视蛋白多肽及其使用方法与流程

本申请是申请日为2012年12月12日、发明名称为“视蛋白多肽及其使用方法”的中国发明专利申请no.201280068775.1的分案申请。交叉引用本申请要求2011年12月16日提交的美国临时专利申请no.61/576,858的优先权，该临时专利申请整体以引用方式并入本文。
背景技术：
：：各种各样的精妙机制已逐步形成，使得生物体能够获取光以实现多种生存功能，包括产生能量以及识别合适的生存环境。主要种类的光敏蛋白由7-跨膜视网膜紫质组成，这种视网膜紫质存在于整个生物界并发挥各式各样的功能。许多原核生物采用这些蛋白来控制质子梯度并保持膜电位和离子稳态，并且许多运动性微生物已逐步形成基于视蛋白的光感受器以调节鞭毛拍击并因而指导对具有最佳的光合作用光强度的环境的趋光性。由于它们的结构简单(光敏和效应器结构域都在单个基因内编码)和快速的动力学，微生物视蛋白可被视作精确的且模块化的用于引入非光敏细胞以使得能够对特定细胞过程进行快速光学控制的光敏组分。在最近几年中，基于这些和其他光敏蛋白的细胞扰动工具的开发产生了一种称为光遗传学的技术，其涉及遗传控制和光学控制的整合，以实现精确限定的事件在活组织的指定细胞内的功能获得或功能丧失。本领域存在对例如用于控制神经活动的去极化和超极化光遗传学工具的需求。发明概要本公开提供视蛋白，包括具有增强的活性和/或增强的向质膜的运输的变体视蛋白。所述视蛋白可用于也由本公开提供的治疗性和筛选应用。附图简述图1a-f描绘超极化工具的性质。图2a-f描绘超极化工具的性能。图3a-f描绘对得自盐生杜氏藻(dunaliellasalina)的chr的表征。对于图3b：dchr1(seqidno:15)、cchr1(seqidno:16)、cchr2(seqidno:17)、vchr1(seqidno:18)和vchr2(seqidno:19)。图4描绘编码得自盐生杜氏藻(seqidno:20)的chr的核苷酸序列。图5描绘编码得自盐生杜氏藻的chr的核苷酸序列，其为了在哺乳动物细胞中表达而进行了密码子优化(seqidno:21)。图6描绘盐生杜氏藻chr的氨基酸序列(seqidno:22)。图7a-7e描绘示例性变体视蛋白的氨基酸序列：图7a(seqidno:23)；图7b(seqidno:24)；图7c(seqidno:25)；图7d(seqidno:26)和图7e(seqidno:27)。图8a-8c描绘苏打嗜盐菌(halorubrumsodomense)古细菌视紫红质-3的氨基酸序列及其编码核苷酸序列：图8a(seqidno:28)；图8b(seqidno:29)和图8c(seqidno:30)。图9a和9b描绘苏打嗜盐菌菌株tp009视蛋白的氨基酸序列及其编码核苷酸序列：图9a(seqidno:31)和图9b(seqidno:32)。图10a-10c描绘斑点小球腔菌(leptosphaeriamaculans)视蛋白的氨基酸序列及其编码核苷酸序列：图10a(seqidno:33)；图10b(seqidno:34)和图10c(seqidno:35)。定义本文可互换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白”是指任何长度的氨基酸(可包括编码和非编码氨基酸、化学或生物化学修饰或衍生化的氨基酸)的聚合物形式，以及具有修饰肽主链的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白；具有异源和同源前导序列、具有或不具有n端甲硫氨酸残基的融合蛋白；免疫标记蛋白；等等。nh2是指出现在多肽的氨基端的自由氨基。cooh是指多肽的羧基端的自由羧基。与标准多肽命名法一致，使用了j.biol.chem.,243(1969),3552-59。本文可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核苷酸)的聚合物形式。因此，该术语包括但不限于单、双或多链dna或rna、基因组dna、cdna、dna-rna杂交体，或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生化的核苷酸碱基的聚合物。核酸可以是双链、单链的或包含双链或单链序列的部分。本领域的技术人员将认识到，单链(“watson”)的描述也限定了另一条链(“crick”)的序列。在本文中所谓术语“重组核酸”是指非通常存在于自然界中的形式的一般通过用内切酶操纵核酸而最初在体外形成的核酸。因此，线性形式的分离核酸，或在通过连接通常未接合的dna分子而在体外形成的表达载体，出于本发明的目的，两者都被视为重组的。应当理解，一旦制备了重组核酸并将其重新引入宿主细胞或生物体后，它就会非重组地复制，例如，在体内使用宿主细胞的细胞机器，而不是在体外操纵；然而，此类核酸一旦通过重组方式产生后，虽然随后进行非重组地复制，但出于本发明的目的仍被视为重组的。核酸序列同一性(以及氨基酸序列同一性)基于参比序列进行计算，参比序列可以是较大序列的子集，诸如保守基序、编码区、侧翼区，等等。参比序列通常将为至少约18个残基长，更通常至少约30个残基长，并且可以延伸到被比较的整个序列。用于序列分析的算法在本领域中是已知的，诸如在altschul等人(1990),j.mol.biol.215:403-10(使用默认设置，即参数w＝4和t＝17)中所述的blast。术语“遗传修饰”是指向细胞中引入新的核酸(即，细胞的外源性核酸)后在细胞中引起的永久性或暂时性遗传改变。遗传改变(“修饰”)可通过将新的核酸并入宿主细胞的基因组或通过作为染色体外元件而暂时或稳定地维持新的核酸而实现。当细胞为真核细胞时，可通过将核酸引入细胞的基因组而实现永久的遗传改变。合适的遗传修饰方法包括病毒感染、转染、偶联、原生质体融合、电穿孔、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射等等。如本文所用的术语“分离的”意在描述多核苷酸、多肽或细胞，其所处的环境不同于该多核苷酸、多肽或细胞天然所处的环境。分离的遗传修饰宿主细胞可以存在于遗传修饰宿主细胞的混合群体中。分离的多肽在一些实施方案中将是合成的。“合成的多肽”由氨基酸装配而成，并使用本领域技术人员已知的程序在体外化学合成，例如无细胞化学合成。所谓“纯化”是指所关注的化合物(例如多肽)已与其在自然界中伴随的组分分开。“纯化”也可用于指代与其在制造期间(例如，在化学合成中)可伴随的组分分开的所关注的化合物。在一些实施方案中，化合物在以下情况中为基本上纯的：当按重量计至少50％至60％不含天然关联的或制造期间关联的有机分子时。在一些实施方案中，制备物含有按重量计至少75％、至少90％、至少95％或至少99％的所关注的化合物。例如，通过化学合成多肽，或通过纯化和化学修饰的组合可获得基本上纯的多肽。基本上纯的多肽也可以通过例如亲和层析而获得。纯度可通过任何适当的方法测量，例如色谱、质谱、高效液相色谱分析等等。本文可互换使用的术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”是指哺乳动物，包括但不限于鼠科动物(大鼠、小鼠)、非人灵长类、人、犬科动物、猫科动物、有蹄动物(例如马科动物、牛科动物、绵羊、猪科动物、山羊)等等。在一些实施方案中，个体为人。在一些实施方案中，个体为鼠科动物。术语“治疗”、“处理”等在本文用于通常表示取得期望的药理学和/或生理学效应。该效应在完全或部分防止疾病或其症状方面可以是预防性的，和/或在部分或完全稳定或治愈疾病和/或由该疾病引起的不利影响方面可以是治疗性的。如本文所用的“治疗”涵盖对哺乳动物、尤其是人类中的疾病的任何治疗，并包括：(a)防止可能有患病或出现症状倾向但尚未诊断为患有该疾病或出现症状的受试者中的疾病或症状的发生；(b)抑制疾病症状，即阻止其发展；或(c)缓解疾病症状，即，使疾病或症状逆转。“治疗有效量”或“有效量”意指当施用给哺乳动物或其他受试者以治疗疾病时足以实现对该疾病的这种治疗的药剂的量。“治疗有效量”将根据药剂、疾病或病症及其严重性和接受治疗的受试者的年龄、体重等而变化。在进一步描述本发明前，应当理解本发明不限于所述的特定实施方案，因此当然可以发生变化。还应当理解，本文所用的术语只是出于描述特定实施方案的目的，不旨在进行限制，因为本发明的范围将由所附权利要求书加以限制。如果提供了值的范围，则应当理解，介于该范围上限与下限之间的每个居间值(直至下限单位的十分之一，除非上下文另有明确指出)以及该所述范围内的任何其他所述值或居间值均涵盖在本发明的范围内。这些较小范围的上限和下限可独立地包含在所述较小范围内，并且也涵盖在本发明内，受所述范围内任何具体排除的限值的约束。如果所述范围包含所述限值的一个或两个，则排除这些所含限值一者或两者的范围也包括在本发明内。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然类似于或等同于本文所述的那些的任何方法和材料也可用于实践或检验本发明，但现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物以引用方式并入以公开和描述与所引述的出版物相关的方法和/或材料。必须注意，如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一”、“一个/种”和“该”包括多个指代物，除非上下文另有明确指出。因此，例如，提及“变体视蛋白多肽”包括多种这样的多肽，而提到“运输信号”包括提及一个或多个运输信号及其本领域技术人员已知的等同物，等等。还应当注意，可以起草权利要求书以排除任何可选要素。因此，该陈述旨在作为在结合权利要求要素的详述使用诸如“单独”、“仅”等排他性术语时或使用“负”限制时的前置基础。应当认识到，为清楚起见在单独实施方案的背景下描述的本发明的某些特征也可在单个实施方案中以组合方式提供。相反，为简明起见在单个实施方案的背景下描述的本发明的多个特征也可单独地提供或以任何合适的子组合提供。与本发明有关的实施方案的所有组合由本发明具体涵盖并在本文进行公开，正如单独和明确地公开每一种组合一样。此外，各种实施方案及其要素的所有子组合也由本发明具体涵盖并在本文进行公开，正如在本文单独和明确地公开每一种这样的子组合一样。本文讨论的专利公开在本专利申请的提交日期之前仅提供其公开内容。本文中的任何信息都不应理解为承认本发明无权根据先前发明提前此类专利公开。另外，所提供的公开日可能不同于实际的公开日，这可能需要独立地进行确认。具体实施方式本公开提供视蛋白，包括具有增强的活性和/或增强的向质膜的运输的变体视蛋白。所述视蛋白可用于也由本公开提供的治疗性和筛选应用。视蛋白本公开提供视蛋白多肽和核酸(“视蛋白核酸”)，所述核酸包含编码所述视蛋白多肽的核苷酸序列。本公开还提供经遗传修饰的包含视蛋白核酸的宿主细胞。视蛋白多肽在本文也称为“工具”。