厚藤基因IpERD15的应用的制作方法

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种厚藤耐盐、抗旱基因iperd15的应用。

背景技术：

人口的增长和耕地面积的不断减少，环境持续恶化，各种农业自然灾害如干旱、盐碱地形成等对农作物生产造成严重威胁，提高作物的产量越来越受到人们的广泛关注。如果粮食问题没有解决的办法，那么数十亿人口将在未来面临食物短缺的问题。因此，了解植物抗逆性形成机制，发掘抗逆基因资源，进而培育抗逆农作物新品种，对增加粮食产量、保障粮食安全等具有重要战略意义和必要性。在科技迅猛发展的今天，作物的品种改良正经历着新的变革，传统的育种方法已经越来越不能满足人们的需求。目前通过基因工程技术手段进行植物抗盐、抗旱等方面的研究已取得了非常大的研究进展。研究表明，将植物体中与耐盐、抗旱相关的基因转入植物体中，其异源表达产物可以提高植物耐盐、抗旱的能力。因此，挖掘、克隆和研究相关基因具有重要的意义。

厚藤(ipomoeapes-caprael.)又名马鞍藤、二叶红薯、马蹄草，主要分布于热带和亚热带地区海边沙滩上及向阳的路边，是一种滨海适生重要野生植物。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种耐盐、抗旱基因——厚藤iperd15的应用。

本发明发明人通过酵母突变株对厚藤全长cdna文库的筛选，分离、鉴定和克隆厚藤iperd15基因，并对其功能研究，结果表明，该基因具有耐盐和抗旱能力。

实现上述的目的的技术方案如下。

氨基酸序列如seqidno.4所示的厚藤蛋白iperd15和/或厚藤基因iperd15在提高植物的耐盐、抗旱性能中的应用，所述厚藤基因iperd15的cdna阅读框为如seqidno.3所示的核苷酸序列，或为完全与seqidno.3互补配对的核苷酸序列，或所述厚藤基因iperd15为编码氨基酸序列如seqidno.4的核苷酸序列。

厚藤基因iperd15在培育耐盐、抗旱植物中的应用，所述厚藤基因iperd15的cdna阅读框为如seqidno.3所示的核苷酸序列，或为完全与seqidno.3互补配对的核苷酸序列，或所述厚藤基因iperd15为编码氨基酸序列如seqidno.4的核苷酸序。

本发明的另一个目的是提供一种具有耐盐/抗旱性能的酿酒酵母重组表达载体及其应用。

实现上述目的的技术方案如下。

插入有厚藤基因iperd15的cdna阅读框序列的酿酒酵母重组表达载体，所述厚藤基因iperd15的cdna阅读框为如seqidno.3所示的核苷酸序列，或为完全与seqidno.3互补配对的核苷酸序列，或所述厚藤基因iperd15为编码氨基酸序列如seqidno.4的核苷酸序列。

上述酿酒酵母重组表达载体在提高植物的耐盐、抗旱性能中的应用。

上述酿酒酵母重组表达载体在培育耐盐、抗旱植物中的应用。

一种提高植物的耐盐、抗旱性能的生物制剂，其活性成份上述酿酒酵母重组表达载体，或其活性成份含有调控厚藤基因iperd15表达的生物制品，所述厚藤基因iperd15的cdna阅读框为如seqidno.23所示的核苷酸序列，或为完全与seqidno.3互补配对的核苷酸序列，或所述厚藤基因iperd15为编码序列氨基酸序列如seqidno.4的核苷酸序列。

本发明的另一目的是提供一种提高植物的耐盐、抗旱性能的方法。

具体技术方案为：一种提高植物的耐盐、抗旱性能的方法，该方法包括：将厚藤基因iperd15导入宿主植物细胞、组织或植株个体，得到具有基因iperd15的植株，调控基因iperd15的表达，所述厚藤基因iperd15的cdna阅读框为如seqidno.23所示的核苷酸序列，或为与seqidno.3互补配对的核苷酸序列，或所述厚藤基因iperd15为编码序列氨基酸序列如seqidno.4的核苷酸序列。

