高速逆流色谱-制备型液相色谱分离纯化花榈木叶提取物中具抗抑郁作用的化合物的方法与流程

本发明涉及一种对花榈木叶提取物进行分离纯化的方法，具体涉及一种以高速逆流色谱结合制备型液相色谱从花榈木叶提取物中对具有抗抑郁作用的黄酮类化合物(8个化学成分)进行分离纯化的方法。

背景技术：

花榈木属于豆科蝶形花亚科红豆属植物，广泛分布于安徽、浙江、江西、湖北、湖南、广东、四川、贵州和云南等地。花榈木木材为高档家具、雕刻和珍贵装饰品的树种，也是一种中药材，据《全国中草药汇编》中记载，它的根、茎、皮、叶等树体各器官均可入药，用于跌打损伤、腰肌劳损、风湿关节痛、产后血瘀疼痛、白带。我们前期动物实验研究表明，花榈木叶提取物具有良好的抗抑郁作用研究，本专利建立了该提取物中8个化学成分制备方法，并进行了结构鉴定，为进一步药理研究及开发利用奠定基础。

技术实现要素：

本发明的目的是，在前期花榈木叶提取物具有良好的抗抑郁作用研究的基础上，进一步提供一种高速逆流色谱-制备型液相色谱分离纯化花榈木叶提取物中具抗抑郁作用的化合物的方法，以获取8个具抗抑郁作用的单体化合物。

为达上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种高速逆流色谱-制备型液相色谱分离纯化花榈木叶提取物中具抗抑郁作用的化合物的方法，该方法步骤如下：

(1)以水、正丁醇、甲基叔丁基醚、乙醇和冰乙酸作为溶剂体系，体积比为6：3：1：1：0.001，采用高速逆流色谱法分离花榈木叶提取物，分别收集163-195min、210-225min、238-262min、282-295min、325-365min、427-518min的流出液，将210-225min的流出液和238-262min的流出液分别浓缩后冷冻干燥，分别得化合物2″-o-鼠李糖基牡荆素和2″-o-鼠李糖基异牡荆素；

(2)将上述收集的剩余时间段的流出液分别浓缩，按制备液相色谱条件：色谱柱为unitaryc18柱，流动相为乙腈和0.2％冰乙酸水，采用制备型液相色谱法对浓缩后的流出液进行二次分离，按色谱峰分别接收流出液，将各流出液浓缩后冷冻干燥，分别得到单体化合物2″-o-鼠李糖基异荭草素、异荭草素、荭草素、异牡荆素、香叶木苷和蒙花苷。

上述高速逆流色谱法中溶剂体系的上相为固定相，下相为流动相，流速为2ml/min，转速为850转/分钟，柱温箱的温度为20℃，检测波长为340nm，固定相的保留率为40％。

上述制备型液相色谱法中流速为6ml/min，检测波长为340nm。

上述步骤(2)中提及的将上述收集的剩余时间段的流出液分别浓缩中的浓缩是指将流出液浓缩至2-5ml。

上述提及的浓缩后冷冻干燥中，浓缩是指于50-55℃下真空旋转蒸发浓缩，冷冻干燥是于冷冻干燥机中干燥24h。

上述提及的花榈木叶提取物的制备请参见申请号为201811413966.2(cn109200084a)的申请。

本方法简便，重现性好，一次上样量最高可达250mg，此时可获得2.45mg化合物1、1.23mg化合物2、3.16mg化合物3、15.13mg化合物4、18.48mg化合物5、1.12mg化合物6、0.69mg化合物7、1.41mg化合物8，纯度均大于98％，可用于化合物大量制备，为阐明花榈木叶提取物抗抑郁作用奠定基础。

附图说明

图1是本发明花榈木叶提取物hplc检测谱图(检测波长340nm)。

图2是本发明花榈木叶提取物的hsccc分离谱图(波长340nm)。

图3是本发明hsccc各组分流出液的hplc谱图(检测波长340nm)。

图4是本发明pre-hplc各组分流出液的hplc谱图(检测波长340nm)。

具体实施方式

实施例1花榈木叶提取物hplc检测

hplc检测条件：色谱柱c18column(4.6mm×250mm，5μm)，流动相a(0.2％的磷酸水溶液)和流动相b(乙腈)梯度洗脱：流动相b(15-23％)，0-8min；b(23-30％)，8-20min；b(30-60％)，20-25min和b(60-15％)，25-26min；流速为1.0ml/min，进样量为20μl。