主题分离视蛋白多肽包含与在图6中所示的氨基酸序列的约500个氨基酸至约550个氨基酸、约550个氨基酸至约600个氨基酸、约600个氨基酸至约650个氨基酸、约650个氨基酸至约700个氨基酸或约700个氨基酸至约720个氨基酸的连续延伸具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。这样的视蛋白可被称为“dchr1”。主题分离视蛋白多肽可以具有约500个氨基酸至约550个氨基酸、约550个氨基酸至约600个氨基酸、约600个氨基酸至约650个氨基酸、约650个氨基酸至约700个氨基酸或约700个氨基酸至720个氨基酸的长度。本公开的分离视蛋白多肽可通过与在图4或图5中所示的核苷酸序列的约1800个核苷酸至约1900个核苷酸、约1900个核苷酸至约2000个核苷酸、约2000个核苷酸至约2100个核苷酸或约2100个核苷酸至2163个核苷酸的连续延伸具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％核苷酸序列同一性的核苷酸序列编码。本公开的分离视蛋白多肽用作光激活质子通道，例如，主题分离视蛋白用作质子泵。在一些实施方案中，主题dchr1视蛋白经修饰以包含er输出序列和/或运输序列，如下文详细描述。因此，在一些实施方案中，主题dchr1视蛋白按从氨基端到羧基端的顺序包含dchr1视蛋白和er输出序列。在一些实施方案中，主题dchr1视蛋白按从氨基端到羧基端的顺序包含dchr1视蛋白、运输序列和er输出序列。在一些实施方案中，主题dchr1视蛋白按从氨基端到羧基端的顺序包含dchr1视蛋白、运输序列、间插序列和er输出序列。合适的er输出序列、运输序列和间插序列在下文详细描述。本公开提供包含主题视蛋白多肽的组合物。主题视蛋白多肽组合物除了主题视蛋白多肽之外还可以包含以下物质中的一种或多种：盐，例如nacl、mgcl2、kcl、mgso4等等；缓冲剂，例如氨丁三醇缓冲剂、n-(2-羟乙基)哌嗪-n'-(2-乙磺酸)(hepes)、2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)、2-(n-吗啉代)乙磺酸钠盐(mes)、3-(n-吗啉代)丙磺酸(mops)、n-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(taps)等等；增溶剂；洗涤剂，例如非离子型洗涤剂，诸如tween-20等等；蛋白酶抑制剂；甘油等等。核酸本公开提供包含编码主题视蛋白的核苷酸序列的核酸。编码主题视蛋白的核苷酸序列可以可操作地连接到一个或多个允许核苷酸序列在预期靶细胞(例如，经遗传修饰以合成编码视蛋白的细胞)中表达的调控元件，诸如启动子和增强子。在一些实施方案中，dchr1编码核苷酸序列具有与在图4中所示的核苷酸序列的约1800个核苷酸至约1900个核苷酸、约1900个核苷酸至约2000个核苷酸、约2000个核苷酸至约2100个核苷酸或约2100个核苷酸至2163个核苷酸的连续延伸至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的核苷酸序列同一性。在一些情况下，对核苷酸序列进行密码子优化以在哺乳动物细胞中表达。合适的启动子和增强子元件在本领域是已知的。对于在细菌细胞中的表达，合适的启动子包括但不限于laci、lacz、t3、t7、gpt、λp和trc。对于在真核细胞中的表达，合适的启动子包括但不限于轻链和/或重链免疫球蛋白基因启动子和增强子元件；巨细胞病毒立即早期启动子；单纯性疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶启动子；早期和晚期sv40启动子；存在于得自逆转录病毒的长末端重复序列中的启动子；小鼠金属硫蛋白i启动子；以及各种本领域已知的组织特异性启动子。在一些实施方案中，例如，对于在酵母细胞中的表达，合适的启动子为组成型启动子，诸如adh1启动子、pgk1启动子、eno启动子、pyk1启动子等等；或调控型启动子，诸如gal1启动子、gal10启动子、adh2启动子、pho5启动子、cup1启动子、gal7启动子、met25启动子、met3启动子、cyc1启动子、his3启动子、adh1启动子、pgk启动子、gapdh启动子、adc1启动子、trp1启动子、ura3启动子、leu2启动子、eno启动子、tp1启动子和aox1(例如，用于毕赤酵母属)。选择合适的载体和启动子在本领域普通技术人员的技术水平内。用于原核宿主细胞的合适的启动子包括但不限于细菌噬菌体t7rna聚合酶启动子；trp启动子；lac操纵子启动子；杂合启动子，例如lac/tac杂合启动子、tac/trc杂合启动子、trp/lac启动子、t7/lac启动子；trc启动子；tac启动子等等；arabad启动子；体内调控启动子，诸如ssag启动子或相关启动子(参见例如美国专利公布no.20040131637)、pagc启动子(pulkkinen和miller,j.bacteriol.,1991:173(1):86-93；alpuche-aranda等人,pnas,1992；89(21):10079-83)、nirb启动子(harborne等人(1992)mol.micro.6:2805-2813)等等(参见例如dunstan等人(1999)infect.immun.67:5133-5141；mckelvie等人(2004)vaccine22:3243-3255；和chatfield等人(1992)biotechnol.10:888-892)；sigma70启动子，例如共有sigma70启动子(参见例如genbank登录号ax798980、ax798961和ax798183)；静止期启动子，例如dps启动子、spv启动子等等；衍生自致病岛spi-2的启动子(参见例如wo96/17951)；acta启动子(参见例如shetron-rama等人(2002)infect.immun.70:1087-1096)；rpsm启动子(参见例如valdivia和falkow(1996).mol.microbiol.22:367)；tet启动子(参见例如hillen,w.和wissmann,a.(1989),saenger,w.和heinemann,u.(编辑),topicsinmolecularandstructuralbiology,protein-nucleicacidinteraction.macmillan,london,uk,第10卷,第143-162页)；sp6启动子(参见例如melton等人(1984)nucl.acidsres.12:7035)等等。用于原核生物(例如大肠杆菌(escherichiacoli))的合适的强启动子包括但不限于trc、tac、t5、t7和pλ。用于细菌宿主细胞的操纵子的非限制性实例包括乳糖启动子操纵子(当与乳糖接触时，laci阻遏蛋白改变构象，从而防止laci阻遏蛋白结合到操纵子)、色氨酸启动子操纵子(当与色氨酸络合时，trpr阻遏蛋白具有结合操纵子的构象；不存在色氨酸时，trpr阻遏蛋白具有不结合到操纵子的构象)和tac启动子操纵子(参见例如deboer等人(1983)proc.natl.acad.sci.u.s.a.80:21-25)。编码主题视蛋白的核苷酸序列可存在于表达载体和/或克隆载体中。表达载体可包括选择性标记、复制起点和允许载体复制和/或维持的其他特征。大量的合适的载体和启动子是本领域技术人员已知的；许多均可商购获得以产生主题重组构建体。以举例的方式提供下列载体。细菌：pbs、phagescript、psix174、pbluescriptsk、pbsks、pnh8a、pnh16a、pnh18a、pnh46a(stratagene,lajolla,calif.,usa)、ptrc99a、pkk223-3、pkk233-3、pdr540和prit5(pharmacia,uppsala,sweden)。真核：pwlneo、psv2cat、pog44、pxr1、psg(stratagene)psvk3、pbpv、pmsg和psvl(pharmacia)。表达载体一般具有方便的位于启动子序列附近的限制性位点以便于编码所关注蛋白(例如视蛋白)的核酸序列的插入。在表达宿主中可以存在可操作的选择性标记。合适的表达载体包括但不限于病毒载体(例如基于牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒(参见例如li等人,investopthalmolvissci35:25432549,1994；borras等人,genether6:515524,1999；li和davidson,pnas92:77007704,1995；sakamoto等人,hgenether5:10881097,1999；wo94/12649；wo93/03769；wo93/19191；wo94/28938；wo95/11984和wo95/00655)、腺相关病毒(参见例如ali等人,humgenether9:8186,1998；flannery等人,pnas94:69166921,1997；bennett等人,investopthalmolvissci38:28572863,1997；jomary等人,genether4:683690,1997；rolling等人,humgenether10:641648,1999；ali等人,hummolgenet5:591594,1996；srivastava,wo93/09239；samulski等人,j.vir.(1989)63:3822-3828；mendelson等人,virol.(1988)166:154-165；和flotte等人,pnas(1993)90:10613-10617)、sv40、单纯性疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒(参见例如miyoshi等人,pnas94:1031923,1997；takahashi等人,jvirol73:78127816,1999)的载体)；逆转录病毒载体(例如鼠白血病病毒、脾坏死病毒和衍生自逆转录病毒的载体，诸如劳氏肉瘤病毒、harvey肉瘤病毒、禽白血病病毒、人类免疫缺陷病毒、骨髓增殖肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒)等等。本文还提供包含编码主题视蛋白或其任何变体的主题多核苷酸的重组载体。主题重组载体还包括含有编码rna(例如mrna)的多核苷酸的载体，所述rna在由载体的多核苷酸转录时将导致主题视蛋白在靶动物细胞的质膜上蓄积。可以使用的载体包括但不限于慢病毒、hsv、腺病毒和腺相关病毒(aav)载体。慢病毒包括但不限于hiv-1、hiv-2、siv、fiv和eiav。慢病毒可以通过其他病毒的包膜蛋白假型化，所述其他病毒包括但不限于vsv、狂犬病病毒、mo-mlv、杆状病毒和埃博拉病毒。这样的载体可采用本领域的标准方法制备。在一些实施方案中，载体为重组aav载体。