优选地，所述植物为单子叶植物，更优选为水稻、玉米或小麦。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的厚藤耐盐、抗旱基因名称为iperd15，所述基因编码的核苷酸和氨基酸序列分别如seqidno.3和seqidno.4所示。本发明首次克隆得到了厚藤基因iperd5，并通过酵母互补实验比较分析证明，该基因具有耐盐、抗旱功能。该iperd15基因，可以用于提高植物的耐盐、抗旱性能，也可以在育种中用于培育耐盐、抗旱植物。

附图说明

图1.iperd15基因扩增结果。m为dnamarker；

图2.酿酒酵母重组表达载体iperd15-pyes2示意图；

图3.转化iperd15-pyes2的转基因酵母对盐敏感的突变株axt3对盐胁迫的耐受性提高；

图4.转化iperd15-pyes2的转基因野生型酵母w303对盐胁迫的耐受性提高；

图5.转化iperd15-pyes2的转基因酵母对h2o2敏感的突变株skn7δ(b)对氧化胁迫的耐受性提高；

图6.转化iperd15-pyes2的转基因酵母对h2o2敏感的突变株yap1δ(a)对氧化胁迫的耐受性提高；

图7.模式植物拟南芥转基因超表达载体pcambia1300(m)-iperd15示意图。

具体实施方式

本发明首先设计基因特异性引物，从厚藤全长cdna文库中克隆iperd15基因编码序列。测序获得序列后，构建包含iperd15基因稳定过表达载体，并进行功能分析。

本发明提供的厚藤耐盐、抗旱基因名称为iperd15，所述基因编码的核苷酸序列如seqidno.3所示。其氨基酸序列为seqidno.4所示。

本发明所述基因iperd15在培育耐盐、抗旱植物中的应用。所述宿主植物为水稻、玉米和小麦等单子叶植物。任何一种可以将外源基因导入植物中表达的载体都可以应用，其特点是载体含有本发明中iperd15基因的核苷酸序列及氨基酸序列，如seqidno.3和seqidno.4所示。

本发明所述的基因可广泛用于培育耐盐、抗旱作物新品种。

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

seqidno.1

5’-gggggatccatggccttagtttctggaa-3’

seqidno.2

5’-ggggaattctcagcgaggttgttggatg-3’。

seqidno.3

atggccttagtttctggaaggaggtcaactctgaatccaaacgctgcaccttttgttcctgcgtctgtacgccaagtggaggacttctcacctgaatggtgggacttggcaaccaactcaacatggttccatgattactgggtaggccagaaggagggatcagaatatggcagcaatgaggctggatttggtgatgatgatattgctgatttgctgccagataacattgatcttgatgttgatgaggacattttgaacatggaagatcaatacgaagaatttctccaatcaattgaaacagggcaaggaaacaatgcttttgtcaacagcatcaaggggatgtcagaatcaggttcagcaaagcgtcctgatgcactggttaaaagtctgaacttgacaaaggagagaggttcaaaatcccttgtgccacccaggtactatgagaagccagcaaaggttgttagcccgaaatgcagccttcgccgcatccaacaacctcgctga。

seqidno.4

malvsgrrstlnpnaapfvpasvrqvedfspewwdlatnstwfhdywvgqkegseygsneagfgdddiadllpdnidldvdedilnmedqyeeflqsietgqgnnafvnsikgmsesgsakrpdalvkslnltkergskslvppryyekpakvvspkcslrriqqpr。

seqidno.5

5’-cgcggatccatggccttagtttctggaagga-3’

seqidno.6

5’-cggactagtgcgaggttgttggatgcggcg-3’。

实验例1：厚藤iperd15基因克隆及iperd15-pyes2载体构建。

具体包括以下步骤：总rna提取、cdna文库的构建和基因克隆。各步骤主要概述如下：(1)总rna提取

取大约1g的厚藤幼根、叶片、藤及叶芽，加入液氮后充分研磨，采用magenrna提取试剂盒，按说明书步骤提取。用nanodrop微量分光光度计测定rna的质量和浓度。

