶bs-yjic和蔗糖合成酶atsusy在ncbi(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)的基因登入号分别为np_389104和nm_001036838，以枯草芽孢杆菌bacillussubtilis168的基因组dna为模板，利用bs-yjic-f和bs-yjic-r引物对扩增糖基转移酶bs-yjic基因；以拟南芥的cdna为模板，利用at-susy-f和atsusy-r引物对扩增蔗糖合成酶atsusy。所用引物的核苷酸序列如下(下划线部分为限制性内酶位点)：

bs-yjic-f：5′-cgcggatccatgaaaaagtaccatatttcgat-3′(bamhi酶切位点)

bs-yjic-r：5′-cgcgtcgacttactgcgggacagcggatttt-3′(sali酶切位点)

atsusy-f：5′-gcgtcgacaaatggcaaacgctgaacgtatgataa-3′(sali酶切位点)

atsusy-r：5′-ttgcggccgcttatcatacgttcagcgtttgccat-3′(noti酶切位点)

利用dna连接酶将糖基转移酶bs-yjic基因和蔗糖合成酶atsusy基因分别插入到经相同的限制性内切酶处理的pet32a表达载体中，构建重组载体pet32-bs-yjic和pet32-atsusy。然后将重组质粒pet32-bs-yjic和pet32-atsusy转化至大肠杆菌e.colibl21(de3)感受态细胞中并诱导目的蛋白的表达；糖基转移酶bs-yjic和蔗糖合成酶atsusy的诱导条件为：在含有100μg/l氨苄青霉素或卡那霉素的lb液体培养基中(10g/lnacl，10g/l蛋白胨和5g/l酵母粉)，37℃培养3～4h至菌体od600为0.6～0.8，加入iptg至终浓度为0.3mm后，16℃、200r/min培养16-20h以诱导目的蛋白的表达。然后，离心收集含有目的蛋白的菌体并将菌体用缓冲液(25mmol/ltris-hcl，ph7.0)悬浮，然后通过高压破碎使菌体裂解，利用配备了镍离子亲核层析柱的aktapurifier系统对目的蛋白进行纯化收集，通过sds-page蛋白电泳分析目的bs-yjic和atsusy的表达情况及纯度。如sds-page蛋白胶所示(图3)，重组糖基转移酶bs-yjic和蔗糖合成酶均为可溶性表达，目的蛋白主要位于细胞破碎液的上清中，糖基转移酶bs-yjic的大小约为62kda，而蔗糖合成酶的大小约为110kda，而表达了空质粒的重组菌株相比则没有相应蛋白条带。另外，sds-page蛋白胶的结果表明镍柱亲核层析可纯化获得纯度超过95％的糖基转移酶bs-yjic和蔗糖合成酶atsusy。

实施例2、糖基转移酶bs-yjic催化原人参三醇糖基化

按照实施例1所述步骤分离纯化糖基转移酶bs-yjic，糖基转移酶bs-yjic催化原人参三醇糖基化的反应体系包括：2mm原人参三醇，10mm尿苷二磷酸葡萄糖，50mmtris-hcl(ph7.5)，10mmmgcl2，和5mu/ml糖基转移酶bs-yjic，35℃反应0.5h。

反应完成后，加入等体积的甲醇终止反应，然后12000rpm离心10min，取上清液经0.22μm滤膜过滤后，加入液相瓶中，通过高效液相色谱以及高效液相色谱-质谱联用仪对糖基化产物进行分析与鉴定。高效液相色谱的分析条件为：流动相a为0.1％(v/v)甲酸的蒸馏水，流动相b为含有0.1％(v/v)甲酸的色谱乙腈，色谱柱为购买自上海月旭科技公司的c18色谱柱(4.6mm×250mm，5μmparticle)，进样量为20μl，梯度洗脱条件为0-25min，25％b-85％b，25min-45min，85％b，紫外检测器，检测波长为203nm，流动相的流速为1ml/min，柱温箱为35℃。质谱仪型号为配备了esi离子源的brukermirootof-ii质谱仪，扫描范围为100-1000da，正离子模式，喷射电压为4500v，氮气流速为6ml/min，氮气温度为180℃