aav是相对较小的dna病毒，其可以稳定和位点特异性方式整合到它们所感染的细胞的基因组中。它们能够感染一大系列的细胞而不对细胞生长、形态或分化产生任何影响，并且它们似乎并不涉及人体病理学。aav基因组已被克隆、测序及表征。aav含有大约4700碱基并在每个末端包含约145个碱基的反向末端重复序列(itr)区域，其作为病毒的复制起点。该基因组的其余被分成两个带有衣壳化功能的重要区域：包含涉及病毒复制和病毒基因表达的rep基因的基因组左边部分；以及包含编码病毒衣壳蛋白的cap基因的基因组右边部分。aav载体可采用本领域的标准方法制备。任何血清型的腺相关病毒均是合适的(参见例如blacklow,“parvovirusesandhumandisease",第165-174页,j.r.pattison编辑(1988)；rose,comprehensivevirology3:1,1974；p.tattersall,“theevolutionofparvovirustaxonomy",parvoviruses(jrkerr,sfcotmore.mebloom,rmlinden,crparrish编辑)第5-14页,hudderarnold,london,uk(2006)；以及debowles,jerabinowitz,rjsamulski“thegenusdependovirus"(jrkerr,sfcotmore.mebloom,rmlinden,crparrish编辑)第15-23页,hudderarnold,london,uk(2006)，它们的公开内容据此均整体以引用方式并入本文)。用于纯化载体的方法可见于例如美国专利no.6566118、6989264和6995006以及题为“methodsforgeneratinghightiterhelper-freepreparationofrecombinantaavvectors”的国际专利申请公布no.wo/1999/011764，它们的公开内容整体以引用方式并入本文。杂合载体的制备在例如pct申请no.pct/us2005/027091中有所描述，该申请的公开内容整体以引用方式并入本文。用于体外和体内转运基因的衍生自aav的载体的使用已有描述(参见例如国际专利申请公布no.wo91/18088和wo93/09239；美国专利no.4,797,368、6,596,535和5,139,941，以及欧洲专利no.0488528，它们均整体以引用方式并入本文)。这些专利公布描述了其中rep和/或cap基因缺失并被所关注的基因替换的各种来源于aav的构建体，以及这些构建体在体外(进入培养的细胞中)或体内(直接进入生物体)转运所关注的基因的用途。复制缺陷重组aav可通过将以下质粒共转染进被人类辅助病毒(例如腺病毒)感染的细胞系而制备：所含的所关注核酸序列的侧翼为两个aav反向末端重复序列(itr)区域的质粒，和携带aav衣壳化基因(rep和cap基因)的质粒。然后通过标准技术纯化所产生的aav重组体。在一些实施方案中，主题重组载体被衣壳化到病毒粒子(例如包括但不限于aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav13、aav14、aav15和aav16的aav病毒粒子)中。因此，本公开包括含有本文所述的任何载体的重组病毒粒子(因其包含重组多核苷酸而为重组的)。产生这样的粒子的方法是本领域已知的，并在美国专利no.6,596,535中有所描述。在一些情况下，主题视蛋白核酸包含编码视蛋白的核苷酸序列，其中该核苷酸序列可操作地连接到神经元特异性转录控制元件。神经元特异性启动子和其他控制元件(例如增强子)是本领域已知的。合适的神经元特异控制序列包括但不限于神经元特异性烯醇酶(nse)启动子(参见例如emblhseno2、x51956；另见美国专利no.6,649,811、美国专利no.5,387,742)、芳族氨基酸脱羧酶(aadc)启动子、神经丝启动子(参见例如genbankhumnfl、l04147)、突触蛋白启动子(参见例如genbankhumsynib、m55301)、thy-1启动子(参见例如chen等人(1987)cell51:7-19；和llewellyn等人(2010)nat.med.16:1161)、5-羟色胺受体启动子(参见例如genbanks62283)、酪氨酸羟化酶启动子(th)(参见例如nucl.acids.res.15:2363-2384(1987)和neuron6:583-594(1991))、gnrh启动子(参见例如radovick等人,proc.natl.acad.sci.usa88:3402-3406(1991))、l7启动子(参见例如oberdick等人,science248:223-226(1990))、dnmt启动子(参见例如bartge等人,proc.natl.acad.sci.usa85:3648-3652(1988))、脑啡肽启动子(参见例如comb等人,emboj.17:3793-3805(1988))、髓鞘碱性蛋白(mbp)启动子、cmv增强子/血小板衍生生长因子-β启动子(参见例如liu等人(2004)genetherapy11:52-60)、运动神经元特异性基因hb9启动子(参见例如美国专利no.7,632,679和lee等人(2004)development131:3295-3306)以及ca(2+)-钙调蛋白依赖性蛋白激酶ii(camkiiα)启动子的α亚基(参见例如mayford等人(1996)proc.natl.acad.sci.usa93:13250)。宿主细胞本公开提供分离的经遗传修饰的细胞(例如体外细胞)，其通过主题核酸进行了遗传修饰。在一些实施方案中，主题分离的经遗传修饰的宿主细胞可产生本公开的视蛋白。合适的宿主细胞包括真核宿主细胞，诸如哺乳动物细胞、昆虫宿主细胞、酵母细胞；原核细胞，诸如细菌细胞。将主题核酸引入宿主细胞可例如通过磷酸钙沉淀、deae葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、电穿孔或其他已知的方法实现。合适的哺乳动物细胞包括原代细胞和永生化细胞系。在一些情况下，哺乳动物细胞为神经元，例如非永生化(原代)神经元。在其他情况下，哺乳动物细胞是永生化细胞系。合适的哺乳动物细胞系包括人类细胞系、非人灵长类动物细胞系、啮齿类动物(例如小鼠、大鼠)细胞系等等。合适的哺乳动物细胞系包括但不限于hela细胞(例如美国典型培养物保藏中心(atcc)no.ccl-2)、cho细胞(例如atccno.crl9618、ccl61、crl9096)、293细胞(例如atccno.crl-1573)、vero细胞、nih3t3细胞(例如atccno.crl-1658)、huh-7细胞、bhk细胞(例如atccno.ccl10)、pc12细胞(atccno.crl1721)、cos细胞、cos-7细胞(atccno.crl1651)、rat1细胞、小鼠l细胞(atccno.ccli.3)、人胚肾(hek)细胞(atccno.crl1573)、hlhepg2细胞等等。在一些实施方案中，该细胞为神经元细胞或神经元样细胞。该细胞可以是人类、非人灵长类动物、小鼠或大鼠来源的或者源自除人类、非人灵长类动物、小鼠或大鼠之外的哺乳动物。合适的细胞系包括但不限于人胶质瘤细胞系，例如svgp12(atcccrl-8621)、ccf-sttg1(atcccrl-1718)、sw1088(atcchtb-12)、sw1783(atcchtb-13)、lln-18(atcccrl-2610)、lnzta3wt4(atcccrl-11543)、lnzta3wt11(atcccrl-11544)、u-138mg(atcchtb-16)、u-87mg(atcchtb-14)、h4(atcchtb-148)和ln-229(atcccrl-2611)；人成神经管细胞瘤源细胞系，例如d342med(atcchtb-187)、daoy(atcchtb-186)、d283med(atcchtb-185)；人肿瘤源神经元样细胞，例如pfsk-1(atcccrl-2060)、sk-n-dz(atcccrl-2149)、sk-n-as(atcccrl-2137)、sk-n-fi(atcccrl-2142)、imr-32(atccccl-127)等等；小鼠神经元细胞系，例如bc3h1(atcccrl-1443)、eoc1(atcccrl-2467)、c8-d30(atcccrl-2534)、c8-s(atcccrl-2535)、neuro-2a(atccccl-131)、nb41a3(atccccl-147)、sw10(atcccrl-2766)、ng108-15(atcchb-12317)；大鼠神经元细胞系，例如pc-12(atcccrl-1721)、ctxtna2(atcccrl-2006)、c6(atccccl-107)、f98(atcccrl-2397)、rg2(atcccrl-2433)、b35(atcccrl-2754)、r3(atcccrl-2764)、scp(atcccrl-1700)、oa1(atcccrl-6538)。合适的酵母细胞包括但不限于巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)、芬兰毕赤酵母(pichiafinlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(pichiatrehalophila)、pichiakoclamae、膜醭毕赤酵母(pichiamembranaefaciens)、pichiaopuntiae、耐热毕赤氏酵母(pichiathermotolerans)、柳毕赤酵母(pichiasalictaria)、pichiaguercuum、皮杰普氏毕赤氏酵母(pichiapijperi)、具柄毕赤氏酵母(pichiastiptis)、甲醇毕赤酵母(pichiamethanolica)、毕赤酵母种(pichiasp.)、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、酵母属种(saccharomycessp.)、多形汉逊酵母(hansenulapolymorpha)、克鲁维酵母属种(kluyveromycessp.)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyceslactis)、白色念珠菌(candidaalbicans)、构巢曲霉(aspergillusnidulans)、黑曲霉(aspergillusniger)、米曲霉(aspergillusoryzae)、里氏木霉(trichodermareesei)、chrysosporiumlucknowense、镰孢属种(fusariumsp.)、禾谷链孢(fusariumgramineum)、fusariumvenenatum、粗糙脉孢菌(neurosporacrassa)、莱茵衣藻等等。