(2)cdna初级文库的构建

采用promegammlv逆转录试剂盒，合成cdna第一链，取约2μg的厚藤总的rna，加入0.5μgoligo(dt)primer及rnase-free的h2o至总体积为15μl；70℃5min，冰上冷却后加入5μlm-mlv5xreactionbuffer和5μl10mmdntp，25unitsrecombinantribonucleaseinhibitor,最后加入200units的m-mlvrt逆转录酶至反应体积为25μl，混匀后置于37℃金属浴上反应60分钟；42℃20分钟。

(3)厚藤iperd15基因克隆及iperd15-pyes2载体构建

以厚藤cdna为模板，设计以下引物扩增iperd15基因的序列，插入酵母表达载体pyes2。引物序列分别为seqidno.1(5’-gggggatccatggccttagtttctggaa-3’)和seqidno.2(5’-ggggaattctcagcgaggttgttggatg-3’)所示。核苷酸序列比较、翻译等在dnastar7.0生物软件上进行，序列同源性分析采用blast程序，在ncbi(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)网站上进行。测序结果表明本研究成功克隆出厚藤iperd15基因。pcr电泳图如图1所示，其基因编码核苷酸和氨基酸序列分别为seqidno.3和seqidno.4所示。

(4)厚藤转基因超表达载体pcambia1300(m)-iperd15构建

以厚藤cdna为模板，设计以下引物扩增iperd15基因的序列，插入植物超表达载体pcambia1300(m)。引物序列分别为seqidno.5(5’-cgcggatccatggccttagtttctggaagga-3’)和seqidno.6(5’-cggactagtgcgaggttgttggatgcggcg-3’)所示。测序结果表明本研究成功构建厚藤转基因超表达载体pcambia1300(m)-iperd15，载体图如图7所示。

实验例2：iperd15基因在酵母中超表达提高酵母的耐盐性及氧化胁迫的耐受性

(1)iperd15-pyes2转化酵母菌株

将构建好并测序验证的iperd15-pyes2重组质粒浓度调整到0.1μg/μl，采用乙酸锂转化法分别转化酵母对盐敏感的突变株axt3和对应的野生型酵母株系(w303)，以及转化酵母对h2o2敏感的突变株yap1δ和skn7δ及对应的野生型酵母株系(wt)。同时采用酵母表达载体空载体pyes2做对照，分别转化上述酵母株系，构建酿酒酵母重组表达载体iperd15-pyes2(参见图2)。

(2)在酵母盐敏感突变株axt3和野生型菌株w303中过表达iperd15提高转基因酵母的耐盐性

分别挑取转化iperd15基因超表达载体iperd15-pyes2和空载体pyes2酵母菌株axt3的单克隆，接种到2ml添加了半乳糖的酵母极限液体培养基中，转速200rpm，30℃恒温摇床，培养至菌液od600＝2。然后按照1:1、1:10、1:100、1:1000分别将菌液进行稀释，分别吸取2μl稀释的菌液滴至添加有50mm，75mm和200mmnacl的酵母极限固体培养基平板上。30℃培养7天，观察酵母生长情况。如图3所示，在添加50mmnacl的培养基平板上，过表达iperd15基因的转基因酵母可以正常生长，在添加75mm和200mmnacl的培养基平板上也可以轻微生长；而没有表达厚藤iperd15的酵母则不能生长，以上实验表明iperd15基因在酵母中的表达能够提高酵母盐敏感突变株axt3对盐胁迫的耐受性。