取少量花榈木叶提取物用甲醇溶解，微孔滤膜过滤后，按上述hplc检测条件进行检测，hplc谱图见图1，由图可见，花榈木叶提取物中含有多个化学成分(见图中数字1-8所标示)，紫外光谱显示，在260nm和340nm处均有较大吸收，符合黄酮类化合物紫外吸收特征，初步确定为黄酮类化合物。

实施例2

1、高速逆流色谱(hsccc)分离化合物4、5

高速逆流色谱(hsccc)分离条件为，以水：正丁醇：甲基叔丁基醚：乙醇：冰乙酸＝6：3：1：1：0.001(v/v)作为溶剂体系，上相作固定相，下相作流动相，流速2ml/min，转速850转/分钟，柱温箱20℃，波长340nm。在该条件下固定相的保留率为40％，上样量为250mg，hsccc分离花榈木叶提取物的图谱见图2。

分别收集163-195min(m1)、210-225min(m2)、238-262min(m3)、282-295min(m4)、325-365min(m5)、427-518min(m6)的流出液，各流分经hplc检测(检测条件同实施例1)，结果见图3，其中m2为化合物4，m3为化合物5，其纯度经面积归一法计算均为98％，将m2和m3流出液分别浓缩后冷冻干燥，得化合物4和化合物5；其他4个流分中化合物纯度不高，将该些液分分别浓缩至2-5ml，下一步用制备液相进行纯化。

2、制备型液相色谱(pre-hplc)分离化合物1、2、3、6、7、8

制备型液相色谱条件：色谱柱型号：unitaryc18柱(10.0mm×250mm，5μm)，流动相为乙腈和0.2％冰乙酸水，流速为6ml/min，检测波长为340nm。

利用制备型液相色谱对流分m1、m4、m5、和m6进行二次分离，按色谱峰接收流出液，将流出液浓缩后冷冻干燥，得各单体化合物。具体为：从m1中获得2.45mg化合物1和1.23mg化合物2；从m4中获得0.69mg化合物7；从m5中获得3.16mg化合物3；从m6中获得1.12mg化合物6和1.41mg化合物8，经面积归一法计算，纯度均为98％，hplc检测(检测条件同实施例1)谱图见图4。

3、化合物结构鉴定

采用质谱和核磁共振鉴定上述8个化合物的结构。

化合物1：淡黄色粉末，esi-msm/z593.1515[m-h]^-,提示分子式为c27h30o15；¹hnmr(dmso-d6,500mhz)δ:13.57(1h,s,oh-5),7.43(1h,s,h-6′),7.40(1h,d,j＝5.0hz,h-2′),6.88(1h,d,j＝8.0hz,h-5′),6.67(1h,s,h-3),6.46(1h,d,j＝9.5hz,h-8),5.09(1h,s,h-1″′),4.62(1h,dd,j＝10.0hz,h-1″),4.37(1h,t,j＝9.0hz,9.5hz,h-2″),3.70(1h,d,j＝11.0hz,h-6″),2.92-3.72(6h,m,h-3″,4″,5″,2″′,3″′,4″′),2.33-2.52(1h,m,h-5″′),0.52(3h,d,j＝6.0hz,h-6″′)。¹³cnmr(dmso-d6,100mhz)δ：163.94(c-2),103.11(c-3),182.50(c-4),163.05(c-5),109.07(c-6),160.39(c-7),93.28(c-8)，156.66(c-9),104.22(c-10),121.80(c-1′),113.66(c-2′),146.27(c-3′)，150.23(c-4′),116.55(c-5′),119.38(c-6′),71.80(c-1″),75.06(c-2″),80.08(c-3″),70.82(c-4″),81.85(c-5″),61.75(c-6″),100.84(c-1″′),71.09(c-2″′),70.76(c-3″′),72.06(c-4″′),68.69(c-5″′),18.02(c-6″′)。经质谱和核磁数据确定化合物为：2″-o-鼠李糖基异荭草素，结构式如下：