合适的原核细胞包括但不限于大肠杆菌、乳杆菌属种(lactobacillussp.)、沙门氏菌属种(salmonellasp.)、志贺氏菌属种(shigellasp.)等的多种实验室菌株的任一者。参见例如carrier等人(1992)j.immunol.148:1176-1181；美国专利no.6,447,784；和sizemore等人(1995)science270:299-302。可用于本发明的沙门氏菌菌株的实例包括但不限于伤寒沙门氏菌(salmonellatyphi)和鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium)。合适的志贺氏菌菌株包括但不限于弗氏志贺菌(shigellaflexneri)、宋内志贺氏菌(shigellasonnei)和痢疾志贺氏菌(shigelladisenteriae)。通常，实验室菌株是非致病性菌株。其他合适的细菌的非限制性实例包括但不限于枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、恶臭假单胞菌(pseudomonaspudita)、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、迈氏假单胞菌(pseudomonasmevalonii)、类球红细菌(rhodobactersphaeroides)、荚膜红细菌(rhodobactercapsulatus)、深红红螺菌(rhodospirillumrubrum)、红球菌种(rhodococcussp.)等等。在一些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌。具有增强的膜运输的变体视蛋白本发明提供具有改善的膜运输性质的变体视蛋白。本公开还提供编码变体视蛋白的核酸。具体地讲，主题变体视蛋白为包含内质网(er)输出序列、运输序列(ts)或er输出序列和ts两者的超极化视蛋白。er输出序列和/或ts的存在提供增强的膜(例如质膜)定位和er输出。在一些情况下，主题变体视蛋白包含一种或多种可设置在ts与er之间和/或视蛋白与ts之间的额外的氨基酸。因此，在一些情况下，变体视蛋白按从氨基端到羧基端的顺序包含视蛋白多肽、运输序列和er输出序列。超极化视蛋白适于包含在主题变体视蛋白中的视蛋白氨基酸序列包括例如与在图8a中所示的氨基酸序列(苏打嗜盐菌古细菌视紫红质-3)的约200个氨基酸至约220个氨基酸、约220个氨基酸至230个氨基酸、约230个氨基酸至约240个氨基酸或约240个氨基酸至257个氨基酸的连续延伸具有至少约85％或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。适于包含在主题变体视蛋白中的视蛋白氨基酸序列包括例如与在图9a中所示的氨基酸序列(苏打嗜盐菌菌株tp009古细菌视紫红质)的约200个氨基酸至约220个氨基酸、约220个氨基酸至230个氨基酸、约230个氨基酸至约240个氨基酸或约240个氨基酸至257个氨基酸的连续延伸具有至少约85％或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。适于包含在主题变体视蛋白中的视蛋白氨基酸序列包括例如在图10a中所示的氨基酸序列(斑点小球腔菌视蛋白)的约200个氨基酸至约225个氨基酸、约225个氨基酸至250个氨基酸、约250个氨基酸至约275个氨基酸、约275个氨基酸至约300个氨基酸或约300个氨基酸至313个氨基酸的连续延伸具有至少约85％或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。内质网输出序列适用于本公开的修饰视蛋白的内质网(er)输出序列包括例如vxxsl(其中x为任何氨基酸)(例如vkesl(seqidno:1)、vlgsl(seqidno:2)等)；nansfcyenevaltsk(seqidno:3)；fxyene(seqidno:4)(其中x为任何氨基酸)，例如fcyenev(seqidno:5)；等等。er输出序列的长度可为约5个氨基酸至约25个氨基酸，例如约5个氨基酸至约10个氨基酸、约10个氨基酸至约15个氨基酸、约15个氨基酸至约20个氨基酸或约20个氨基酸至约25个氨基酸。运输序列适用于本公开的修饰视蛋白的运输序列包含与诸如以下之一的氨基酸序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：1)hchr2的信号肽(例如mdyggalsavgrellfvtnpvvvngs(seqidno:6))2)神经元烟碱型乙酰胆碱受体的β2亚单位信号肽(例如maghsnsmalfsfsllwlcsgvlgtef(seqidno:7))；3)烟碱型乙酰胆碱受体信号序列(例如mglralmlwllaaaglvreslqg(seqidno:8))；4)烟碱型乙酰胆碱受体信号序列(例如mrgtplllvvslfsllqd(seqidno:9))；5)人内向整流钾通道kir2.1的信号序列(例如ksritsegeyipldqidinv(seqidno:10))。运输序列的长度可为约10个氨基酸至约50个氨基酸，例如约10个氨基酸至约20个氨基酸、约20个氨基酸至约30个氨基酸、约30个氨基酸至约40个氨基酸或约40个氨基酸至约50个氨基酸。附加序列如上所述，主题变体视蛋白除了视蛋白、ts和er输出序列外还包含一种或多种氨基酸。例如，在一些实施方案中，主题变体视蛋白以从氨基端到羧基端的顺序包含：视蛋白、ts、间插氨基酸序列和er输出信号序列。合适的间插氨基酸序列包括例如接头、表位标签、荧光蛋白、允许容易纯化的肽、可裂解的连接肽等等。可包含在主题变体视蛋白中的合适的荧光蛋白包括但不限于得自维多利亚多管水母(aequoriavictoria)的绿色荧光蛋白或其突变体或衍生物，例如，如美国专利no.6,066,476、6,020,192、5,985,577、5,976,796、5,968,750、5,968,738、5,958,713、5,919,445、5,874,304中所述；例如增强的gfp，可商购获得的许多这样的gfp，例如得自clontech,inc.；红色荧光蛋白；黄色荧光蛋白；mcherry；得自珊瑚虫种(anthozoanspecies)的多种荧光有色蛋白中的任一种，如在例如matz等人(1999)naturebiotechnol.17:969-973中所述，等等。示例性变体视蛋白在一些实施方案中，主题变体视蛋白以从氨基端到羧基端的顺序包含：a)包含与图8a所示的氨基酸序列(苏打嗜盐菌古细菌视紫红质-3)的约200个氨基酸至约220个氨基酸、约220个氨基酸至约230个氨基酸、约230个氨基酸至约240个氨基酸或约240个氨基酸至257个氨基酸的连续延伸具有至少约85％或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的超极化视蛋白；和b)er输出序列。例如，er输出序列选自vxxsl(其中x为任何氨基酸)(例如vkesl(seqidno:1)、vlgsl(seqidno:2)、vlgsl(seqidno:2)等)；nansfcyenevaltsk(seqidno:3)；和fxyene(seqidno:4)(其中x为任何氨基酸)，例如fcyenev(seqidno:5)。在一些实施方案中，主题变体视蛋白以从氨基端到羧基端的顺序包含：a)包含与图8a所示的氨基酸序列(苏打嗜盐菌古细菌视紫红质-3)的约200个氨基酸至约220个氨基酸、约220个氨基酸至约230个氨基酸、约230个氨基酸至约240个氨基酸或约240个氨基酸至257个氨基酸的连续延伸具有至少约85％或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的超极化视蛋白；b)荧光序列；和c)er输出序列。例如，er输出序列选自vxxsl(其中x为任何氨基酸)(例如vkesl(seqidno:1)、vlgsl(seqidno:2)、vlgsl(seqidno:2)等)；nansfcyenevaltsk(seqidno:3)；和fxyene(seqidno:4)(其中x为任何氨基酸)，例如fcyenev(seqidno:5)。在一些实施方案中，主题变体视蛋白包含与图7a所示的氨基酸序列具有至少约85％或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，主题变体视蛋白以从氨基端到羧基端的顺序包含：a)包含与图8a所示的氨基酸序列(苏打嗜盐菌古细菌视紫红质-3)的约200个氨基酸至约220个氨基酸、约220个氨基酸至约230个氨基酸、约230个氨基酸至约240个氨基酸或约240个氨基酸至257个氨基酸的连续延伸具有至少约85％或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的超极化视蛋白；b)ts序列；和c)er输出序列。例如，ts序列可包含与选自以下的氨基酸序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：mdyggalsavgrellfvtnpvvvngs(seqidno:6)、maghsnsmalfsfsllwlcsgvlgtef(seqidno:7)、mglralmlwllaaaglvreslqg(seqidno:8)、mrgtplllvvslfsllqd(seqidno:9)和ksritsegeyipldqidinv(seqidno:10)。例如，er输出序列选自vxxsl(其中x为任何氨基酸)(例如vkesl(seqidno:1)、vlgsl(seqidno:2)等)；nansfcyenevaltsk(seqidno:3)；和fxyene(seqidno:4)(其中x为任何氨基酸)，例如fcyenev(seqidno:5)。在一些实施方案中，主题变体视蛋白以从氨基端到羧基端的顺序包含：a)包含与图8a所示的氨基酸序列(苏打嗜盐菌古细菌视紫红质-3)的约200个氨基酸至约220个氨基酸、约220个氨基酸至约230个氨基酸、约230个氨基酸至约240个氨基酸或约240个氨基酸至257个氨基酸的连续延伸具有至少约85％或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的超极化视蛋白；b)ts序列；c)荧光蛋白；和d)er输出序列。例如，ts序列可包含与选自以下的氨基酸序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：mdyggalsavgrellfvtnpvvvngs(seqidno:6)、maghsnsmalfsfsllwlcsgvlgtef(seqidno:7)、mglralmlwllaaaglvreslqg(seqidno:8)、mrgtplllvvslfsllqd(seqidno:9)和ksritsegeyipldqidinv(seqidno:10)。