如图4所示，高效液相色谱分析表明糖基转移酶bs-yjic可催化原人参三醇生成5个产物；进一步利用高效液相色谱-质谱联用仪对这5个产物进行分析表明，这个五个产物的分子量分别为：产物1([m+h]⁺m/z⁺～963.5477)，产物2([m+h]⁺m/z⁺～801.4994)，产物3([m+h]⁺m/z⁺～801.4974)，产物4([m+h]⁺m/z⁺～639.4437)，和产物5([m+h]⁺m/z⁺～639.4438)，而原人参三醇的分子式为c30h52o4，理论分子量为[m+h]⁺m/z⁺～477.3938)；说明产物1为原人参三醇加上3个葡萄糖分子的糖基化产物，产物2和3为原人参三醇加上2个葡萄糖分子的糖基化产物，产物4和5为原人参三醇加上一个葡萄糖分子的糖基化产物。

利用bruker600mhz核磁共振仪对这5个产物进行结构鉴定，分别采集这5个产物的一维核磁谱(1h和13c)以及二维核磁谱(hsqc、hmbc和cosy)，经过核磁谱的分析与鉴定，产物1为3-o-β-d-glucopyranosyl-6-o-β-d-glucopyranosyl-12-o-β-d-glucopyranosyl-20(s)-protopanaxatriol、产物2为3-o-β-d-glucopyranosyl-6-o-β-d-glucopyranosyl-20(s)-protopanaxatriol，产物3为3-o-β-d-glucopyranosyl-12-o-β-d-glucopyranosyl-20(s)-protopanaxadiol、产物4为人参皂苷rh1(6-o-β-d-glucopyranosyl-20(s)-protopanaxatriol)、产物5为3-o-β-d-glucopyranosyl-20(s)-protopanaxatriol(图1)。这5个产物，除产物4(人参皂苷rh1)为天然人参皂苷以外，其它4个产物均为非天然的原人参三醇型人参皂苷。糖基化对人参皂苷药理活性及结构多样性的形成至关重要，本发明利用糖基转移酶bs-yjic催化原人参三醇合成的多种天然与非天然原人参三醇型人参皂苷极大的丰富了人参皂苷的种类，这些非天然的原人参三醇人参皂苷可能同其它天然原人参三醇型人参皂苷一样具有多种独特的药理活性。

实施例3、糖基转移酶bs-yjic与蔗糖合成酶atsusy偶联反应催化原人参三醇糖基化

糖基转移酶bs-yjic与蔗糖合成酶atsusy偶联反应催化原人参三醇糖基化的反应体系为：3mm原人参三醇，0.5mm尿苷二磷酸，50mmtris-hcl(ph7.5)，10mmmgcl2，10％二甲基亚砜(v/v)，160mu/ml糖基转移酶bs-yjic，200mu/ml蔗糖合成酶atsusy，35℃反应，200rpm条件下，反应1h。反应结束后，按照实施例2中的反应条件以及高效液相色谱检测方法对反应产物进行鉴定。如图5所示，与利用昂贵的尿苷二磷酸葡萄糖为糖基供体的反应体系一样，糖基转移酶bs-yjic与蔗糖合成酶atsusy组成的双酶偶联反应体系可以以廉价的蔗糖为糖基供体，高效催化原人参三醇糖基化生成图1中所示的5种天然与非天然人参皂苷。

鉴于糖基转移酶bs-yjic与蔗糖合成酶atsusy偶联反应可以在1h内高效催化3mm原人参三醇糖基化，因此进一步采取分批补料的方式，即在1h反应结束后，在时间点1h、3h和6h分别补充3mm原人参三醇，以避免一次性添加高浓度的原人参三醇对酶的抑制作用。如图6所示，通过分批补充原人参三醇，最终糖基转移酶bs-yjic与蔗糖合成酶atsusy偶联反应体系可催化原人参三醇生成1.5g/l非天然人参皂苷3-o-β-d-glucopyranosyl-20(s)-protopanaxatriol(产物5)，1.7g/l人参皂苷rh1(产物4)，5.8g/l非天然人参皂苷3-o-β-d-glucopyranosyl-12-o-β-d-glucopyranosyl-20(s)-protopanaxadiol(产物3)，0.25g/l非天然人参皂苷3-o-β-d-glucopyranosyl-6-o-β-d-glucopyranosyl-20(s)-protopanaxatriol(产物2)和0.38g/l非天然人参皂苷3-o-β-d-glucopyranosyl-6-o-β-d-glucopyranosyl-12-o-β-d-glucopyranosyl-20(s)-protopanaxatriol(产物1)(图6)，原人参三醇的转化率达到98％，说明糖基转移酶bs-yjic与蔗糖合成酶atsusy偶联反应可以高效催化原人参三醇糖基化以合成本发明专利中的5种天然与非天然人参皂苷产物。鉴于酿酒酵母工程菌可以高效合成原人参三醇且该双酶偶联反应又具有催化效率高、产物纯化简单、成本低廉等特点，因此糖基转移酶bs-yjic与蔗糖合成酶atsusy偶联反应将为本发明专利中5种天然与非天然人参皂苷的规模化生产奠定基础。