化合物2：淡黄色粉末，esi-msm/z447.0931[m-h]^-,提示分子式为c21h20o11；¹hnmr(dmso-d6,500mhz)δ:13.58(1h,s,oh-5),7.44(1h,d,j＝2.0hz,h-6′),7.41(1h,d,j＝5.0hz,h-2′),6.89(1h,d,j＝8.5hz,h-5′),6.68(1h,s,h-3),6.49(1h,s,h-8),4.58(1h,d,j＝9.5hz,h-1″),4.04(1h,t,j＝9.0hz,9.0hz,h-2″),3.69(1h,d,j＝10.5hz,h-6″)，3.11-3.22(3h,m)；¹³cnmr(dmso-d6,100mhz)δ:164.09(c-2),103.24(c-3),182.32(c-4),161.17(c-5),109.35(c-6),164.09(c-7)，93.96(c-8),156.66(c-9),103.82(c-10),121.85(c-1′),113.75(c-2′),146.23(c-3′),150.22(c-4′),116.52(c-5′),119.44(c-6′),73.51(c-1″),71.09(c-2″),79.43(c-3″),70.64(c-4″),82.06(c-5″),61.96(c-6″)。经质谱和核磁数据确定化合物为：异荭草素，结构式如下：

化合物3：黄绿色粉末，esi-msm/z447.0936[m-h]^-,提示分子式为c21h20o11；¹hnmr(dmso-d6,500mhz)δ:13.19(1h,s,oh-5),7.54(1h,d,j＝8.0hz,h-6′),7.50(1h,s,h-2′),6.88(1h,d,j＝8.5hz,h-5′),6.66(1h,s,h-3),6.30(1h,s,h-6),4.68(1h,d,j＝9.5hz,h-1″),3.06～3.86(5h,m)；¹³cnmr(dmso-d6,100mhz)δ:164.56(c-2),102.86(c-3),182.49(c-4),160.83(c-5),98.60(c-6),163.06(c-7),105.00(c-8),156.45(c-9),104.48(c-10),122.46(c-1′),114.55(c-2′),146.29(c-3′),150.09(c-4′),116.15(c-5′),119.82(c-6′)，73.84(c-1″),71.22(c-2″),79.22(c-3″),71.16(c-4″)，82.48(c-5″),62.10(c-6″)。经质谱和核磁数据确定化合物为：荭草素，结构式如下：

化合物4：棕黄色粉末，esi-msm/z577.1564[m-h]^-,提示分子式为c27h30o14；¹hnmr(dmso-d6,500mhz)δ:13.16(1h,s,oh-5),10.91(1h,s,oh-7),10.40(1h,s,oh-4′),8.05(2h,d,j＝8.5hz,h-2′,6′),6.91(2h,d,j＝9.0hz,h-3′,5′),6,81(1h,s,h-3),6.27(1h,s,h-6),4.76(1h,d,j＝10.0hz,h-1″),2.09-3.83(10h,m),0.47(3h,d,j＝6.0hz,h-6″′)；¹³cnmr(dmso-d6,100mhz)δ:164.44(c-2),102.89(c-3),182.56(c-4),161.12(c-5),98.74(c-6),162.80(c-7),104.91(c-8),156.27(c-9),104.66(c-10),122.05(c-1′),129.46(c-2′),116.33(c-3′),161.66(c-4′),116.33(c-5′),129.46(c-6′),72.12(c-1″),75.49(c-2″),80.35(c-3″),70.90(c-4″),82.27(c-5″),61.59(c-6″),100.76(c-1″′),71.09(c-2″′),70.68(c-3″′),71.92(c-4″′),68.68(c-5″′),18.18(c-6″′)。经质谱和核磁数据确定化合物为：2″-o-鼠李糖基牡荆素，结构式如下：

化合物5：棕黄色粉末，esi-msm/z577.1562[m-h]^-,提示分子式为c27h30o14；¹hmr(dmso-d6,500mhz)δ:13.56(1h,s,oh-5),7.93(2h,d,j＝8.5hz,h-2′,6′),6.92(2h,d,j＝9.0hz,h-3′,5′),6.79(1h,s,h-3),6.50(1h,s,h-8),4.97-5.13(1h,m,h-1″′),4.67(1h,d,j＝10.0hz,h-1″),4.37(1h,t,j＝9.5hz,9.0hz,h-2″),3.61-3.81(1h,m,h-2″′),2.92-3.37(6h,m),0.52(3h,d,j＝6.0hz,h-6″′)；¹³cnmr(dmso-d6,100mhz)δ:163.97(c-2),103.11(c-3),182.60(c-4),161.72(c-5),109.47(c-6),163.78(c-7),93.43(c-8),156.68(c-9),104.22(c-10),121.49(c-1′),128.88(c-2′),116.49(c-3′),161.66(c-4′),116.49(c-5′),128.88(c-6′),71.99(c-1″),75.01(c-2″),80.50(c-3″),70.82(c-4″),81.98(c-5″),62.18(c-6″),100.83(c-1″′),71.41(c-2″′),71.08(c-3″′),72.05(c-4″′),68.69(c-5″′),18.03(c-6″′)。经质谱和核磁数据确定化合物为：2″-o-鼠李糖基异牡荆素，其结构式如下：