例如，er输出序列选自vxxsl(其中x为任何氨基酸)(例如vkesl(seqidno:1)、vlgsl(seqidno:2)等)；nansfcyenevaltsk(seqidno:3)；和fxyene(seqidno:4)(其中x为任何氨基酸)，例如fcyenev(seqidno:5)。在一些实施方案中，主题变体视蛋白包含与图7b所示的氨基酸序列具有至少约85％或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，主题变体视蛋白以从氨基端到羧基端的顺序包含：a)包含与图9a所示的氨基酸序列(苏打嗜盐菌菌株tp009视蛋白)的约200个氨基酸至约220个氨基酸、约220个氨基酸至约230个氨基酸、约230个氨基酸至约240个氨基酸或约240个氨基酸至257个氨基酸的连续延伸具有至少约85％或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的超极化视蛋白；b)ts序列；和c)er输出序列。例如，ts序列可包含与选自以下的氨基酸序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：mdyggalsavgrellfvtnpvvvngs(seqidno:6)、maghsnsmalfsfsllwlcsgvlgtef(seqidno:7)、mglralmlwllaaaglvreslqg(seqidno:8)、mrgtplllvvslfsllqd(seqidno:9)和ksritsegeyipldqidinv(seqidno:10)。例如，er输出序列选自vxxsl(其中x为任何氨基酸)(例如vkesl(seqidno:1)、vlgsl(seqidno:2)等)；nansfcyenevaltsk(seqidno:3)；和fxyene(seqidno:4)(其中x为任何氨基酸)，例如fcyenev(seqidno:5)。在一些实施方案中，主题变体视蛋白以从氨基端到羧基端的顺序包含：a)包含与图9a所示的氨基酸序列(苏打嗜盐菌菌株tp009视蛋白)的约200个氨基酸至约220个氨基酸、约220个氨基酸至约230个氨基酸、约230个氨基酸至约240个氨基酸或约240个氨基酸至257个氨基酸的连续延伸具有至少约85％或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的超极化视蛋白；b)ts序列；c)荧光蛋白；和d)er输出序列。例如，ts序列可包含与选自以下的氨基酸序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：mdyggalsavgrellfvtnpvvvngs(seqidno:6)、maghsnsmalfsfsllwlcsgvlgtef(seqidno:7)、mglralmlwllaaaglvreslqg(seqidno:8)、mrgtplllvvslfsllqd(seqidno:9)和ksritsegeyipldqidinv(seqidno:10)。例如，er输出序列选自vxxsl(其中x为任何氨基酸)(例如vkesl(seqidno:1)、vlgsl(seqidno:2)等)；nansfcyenevaltsk(seqidno:3)；和fxyene(seqidno:4)(其中x为任何氨基酸)，例如fcyenev(seqidno:5)。在一些实施方案中，主题变体视蛋白包含与图7c所示的氨基酸序列具有至少约85％或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，主题变体视蛋白以从氨基端到羧基端的顺序包含：a)包含与图10a所示的氨基酸序列(斑点小球腔菌视蛋白)的约200个氨基酸至约225个氨基酸、约225个氨基酸至约250个氨基酸、约250个氨基酸至约275个氨基酸、约275个氨基酸至约300个氨基酸或约300个氨基酸至313个氨基酸的连续延伸具有至少约85％或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的超极化视蛋白；和b)er输出序列。例如，er输出序列选自vxxsl(其中x为任何氨基酸)(例如vkesl(seqidno:1)、vlgsl(seqidno:2)等)；nansfcyenevaltsk(seqidno:3)；和fxyene(seqidno:4)(其中x为任何氨基酸)，例如fcyenev(seqidno:5)。在一些实施方案中，主题变体视蛋白以从氨基端到羧基端的顺序包含：a)包含与图10a所示的氨基酸序列(斑点小球腔菌视蛋白)的约200个氨基酸至约225个氨基酸、约225个氨基酸至约250个氨基酸、约250个氨基酸至约275个氨基酸、约275个氨基酸至约300个氨基酸或约300个氨基酸至313个氨基酸的连续延伸具有至少约85％或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的超极化视蛋白；b)荧光蛋白；和c)er输出序列。例如，er输出序列选自vxxsl(其中x为任何氨基酸)(例如vkesl(seqidno:1)、vlgsl(seqidno:2)等)；nansfcyenevaltsk(seqidno:3)；和fxyene(seqidno:4)(其中x为任何氨基酸)，例如fcyenev(seqidno:5)。在一些实施方案中，主题变体视蛋白包含与图7d所示的氨基酸序列具有至少约85％或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，主题变体视蛋白以从氨基端到羧基端的顺序包含：a)包含与图10a所示的氨基酸序列(斑点小球腔菌视蛋白)的约200个氨基酸至约225个氨基酸、约225个氨基酸至约250个氨基酸、约250个氨基酸至约275个氨基酸、约275个氨基酸至约300个氨基酸或约300个氨基酸至313个氨基酸的连续延伸具有至少约85％或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的超极化视蛋白；b)ts序列；和c)er输出序列。例如，ts序列可包含与选自以下的氨基酸序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：mdyggalsavgrellfvtnpvvvngs(seqidno:6)、maghsnsmalfsfsllwlcsgvlgtef(seqidno:7)、mglralmlwllaaaglvreslqg(seqidno:8)、mrgtplllvvslfsllqd(seqidno:9)和ksritsegeyipldqidinv(seqidno:10)。例如，er输出序列选自vxxsl(其中x为任何氨基酸)(例如vkesl(seqidno:1)、vlgsl(seqidno:2)等)；nansfcyenevaltsk(seqidno:3)；和fxyene(seqidno:4)(其中x为任何氨基酸)，例如fcyenev(seqidno:5)。在一些实施方案中，主题变体视蛋白以从氨基端到羧基端的顺序包含：a)包含与图10a所示的氨基酸序列(斑点小球腔菌视蛋白)的约200个氨基酸至约225个氨基酸、约225个氨基酸至约250个氨基酸、约250个氨基酸至约275个氨基酸、约275个氨基酸至约300个氨基酸或约300个氨基酸至313个氨基酸的连续延伸具有至少约85％或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的超极化视蛋白；b)ts序列；c)荧光蛋白；和d)er输出序列。例如，ts序列可包含与选自以下的氨基酸序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：mdyggalsavgrellfvtnpvvvngs(seqidno:6)、maghsnsmalfsfsllwlcsgvlgtef(seqidno:7)、mglralmlwllaaaglvreslqg(seqidno:8)、mrgtplllvvslfsllqd(seqidno:9)和ksritsegeyipldqidinv(seqidno:10)。例如，er输出序列选自vxxsl(其中x为任何氨基酸)(例如vkesl(seqidno:1)、vlgsl(seqidno:2)等)；nansfcyenevaltsk(seqidno:3)；和fxyene(seqidno:4)(其中x为任何氨基酸)，例如fcyenev(seqidno:5)。在一些实施方案中，主题变体视蛋白包含与图7e所示的氨基酸序列具有至少约85％或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。核酸本公开提供包含编码主题变体视蛋白的核苷酸序列的核酸。编码主题变体视蛋白的核苷酸序列可以可操作地连接到一个或多个允许核苷酸序列在预期靶细胞(例如，经遗传修饰以合成编码变体视蛋白的细胞)中表达的调控元件，诸如启动子和增强子。在一些情况下，编码变体视蛋白的核苷酸序列可操作地连接到允许神经元特异性表达的转录控制元件。在一些情况下，编码主题变体视蛋白的核苷酸序列为在哺乳动物细胞中表达而密码子优化。合适的启动子和增强子元件在本领域是已知的。对于在细菌细胞中的表达，合适的启动子包括但不限于laci、lacz、t3、t7、gpt、λp和trc。对于在真核细胞中的表达，合适的启动子包括但不限于轻链和/或重链免疫球蛋白基因启动子和增强子元件；巨细胞病毒立即早期启动子；单纯性疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶启动子；早期和晚期sv40启动子；存在于得自逆转录病毒的长末端重复序列中的启动子；小鼠金属硫蛋白i启动子；以及各种本领域已知的组织特异性启动子。在一些实施方案中，例如，对于在酵母细胞中的表达，合适的启动子为组成型启动子，诸如adh1启动子、pgk1启动子、eno启动子、pyk1启动子等等；或调控型启动子，诸如gal1启动子、gal10启动子、adh2启动子、pho5启动子、cup1启动子、gal7启动子、met25启动子、met3启动子、cyc1启动子、his3启动子、adh1启动子、pgk启动子、gapdh启动子、adc1启动子、trp1启动子、ura3启动子、leu2启动子、eno启动子、tp1启动子和aox1(例如，用于毕赤酵母属)。选择合适的载体和启动子在本领域普通技术人员的技术水平内。