序列表

<110>中国科学院天津工业生物技术研究所

<120>一组天然与非天然的原人参三醇型人参皂苷的合成方法

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>392

<212>prt

<213>枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)

<400>1

metlyslystyrhisilesermetileasnileproalatyrglyhis

151015

valasnprothrleualaleuvalglulysleucysglulysglyhis

202530

argvalthrtyralathrthrglugluphealaproalavalglngln

354045

alaglyglyglualaleuiletyrhisthrserleuasnileasppro

505560

lysglnileargglumetmetglulysasnaspalaproleuserleu

65707580

leulysgluserleuserileleuproglnleuglugluleutyrlys

859095

aspaspglnproaspleuileiletyraspphevalalaleualagly

100105110

lysleuphealaglulysleuasnvalprovalilelysleucysser

115120125

sertyralaglnasngluserpheglnleuglyasngluaspmetleu

130135140

lyslysileargglualaglualagluphelysalatyrleuglugln

145150155160

glulysleuproalavalserphegluglnleualavalprogluala

165170175

leuasnilevalphemetprolysserpheglnileglnhisgluthr

180185190

pheaspaspargphecysphevalglyproserleuglygluarglys

195200205

glulysgluserleuleuileasplysaspaspargproleumetleu

210215220

ileserleuglythralapheasnalatrpprogluphetyrlysmet

225230235240

cysilelysalapheargaspsersertrpglnvalilemetserval

245250255

glylysthrileaspprogluserleugluaspileproalaasnphe

260265270

thrileargglnservalproglnleugluvalleuglulysalaasp

275280285

leupheileserhisglyglymetasnserthrmetglualametasn

290295300

alaglyvalproleuvalvalileproglnmettyrgluglngluleu

305310315320

thralaasnargvalaspgluleuglyleuglyvaltyrleuprolys

325330335

glugluvalthrvalserserleuglnglualavalglnalavalser

340345350

seraspglngluleuleuserargvallysasnmetglnlysaspval

355360365

lysglualaglyglyalagluargalaalaalagluileglualaphe

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145150155160

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165170175

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180185190

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195200205

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ileleuaspglnvalargalaleugluasnglumetleuleuargile

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glnlysglnglyleugluvalileprolysileleuilevalthrarg

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leuleuproglualalysglythrthrcysasnglnargleugluarg

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<213>拟南芥(arabidopsisthaliana)

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seraspileleuglnalaproaspproserserleuglulyspheleu

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valthrargleuileproaspalalysglythrthrcysasnglnarg

340345350

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355360365

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370375380

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<211>805

<212>prt

<213>大豆(glycinemax)

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proprotrpvalalaleualavalargproargproglyvaltrpglu

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alaglutyrleuhisphelysglugluleuvalaspglyserserasn

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glyasnphevalleugluleuasppheglupropheasnalaalaphe

130135140

proargprothrleuasnlysserileglyasnglyvalglnpheleu

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asnarghisleuseralalysleuphehisasplysgluserleuhis

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proleuleuglupheleuargleuhisservallysglylysthrleu

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hisilecysvalleulysaspargserlysproileilephethrmet

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675680685

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proleualaalaglu

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<211>793

<212>prt

<213>嗜酸性喜温硫杆菌(acidithiobacilluscaldus)

<400>6

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151015

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202530

tyrthraspleuglnargalacysalaaspphearggluglnleupro

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gluglytyralagluglyileglyproleugluaspphevalalahis

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proargproglyargtrpiletyrvalargilehisarggluglnleu

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alaleuglugluleuserthraspalatyrleuglnalalysglugly

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ilevalglyleuglyalagluglyglualavalleuthrvalaspphe

115120125

argasppheargprovalserargargleuargaspgluserthrile

130135140

glyaspglyleuthrhisleuasnargargleualaglyargilephe

145150155160

seraspleualaalaglyargserglnileleuglupheleuserleu

165170175

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leuleumetaspleuleuaspserproserproalaalaleugluser

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pheleuaspargileprometileserargileleuilevalserile

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