化合物6：淡黄色粉末，esi-msm/z431.0985[m-h]^-,提示分子式为c21h20o10；¹hnmr(dmso-d6,500mhz)δ:13.57(1h,s,oh-5)，7.93(2h,d,j＝9.0hz,h-2′,6′)，6.93(2h,d,j＝9.0hz,h-3′,5′),6.80(1h,s,h-3),6.54(1h,s,h-8),4.58(1h，d,j＝10.0hz,h-1″),3.12-4.07(5h,m)；¹³cnmr(dmso-d6,100mhz)δ:163.98(c-2),103.25(c-3),182.43(c-4),156.68(c-5),109.36(c-6),163.79(c-7),94.10(c-8),161.67(c-9),103.86(c-10),121.56(c-1′),128.59(c-2′),116.46(c-3′),161.14(c-4′),116.46(c-5′),128.95(c-6′),73.50(c-1″),79.42(c-2″),71.08(c-3″),70.65(c-4″),82.06(c-5″),61.95(c-6″)。经质谱和核磁数据确定化合物为：异牡荆素，其结构式如下:

化合物7：白色粉末，esi-msm/z607.1738[m-h]^-,提示分子式为c28h32o15；¹hnmr(dmso-d6,500mhz)δ：12.92(1h,s,oh-5)，9.46(1h,s,oh-3′)，7.57(1h,dd,j＝2.0hz,h-6′)，7.45(1h,dd,j＝2.0hz,h-2′)，7.13(1h,d,j＝8.5hz,h-5′)，6.84(1h,s,h-3)，6.77(1h,d,j＝2.0hz,h-8)，6.47(1h,d,j＝2.0hz,h-6)，5.08(1h,d,j＝7.5hz,h-1″)，4.55(1h,s,h-1″′),3.88(3h,s,-och3),1.08(3h,d,j＝6.0hz,h-6″′)；¹³cnmr(dmso-d6,100mhz)δ:164.36(c-2),103.99(c-3),182.09(c-4),161.36(c-5),99.76(c-6),163.11(c-7),94.95(c-8),157.11(c-9),105.61(c-10),123.07(c-1′),113.33(c-2′),147.00(c-3′),151.49(c-4′),112.44(c-5′),119.05(c-6′),100.10(c-1″),73.26(c-2″),76.43(c-3″),69.75(c-4″),75.77(c-5″),66.22(c-6″),100.68(c-1″′),70.90(c-2″′),70.47(c-3″′),72.21(c-4″′),68.47(c-5″′),17.95(c-6″′),55.95(ch3o-4′)。经质谱和核磁数据确定化合物为：香叶木苷，其结构式如下：

化合物8：白色粉末，esi-msm/z591.1880[m-h]^-,提示分子式为c28h32o14；¹hnmr(dmso-d6,500mhz)δ:12.93(1h,s,oh-5),8.06(2h,d,j＝7.5hz,h-2′,6′),7.15(2h,d,j＝8.0hz,h-3′,5′),6.96(1h,s,h-3),6.80(1h,s,h-8),6.46(1h,d,j＝1.5hz,h-6),5.07(1h,d,j＝7.0hz,h-1″),4.56(1h,s,h-1″′),3.87(3h,s,-och3),1.08(3h,d,j＝6.0hz,h-6″′)；¹³cnmr(dmso-d6,100mhz)δ:164.42(c-2),104.29(c-3),182.53(c-4),162.91(c-5),100.13(c-6),163.44(c-7),95.26(c-8),157.46(c-9),105.94(c-10),123.15(c-1′),128.95(c-2′),115.19(c-3′),161.63(c-4′),115.19(c-5′),128.95(c-6′),101.01(c-1″),73.55(c-2″),76.14(c-3″),70.83(c-4″),76.73(c-5″),66.57(c-6″),100.40(c-1″′),71.22(c-2″′),70.07(c-3″′),72.53(c-4″′),68.81(c-5″′),18.30(c-6″′)，56.06(-och3)。经质谱和核磁数据确定化合物为：蒙花苷，其结构式如下：