用于原核宿主细胞的合适的启动子包括但不限于细菌噬菌体t7rna聚合酶启动子；trp启动子；lac操纵子启动子；杂合启动子，例如lac/tac杂合启动子、tac/trc杂合启动子、trp/lac启动子、t7/lac启动子；trc启动子；tac启动子等等；arabad启动子；体内调控启动子，诸如ssag启动子或相关启动子(参见例如美国专利公布no.20040131637)、pagc启动子(pulkkinen和miller,j.bacteriol.,1991:173(1):86-93；alpuche-aranda等人,pnas,1992；89(21):10079-83)、nirb启动子(harborne等人(1992)mol.micro.6:2805-2813)等等(参见例如dunstan等人(1999)infect.immun.67:5133-5141；mckelvie等人(2004)vaccine22:3243-3255；和chatfield等人(1992)biotechnol.10:888-892)；sigma70启动子，例如共有sigma70启动子(参见例如genbank登录号ax798980、ax798961和ax798183)；静止期启动子，例如dps启动子、spv启动子等等；衍生自致病岛spi-2的启动子(参见例如wo96/17951)；acta启动子(参见例如shetron-rama等人(2002)infect.immun.70:1087-1096)；rpsm启动子(参见例如valdivia和falkow(1996).mol.microbiol.22:367)；tet启动子(参见例如hillen,w.和wissmann,a.(1989),saenger,w.和heinemann,u.(编辑),topicsinmolecularandstructuralbiology,protein-nucleicacidinteraction.macmillan,london,uk,第10卷,第143-162页)；sp6启动子(参见例如melton等人(1984)nucl.acidsres.12:7035)等等。用于原核生物(例如大肠杆菌(escherichiacoli))的合适的强启动子包括但不限于trc、tac、t5、t7和pλ。用于细菌宿主细胞的操纵子的非限制性实例包括乳糖启动子操纵子(当与乳糖接触时，laci阻遏蛋白改变构象，从而防止laci阻遏蛋白结合到操纵子)、色氨酸启动子操纵子(当与色氨酸络合时，trpr阻遏蛋白具有结合操纵子的构象；不存在色氨酸时，trpr阻遏蛋白具有不结合到操纵子的构象)和tac启动子操纵子(参见例如deboer等人(1983)proc.natl.acad.sci.u.s.a.80:21-25)。编码主题视蛋白的核苷酸序列可存在于表达载体和/或克隆载体中。表达载体可包括选择性标记、复制起点和允许载体复制和/或维持的其他特征。大量的合适的载体和启动子是本领域技术人员已知的；许多均可商购获得以产生主题重组构建体。以举例的方式提供下列载体。细菌：pbs、phagescript、psix174、pbluescriptsk、pbsks、pnh8a、pnh16a、pnh18a、pnh46a(stratagene,lajolla,calif.,usa)、ptrc99a、pkk223-3、pkk233-3、pdr540和prit5(pharmacia,uppsala,sweden)。真核：pwlneo、psv2cat、pog44、pxr1、psg(stratagene)psvk3、pbpv、pmsg和psvl(pharmacia)。表达载体一般具有方便的位于启动子序列附近的限制性位点以便于编码所关注蛋白(例如变体视蛋白)的核酸序列的插入。在表达宿主中可以存在可操作的选择性标记。合适的表达载体包括但不限于病毒载体(例如基于牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒(参见例如li等人,investopthalmolvissci35:25432549,1994；borras等人,genether6:515524,1999；li和davidson,pnas92:77007704,1995；sakamoto等人,hgenether5:10881097,1999；wo94/12649；wo93/03769；wo93/19191；wo94/28938；wo95/11984和wo95/00655)、腺相关病毒(参见例如ali等人,humgenether9:8186,1998；flannery等人,pnas94:69166921,1997；bennett等人,investopthalmolvissci38:28572863,1997；jomary等人,genether4:683690,1997；rolling等人,humgenether10:641648,1999；ali等人,hummolgenet5:591594,1996；srivastava,wo93/09239；samulski等人,j.vir.(1989)63:3822-3828；mendelson等人,virol.(1988)166:154-165；和flotte等人,pnas(1993)90:10613-10617)、sv40、单纯性疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒(参见例如miyoshi等人,pnas94:1031923,1997；takahashi等人,jvirol73:78127816,1999)的载体；逆转录病毒载体(例如鼠白血病病毒、脾坏死病毒和衍生自逆转录病毒的载体，诸如劳氏肉瘤病毒、harvey肉瘤病毒、禽白血病病毒、人类免疫缺陷病毒、骨髓增殖肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒)等等。本文还提供包含编码主题变体视蛋白或其任何变体的主题多核苷酸的重组载体。主题重组载体还包括含有编码rna(例如mrna)的多核苷酸的载体，所述rna在由载体的多核苷酸转录时将导致主题视蛋白在靶动物细胞的质膜上蓄积。可以使用的载体包括但不限于慢病毒、hsv、腺病毒和腺相关病毒(aav)载体。慢病毒包括但不限于hiv-1、hiv-2、siv、fiv和eiav。慢病毒可以通过其他病毒的包膜蛋白假型化，所述其他病毒包括但不限于vsv、狂犬病病毒、mo-mlv、杆状病毒和埃博拉病毒。这样的载体可采用本领域的标准方法制备。在一些实施方案中，载体为重组aav载体。aav是相对较小的dna病毒，其可以稳定和位点特异性方式整合到它们所感染的细胞的基因组中。它们能够感染宽范围的细胞而不对细胞生长、形态或分化产生任何影响，并且它们似乎并不涉及人体病理学。aav基因组已被克隆、测序及表征。aav含有大约4700碱基并在每个末端包含约145个碱基的反向末端重复序列(itr)区域，其作为病毒的复制起点。该基因组的其余被分成两个带有衣壳化功能的重要区域：包含涉及病毒复制和病毒基因表达的rep基因的基因组左边部分；以及包含编码病毒衣壳蛋白的cap基因的基因组右边部分。aav载体可采用本领域的标准方法制备。任何血清型的腺相关病毒均是合适的(参见例如blacklow,“parvovirusesandhumandisease",第165-174页,j.r.pattison编辑(1988)；rose,comprehensivevirology3:1,1974；p.tattersall,“theevolutionofparvovirustaxonomy",parvoviruses(jrkerr,sfcotmore.mebloom,rmlinden,crparrish编辑)第5-14页,hudderarnold,london,uk(2006)；以及debowles,jerabinowitz,rjsamulski“thegenusdependovirus"(jrkerr,sfcotmore.mebloom,rmlinden,crparrish编辑)第15-23页,hudderarnold,london,uk(2006)，它们的公开内容据此均整体以引用方式并入本文)。用于纯化载体的方法可见于例如美国专利no.6566118、6989264和6995006以及题为“methodsforgeneratinghightiterhelper-freepreparationofrecombinantaavvectors”的国际专利申请公布no.wo/1999/011764，它们的公开内容整体以引用方式并入本文。杂合载体的制备在例如pct申请no.pct/us2005/027091中有所描述，该申请的公开内容整体以引用方式并入本文。用于体外和体内转运基因的衍生自aav的载体的使用已有描述(参见例如国际专利申请公布no.wo91/18088和wo93/09239；美国专利no.4,797,368、6,596,535和5,139,941，以及欧洲专利no.0488528，它们均整体以引用方式并入本文)。这些公布描述了其中rep和/或cap基因缺失并被所关注的基因替换的各种来源于aav的构建体，以及这些构建体在体外(进入培养的细胞中)或体内(直接进入生物体)转运所关注的基因的用途。复制缺陷重组aav可通过将以下质粒共转染进被人类辅助病毒(例如腺病毒)感染的细胞系而制备：所含的所关注核酸序列的侧翼为两个aav反向末端重复序列(itr)区域的质粒，和携带aav衣壳化基因(rep和cap基因)的质粒。然后通过标准技术纯化所产生的aav重组体。在一些实施方案中，主题重组载体被衣壳化到病毒粒子(例如包括但不限于aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav13、aav14、aav15和aav16的aav病毒粒子)中。因此，本公开包括含有本文所述的任何载体的重组病毒粒子(因其包含重组多核苷酸而为重组的)。产生这样的粒子的方法是本领域已知的，并在美国专利no.6,596,535中有所描述。如上所述，在一些情况下，编码主题变体视蛋白的核苷酸序列可操作地连接到神经元特异性启动子。神经元特异性启动子和其他控制元件(例如增强子)是本领域已知的。合适的神经元特异控制序列包括但不限于神经元特异性烯醇酶(nse)启动子(参见例如emblhseno2、x51956；另见美国专利no.6,649,811、美国专利no.5,387,742)、芳族氨基酸脱羧酶(aadc)启动子、神经丝启动子(参见例如genbankhumnfl、l04147)、突触蛋白启动子(参见例如genbankhumsynib、m55301)、thy-1启动子(参见例如chen等人(1987)cell51:7-19)、5-羟色胺受体启动子(参见例如genbanks62283)、酪氨酸羟化酶启动子(th)(参见例如nucl.acids.res.15:2363-2384(1987)和neuron6:583-594(1991))、gnrh启动子(参见例如radovick等人,proc.natl.acad.sci.usa88:3402-3406(1991))、l7启动子(参见例如oberdick等人,science248:223-226(1990))、dnmt启动子(参见例如bartge等人,proc.natl.acad.sci.usa85:3648-3652(1988))、脑啡肽启动子(参见例如comb等人,emboj.17:3793-3805(1988))、髓鞘碱性蛋白(mbp)启动子、cmv增强子/血小板衍生生长因子-β启动子(参见例如liu等人(2004)genetherapy11:52-60)、运动神经元特异性基因hb9启动子(参见例如美国专利no.7,632,679和lee等人(2004)development131:3295-3306)以及ca(2+)-钙调蛋白依赖性蛋白激酶ii(camkiiα)启动子(参见例如mayford等人(1996)proc.natl.acad.sci.usa93:13250)。