此外，分别挑取转化iperd15基因超表达载体iperd15-pyes2和空载体pyes2酵母菌株w303的单克隆，按照上述同样方法进行液体培养，转速200rpm，30℃恒温摇床，培养至菌液od600＝2，并按1:1、1:10、1:100、1:1000将菌液进行逐级稀释后滴至添加了质量体积比为8.8％nacl的酵母极限固体培养基平板上。30℃培养7天，观察酵母生长情况。如图4所示，与转化空载体pyes2的w303酵母突变株相比，过表达iperd15基因的转基因酵母能够在添加8.8％nacl的培养基平板上生长；而没有过表达厚藤iperd15的酵母空载体pyes2则不能生长，以上实验表明iperd15基因在酵母中的表达能够提高野生型酵母株系w303对盐胁迫的耐受性。

(3)在酵母对h2o2敏感突变株yap1δ和skn7δ中过表达iperd15基因提高转基因酵母对氧化胁迫的耐受性

分别挑取酵母对h2o2敏感突变株yap1δ和skn7δ转化空载体pyes2和iperd15-pyes2的单克隆，以及对照野生型酵母wt转化空载体pyes2的单克隆，将上述克隆分别接种于2ml添加了半乳糖的酵母极限液体培养基中，转速200rpm，30℃恒温摇床，培养至菌液od600＝2。并按1:1、1:10、1:100、1:1000将菌液进行逐级稀释后取2μl滴至添加有0.25mm和0.5mm的h2o2的酵母极限固体培养基平板上。30℃培养7天，观察酵母生长情况。如图5所示，与转化空载体pyes2的yap1δ酵母突变株相比，过表达iperd15的转基因酵母能够在添加0.5mmh2o2的培养基平板上生长；而没有表达厚藤iperd15的酵母skn7δ几乎不能生长。同样，过表达iperd15的转基因酵母skn7δ也能够在添加0.5mmh2o2的培养基平板上生长；而没有表达厚藤iperd15的酵母yap1δ则几乎不能生长(图6)。以上结果表明iperd15基因在h2o2敏感酵母突变株skn7δ和yap1δ中的表达能够提高酵母对氧化胁迫的耐受性。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>中国科学院华南植物园

<120>厚藤基因iperd15的应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gggggatccatggccttagtttctggaa28

<210>2

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ggggaattctcagcgaggttgttggatg28

<210>3

<211>504

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

atggccttagtttctggaaggaggtcaactctgaatccaaacgctgcaccttttgttcct60

gcgtctgtacgccaagtggaggacttctcacctgaatggtgggacttggcaaccaactca120

acatggttccatgattactgggtaggccagaaggagggatcagaatatggcagcaatgag180

gctggatttggtgatgatgatattgctgatttgctgccagataacattgatcttgatgtt240

gatgaggacattttgaacatggaagatcaatacgaagaatttctccaatcaattgaaaca300

gggcaaggaaacaatgcttttgtcaacagcatcaaggggatgtcagaatcaggttcagca360

aagcgtcctgatgcactggttaaaagtctgaacttgacaaaggagagaggttcaaaatcc420

cttgtgccacccaggtactatgagaagccagcaaaggttgttagcccgaaatgcagcctt480

cgccgcatccaacaacctcgctga504

<210>4

<211>167

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

metalaleuvalserglyargargserthrleuasnproasnalaala

151015

prophevalproalaservalargglnvalgluasppheserproglu

202530

trptrpaspleualathrasnserthrtrpphehisasptyrtrpval

354045

glyglnlysgluglyserglutyrglyserasnglualaglyphegly

505560

aspaspaspilealaaspleuleuproaspasnileaspleuaspval

65707580

aspgluaspileleuasnmetgluaspglntyrgluglupheleugln

859095

serilegluthrglyglnglyasnasnalaphevalasnserilelys

100105110

glymetsergluserglyseralalysargproaspalaleuvallys

115120125

serleuasnleuthrlysgluargglyserlysserleuvalpropro

130135140

argtyrtyrglulysproalalysvalvalserprolyscysserleu

145150155160

argargileglnglnproarg

165

<210>5

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

cgcggatccatggccttagtttctggaagga31

<210>6

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

cggactagtgcgaggttgttggatgcggcg30