实用性主题视蛋白可用于调节细胞的电压电位。主题视蛋白可用于治疗性和药物筛选应用。主题视蛋白可用于生成疾病模型。调节细胞的电压电位例如，主题视蛋白可用于调节细胞(例如神经元)的电压电位。细胞可在体外或体内。因此，例如，本公开提供调节细胞、亚细胞区域或胞外区域的电压电位的方法，该方法通常涉及：将包含编码主题视蛋白(例如，光驱动质子泵)的核苷酸序列的核酸引入至少一个靶细胞、亚细胞区域或胞外区域，该视蛋白可操作以响应于特定波长的光而改变跨膜电位；以及通过将所述靶细胞、亚细胞区域或胞外区域暴露于所述特定波长的光而使所述核酸表达，暴露的方式被设计为导致所述靶细胞、亚细胞区域或胞外区域的电压电位增加或降低。在一些情况下，主题方法还涉及增加或降低靶细胞、亚细胞区域或胞外区域的电压电位直到其超极化的步骤。如果靶细胞、亚细胞区域或胞外区域为神经元，则超极化实现神经沉默。在一些情况下，主题视蛋白还涉及使用多种不同的响应于不同波长的光的视蛋白(例如，光激活质子泵)来实现多色神经沉默的步骤，包括：在不同的细胞群体中表达各种视蛋白(例如，光激活质子泵)；以及用不同颜色的光照射细胞。本公开提供调节细胞、亚细胞区域或胞外区域的ph的方法，该方法通常涉及：将包含编码主题视蛋白(例如，光驱动质子泵)的核苷酸序列的核酸引入至少一个靶细胞、亚细胞区域或胞外区域，该视蛋白可操作以响应于特定波长的光而改变细胞、亚细胞区域或胞外区域ph；以及通过将所述靶细胞、亚细胞区域或胞外区域暴露于所述特定波长的光而使所述核酸表达，暴露的方式被设计为导致所述靶细胞、亚细胞区域或胞外区域的ph增加或降低。本公开提供导致细胞、亚细胞区域或胞外区域释放作为化学递质的质子的方法，该方法通常涉及：将包含编码主题视蛋白(例如，光驱动质子泵)的核苷酸序列的核酸引入至少一个靶细胞、亚细胞区域或胞外区域，该视蛋白可操作以响应于特定波长的光而导致质子释放；以及通过将所述靶细胞、亚细胞区域或胞外区域暴露于所述特定波长的光而使所述核酸表达，暴露的方式被设计为导致所述靶细胞、亚细胞区域或胞外区域释放质子。靶细胞调节应用在一些实施方案中，将靶细胞通过主题核酸(例如，包含编码视蛋白例如变体视蛋白的核苷酸序列的核酸)修饰。在一些情况下，靶细胞是位于哺乳动物脑内的神经元。对靶细胞进行遗传修饰以表达光敏视蛋白，例如如上所述的主题视蛋白(例如主题变体视蛋白)。随后可以使用光刺激神经元。取决于多种因素，诸如在脑内的位置和刺激的频率及长度，可以实现不同的目的。例如，深度脑刺激(dbs)的当前技术使用电极直接对脑的目标区域施加电流。电刺激的频率有时称为低频dbs或高频dbs。研究表明，高频dbs抑制从被刺激的细胞产生脉冲，而低频dbs促进从被刺激的细胞产生脉冲。还已证实，产生低频dbs的高频率作用的频率根据被刺激的脑部特定区域而变化。根据高频dbs的一个实例，使用以约100hz或更高频率提供电流脉冲的电极来刺激神经元。已表明这样的频率在某些应用中是有效的，如本文进一步讨论。dbs的一个具体实例用于治疗帕金森病。在该应用中，通常对患者脑内的苍白球内部或丘脑底核施加dbs。通过植入修饰细胞以对光作出响应的生物结构，可以使用闪光灯代替电极。因此，靶向的神经元细胞和外部电信号不需要直接施加到靶向的细胞。此外，光与电相比往往从其起点传播得更远，从而增大相对于刺激源的有效面积并且只刺激已光敏化的神经元。如同基于电极的dbs方法一样，本发明的一个实施方案可以使用高频dbs实施，以抑制神经元产生的脉冲。虽然已经以约100hz的频率实现了高频dbs，但是使用本公开的各种实施方案的高频dbs可能不一定需要相同的频率。例如，当使用光激活技术时，可能在较低的频率(例如50hz)下再现高频dbs的抑制作用。例如，超极化视蛋白的激活可导致超极化并抵抗动作电位的产生。取决于特定的应用(例如，脑的目标部分和希望的作用)和施加的刺激形式，可以使用各种频率。按照本发明的另一个示例实施方案，使用诱导光敏生物分子表达的基因转移载体靶向特定类型的细胞。例如，可以产生基于病毒的蛋白(例如慢病毒、腺相关病毒或逆转录病毒)以靶向特定类型的细胞，具体基于这些细胞独特地表达的蛋白。随后用基于病毒的基因转移蛋白感染靶细胞，并开始产生新类型的离子通道(例如主题视蛋白、主题变体视蛋白)，从而变成光敏的。这对于刺激靶细胞而不刺激接靶细胞附近的其他细胞是特别有用的。例如，不同长度、直径、时值、其他膜性质、电绝缘性、神经递质输出和总体功能的神经元彼此紧邻，并因此在使用电极提供神经元刺激时，可能对其产生无意的刺激。参见例如gradinaru等人(2007)j.neurosci.27(52):14231-14238；zhang等人(2007)nature446:633-639；zhang等人(2007)naturereviewsneuroscience第8卷:577-581。本公开提供供体内使用的植入结构。其包括用于产生光的发光二极管、激光或类似的光源。生物部分修饰靶细胞使其包含光响应分子，该分子促进响应于由光源产生的光而对靶细胞的刺激。本发明的另一个实施方案采用一种布置来刺激靶细胞，所述布置使用允许靶细胞响应于光而接受刺激的光敏蛋白。使用生物递送装置来植入修饰靶细胞以包含光敏蛋白的载体。使用植入组件(例如，包含编码主题视蛋白的重组表达载体的植入式组件)在靶细胞附近植入光产生装置。使用控制装置来激活光产生装置，以产生将由靶细胞接收的光，从而响应于产生的光刺激靶细胞。例如，可将光递送到生物体(例如哺乳动物)内的位点。使用光发生器，诸如在体内产生光的植入式装置。存在于所述位点处的靶细胞中的主题视蛋白(例如主题变体视蛋白)响应于由光发生器产生的光而提供靶细胞刺激，所述光照射在靶细胞上。光发生器可以是尺寸为约几毫米的小电子装置。小尺寸对于使装置和相关植入操作的侵入性降至最低是特别有用的。在另一种情况下，光发生器可以包括可用于从外部来源向靶细胞传输光的光纤装置。例如，对靶细胞进行修饰以含有光激活质子泵/通道蛋白。可以使用多种不同的方法植入主题光敏蛋白。示例方法包括但不限于使用各种递送装置，诸如明胶胶囊、液体注射等。这些方法还包括使用立体定向手术技术(诸如框架或计算机手术导航系统)植入或以其他方式进入身体区域。比如，对靶细胞进行修饰而成为光敏性的，例如，进行修饰以产生主题视蛋白(例如，主题变体视蛋白)。靶细胞因而为光敏性的。靶细胞的刺激可以通过植入式装置控制。例如，可以布置控制电路以通过激活或禁用光源或通过向为光源提供电力的电池充电而对外部信号作出响应。在一种情况下，外部信号是由控制电路接收的电磁辐射。例如，无线电频率(rp)信号可由外部射频rf发射器传输并由控制电路接收。在另一个实例中，可以使用磁场激活和/或驱动控制电路。控制电路可以使用不同的复杂程度来实施。在一种情况下，电路是暴露于磁场时产生电流的简单线圈。随后使用电流驱动光源。这种实施方式对于限制尺寸和复杂性以及延长装置的寿命是特别有用的。在另一种情况下，控制电路可以包括rf天线。任选地，控制电路可以使用电池或类似的电源，诸如电容元件。充电时，电源允许电路继续运行而不需要来自体外的并行能量递送。这对于为光源发射的光提供精确的控制以及对于增加发射光的强度是特别有用的。在一个实施方案中，光源使用发光二极管(led)实现。已经证明，led对低功率应用是有用的并且还对电信号具有相对快的响应。在另一个实施方案中，基质(例如，其可包含明胶或相似的物质)包含编码主题视蛋白(例如主题变体视蛋白)的重组表达载体，所述重组表达载体进入靶细胞并提供靶细胞光敏性。在一种情况下，一旦植入体内后载体即释放出来。这可以例如通过使用允许载体释放进水溶液的容纳材料来实现(例如使用脱水或水溶性材料，诸如明胶)。载体的释放导致靶细胞被修饰，使得它们响应于来自光源的光而被刺激。在另一个实施方案中，使用包含光敏细胞的合成筛网。在一种情况下，细胞为经过修饰而成为光敏性(例如，经修饰以包含主题视蛋白，例如主题变体视蛋白)的神经元。可以将合成筛网构造成允许树突和轴突通过筛孔而不允许整个神经元(例如细胞体)通过。这样的筛网的一个实例具有直径为约3-7微米的小孔并由聚对苯二甲酸乙二醇酯制成。在另一个示例实施方案中，将注射机械装置用于递送主题视蛋白(例如，主题变体视蛋白)，例如编码主题视蛋白的重组表达载体。例如，植入式装置可对磁场作出响应。例如，电感器产生响应于磁场的电流/电压。电流通过导电路径传递到控制电路。作为响应，控制电路使用导电路径激活光源。光源照射生物部分以便刺激靶细胞。在一种情况下，生物部分包含如上所述的明胶、合成筛网或注射机械装置。在一个实施方案中，控制部分可以是简单的电连接、电阻元件或可以被完全地去除。在这样的实施方案中，产生的光的强度、持续时间和频率将直接由通过磁场产生的电流控制。这对于产生低成本、持久和小的装置可能是特别有用的。在另一个实施方案中，控制部分可以作为更复杂的电路实现。例如，控制电路可以包括或者说是采用不同的整流电路、电池、脉冲计时、比较电路等。在一个特定实例中，控制电路包括使用cmos或其他工艺生产的集成电路(ic)。集成电路技术允许在非常小的区域中使用大量的电路元件，并因此对于一些应用可以实现相对复杂的控制电路。例如，电感器是表面贴装电感器，诸如gowandaelectronicscorp.提供的loouh电感器部件号cf1008-103k。产生光的部分是蓝色led，诸如0603或0805封装尺寸的led。一个特定的实例是部件号为sml0805的可得自ledtronics,inc(torrance,ca)的蓝色表面贴装led。连接路径可以使用多种电导体实现，诸如导电环氧化物、胶带、焊料或其他粘合剂材料。在适当的光谱(适用于主题视蛋白)中发射光的led可通过商业来源获得，包括该相同的制造商。本公开提供对神经元进行遗传修饰以表达本文所述的光敏视蛋白的方法。例如，可将主题视蛋白用于对哺乳动物神经细胞赋予光敏性，方式是使用表达载体将编码主题视蛋白的核酸递送进靶向的神经细胞，其随后产生编码的视蛋白。用光刺激靶细胞导致靶细胞的超极化。本公开提供在神经元中产生抑制性神经元电流流动的方法，该方法涉及对神经元进行修饰以表达主题视蛋白，以及将该神经元暴露于光刺激。本公开提供用于控制神经元动作电位的方法，该方法涉及对神经元进行修饰以表达主题视蛋白，以及将该神经元暴露于光刺激。本公开提供用于控制跨细胞的细胞膜的电压电平的方法，该方法涉及对细胞进行修饰以表达主题视蛋白，以及将该细胞暴露于光刺激。本公开提供用于控制体内神经元的动作电位的系统。该系统包括递送装置、光源和控制装置。递送装置将光响应蛋白(主题视蛋白)引向神经元中，而所述光响应蛋白产生抑制性电流。光源产生刺激光响应蛋白的光，而控制装置控制光源产生光。本公开提供治疗障碍的方法。该方法靶向与所述障碍相关的一组神经元；对靶神经元进行修饰以表达主题视蛋白；经修饰的靶神经元产生降低神经元去极化的抑制性电流；将经修饰的神经元暴露于光刺激，从而降低神经元的去极化。药物筛选本发明的某些实施方案可以用于药物筛选。所述各种光敏蛋白用于采用离子开关调节膜电压，所述离子开关在响应于光而被激活(或禁用)时起到通道或泵的作用，并且在下文称为光响应离子开关或光激活膜电位开关(lamps)。例如，本公开可筛选影响离子通道和离子泵的化合物。系统引入可以阻滞或增强主题视蛋白在细胞中的活性的一种或多种候选药物，所述细胞经修饰而能合成所述主题视蛋白。光触发在所述细胞中的光响应离子通道，从而导致穿过细胞膜的观察到的电压变化。电压的变化刺激在所述细胞中的电压门控离子通道，随后将引起可以作为光输出而读取的离子浓度的变化。这些光信号被检测并用于测定候选药物对电压门控离子通道具有何种作用(如果有的话)。在一个更具体的实施方案中，将表达质子泵的蛋白引入细胞。在一种情况下，系统允许筛选不同的候选药物而在筛选之间不需要大量的装置。例如，可以使用同时刺激光响应细胞并检测药物有效性的光学装置进行试验。使用光学装置而不是手动接触(例如，使用全细胞膜片钳)对于提高试验筛选过程的通量可能是特别有用的。例如，筛选之间的时间可以通过最大程度减少或消除对于刺激或检测靶细胞中的离子流不必要的物理操作来降低。还可以在筛选过程之前制备细胞，因为检测设备只需要与制备的细胞光耦合即可。在另一种情况下，可以通过使用例如光检测器阵列和暴露于不同药物的修饰细胞的相应阵列同时筛选许多不同的药物来提高通量。可以改变对修饰的细胞的光刺激以测定引入的候选药物的特定性质。例如，可以将光刺激的强度修改成改变相应的去极化水平。可以调整希望的去极化的水平以进一步表征供试药物的有效性。在另一个实例中，光刺激可以包括光的快速脉冲。通过关联光刺激与所得的检测到的荧光之间的时间关系，可以根据动力学响应进一步表征药物。因此，可以针对多种不同的方面表征药物，这些方面包括但不限于对离子浓度的稳态作用、打开电压门控离子通道所需的去极化水平的变化以及对反复去极化的影响。在一个实施方案中，系统允许光刺激和/或检测的简单校准。可以在引入候选药物之前用光刺激经修饰的细胞。检测并记录离子通道响应性。可将记录值用作比较相同的修饰细胞在引入供试药物之后的离子通道响应性的基线。还可以将记录值用来调节光刺激或光检测器的敏感性。这些修改可应用于单个试样或试样的阵列。对于该试样阵列，可以通过调整相应的光刺激单独地校准各个试样。类似地，可以单独调整各个相应的光检测器。为光递送而分配的时间量可以变化，并取决于包括光门控质子或离子通道/泵表达的水平和该细胞群体的其他质子/离子通道的密度和特性的因素。为光接收而分配的时间量可以变化，并取决于包括筛选期间所需的准确度的因素。为孔板(盘)变化而分配的时间量可以变化，并取决于包括自动化设备的机械速度的因素。如果使用快速神经元作为被检测的细胞，则细胞刺激和leia检测过程可以在数毫秒内实现。以上过程可以在不同的条件下重复。例如，可以在不存在药物的情况下检测一组给定的细胞，随后在存在一种或多种药物的情况下检测所述细胞。从而可以记录、比较和研究在那些条件下的电兴奋性细胞的响应。如果本发明用针对在盘上的各个孔的至少一个发射器/检测器和至少两个同时操作的装置来实现，则可以保持长时间的连续操作。示例性筛选方法可以包括收集多个数据点而无需变换样品。因为仅仅通过用快速遮光器将激发光开启和关闭，对样品的控制在相同的样品制备中是可逆的，所以可以再次使用相同的样品。此外，可以向相同的细胞样品提供一系列的刺激模式，使得可以针对药物的作用进行测试，而不用担心不同样品制备之间的差异。通过调节激发水平(例如通过从没有光到高强度或最大强度光以线性方式改变光水平)，可以测试在一系列膜电位内的药物作用。这允许鉴定在超极化、自然或去极化膜电位期间有效的药物。本文描述的细胞系对于以高通量的方式详细表征候选药物可能是特别有用的。光控制相对快速，从而允许在更接近生理状况的激活形式下测试药物活性。例如，可以使用不同频率的去极化和/或超极化来测定在生理形式的神经活动下药物如何与通道相互作用。在一些情况下，可不对细胞系施加昂贵的化学染料而实现该过程。结合本文所述的各种性质，本发明的各种实施方案的使用对于通过消除对繁琐的机械操作和液体处理的需要来改善筛选通量可能是特别有用的。各种实施方案还可用于使用相同的样品重复筛选试验，通过消除对基于化学的荧光报告的需要而降低筛选成本，产生高时间精度和低伪信号(由于电压操作的光性质)，通过减弱用于刺激的光强度而调节去极化水平，以及通过使用脉冲光模式确定药物对离子通道的调节动力学。多种可独立控制的激发蛋白和抑制蛋白的存在为多种应用(包括但不限于应用于治疗多种障碍)敞开了大门，并且可以选择使用多种光响应蛋白以便对多种相应的光波长作出响应。虽然不总是明确地说明，但是在应用中可以与激发相结合地使用抑制，除了激发之外还使用抑制，或使用抑制代替激发。已经证明，单组分蛋白家族对多种波长和强度的光存在响应。本公开的多个方面允许下述序列的进一步突变和/或寻找这样的序列，所述序列允许另外的光波长和/或可单独控制的蛋白通道。还可以使用对光刺激的改变(例如，波长、强度或持续时间情况)。例如，刺激模式可以利用两种不同离子通道蛋白的激发波长的重叠部分以允许同时激发两种蛋白。在一种这样的情况下，所述蛋白可以具有不同的响应水平。因此，在神经应用中，一组离子通道可以按相对于第二组离子通道的不同成功百分比产生尖峰。类似地，在两种不同离子通道(或泵)的抑制波长中的重叠部分允许同时抑制两种蛋白。或者，可以使用多个光源，从而允许以希望的组合刺激光响应蛋白，而不刺激其他蛋白。治疗性应用本公开提供多种治疗方法。上瘾与多种脑功能(包括奖励与期望)相关。另外，上瘾的动因在个体之间可以不同。根据一个实施方案，上瘾例如尼古丁上瘾可通过脑岛上小面积的光遗传学稳定化而治疗。任选地，可以使用功能性脑成像例如提示态(cued-state)pet或fmri来定位高代谢焦点(hypermetabolicfocus)以便确定在脑岛表面进行干预的精确靶点。伏核和隔核的光遗传学激发可向患者提供奖励与愉悦，而无需依靠于使用药物，并因此可以是治疗上瘾的一种手段。反之，伏核和隔核的光遗传稳定化可用于在上瘾的情况下降低药物渴求。在一个可供选择的实施方案中，在前扣带回(ba32)的膝部中观察到的高代谢活性的光遗传学稳定化可用于降低药物渴求。在含有阿黑皮素原(pomc)和可卡因-苯丙胺调节转录肽(cart)的肽产物的内侧下丘脑的弓状核内细胞的光遗传学稳定化也可用于降低药物成瘾行为。对分泌生长激素抑制素的下丘脑室周核的神经内分泌神经元的光遗传学刺激可用于抑制从垂体前叶分泌生长激素，例如在肢端肥大症中。分泌生长激素抑制素或生长激素的神经内分泌神经元的光遗传学稳定化可用于加快生长和身体发育。在伴有“正常”衰老的变化之中，是在40和50岁之后血清生长激素水平的快速下降。因此，与衰老相关的体力衰退可通过室周核的光遗传学稳定化而减缓。下丘脑的腹内侧核的光遗传学稳定化，尤其是弓状核的阿黑皮素原(pomc)和可卡因-苯丙胺调节转录肽(cart)可用于增加食欲，并因而治疗神经性厌食症。作为另外一种选择，下丘脑的外侧核的光遗传学刺激可用于增强食欲和饮食行为。包括颞叶、nbm(麦纳尔底核)和扣带后回(ba31)的受影响区域的胆碱能细胞中的光遗传学激发提供刺激，并因此为恶化区域提供神经营养驱动。由于受影响区域在脑内分布广泛，因此采用植入式电极的类似治疗可能不如光遗传学方法可行。焦虑障碍通常与左颞叶和额叶皮层及杏仁核的活性增加相关，这种活性增加在焦虑消退时趋于正常。因此，受影响的左颞叶和额叶区域及杏仁核可通过光遗传学稳定化治疗，以便抑制这些区域中的活性。在正常生理学中，响应于接收的光而去极化的视网膜感光神经细胞形成所收到的光模式的视觉图。光遗传学离子通道可用于模拟身体许多部分中的这一过程，并且眼睛也不例外。就由于视网膜损伤而导致的视力损害或失明而言，可以生长功能性新视网膜，其使用天然环境光而不是来自植入装置的闪烁光模式。生长的人工视网膜可置于原始视网膜的位置(在该位置中，其可利用用作回到视皮质的导管的视神经)。或者，人工视网膜可置于另一位置，诸如前额，前提是去极化信号的导管传播到能够从光遗传学传感器矩阵破译编码信息的皮层组织。皮质性盲也可通过模拟视皮质下游的视觉通路而加以治疗。刺激将基于视皮质上游产生的视觉数据或通过人工光传感器。心动过速的治疗可通过对包括cnx或迷走神经的副交感神经系统纤维的光遗传学刺激而实现。这导致窦房结率的降低，从而降低心率和收缩力。相似地，脊神经t1至t4内交感神经系统纤维的光遗传学稳定化起到减缓心率的作用。对于病理性心动过缓的治疗，迷走神经的光遗传学稳定化或t1至t4中交感神经纤维的光遗传学刺激将起到增加心率的作用。由超过窦房结的异常电集中产生的节律障碍可以通过用适度的光遗传学稳定化处理所述异常电集中而抑制。这降低了在所处理的组织内的固有放电速率，并允许窦房结重新恢复其在心脏电系统起搏中的作用。以相似的方式，可以治疗任何类型的心律失常。在心肌病或充血性心力衰竭中发生的心脏组织退化也可以使用本发明来治疗；其余的组织可以使用本发明的多种实施方案来激发。包括额叶、顶叶和海马的脑部区域的光遗传学激发刺激可以提高处理速度、改善记忆并刺激神经元的生长和互连，包括刺激神经祖细胞的发育。举例来说，本发明的一种这样的应用涉及丘脑中的靶向神经元的光遗传学激发刺激，以使患者脱离接近植物(仅有知觉)的状态。在靶向的丘脑神经元的膜中的光门控离子通道或泵的生长受到影响。随后将一束闪光引导到这些修饰的神经元上对其进行刺激(例如，经由也可以通过相同通道进入的光学装置)，从而调节靶向神经元和/或周围细胞的功能。在一个替代实施方案中，光遗传学激发可被用于治疗在诸如充血性心力衰竭的病症中的心肌衰弱。由于心脏壁的细拉伸、脆弱的状态，以及在电极与肌肉之间提供均匀分布的电偶联的难度，对chf的衰弱心肌的电辅助通常是不实用的。为此，迄今为止用于提高心肌收缩力的方法涉及药理学方法诸如β激动剂和机械方法诸如心室辅助装置。在本发明的该实施方案中，经由在围绕心脏或者说是靠近受影响的心脏壁的夹套内表面上的光发射元件对衰弱的心肌递送光遗传学激发。可以通过本领域熟知的方法将光发散，以平滑地覆盖大面积的肌肉，从而通过各个光脉冲促进收缩。对于在扣带回(cg25)的膝下部分中进行光遗传学稳定化，可以用植入装置施加黄光。目标是以类似于mayberghs等人,"deepbrainstimulationfortreatment-resistantdepression,"neuron,第45卷,651-660,2005年3月3日,第651-660页教导的方式通过抑制靶标活性来治疗抑郁症，将该文献以引用方式全部并入本文。在一个替代实施方案中，光遗传学激发刺激方法以类似于schlaepfer等人,"deepbrainstimulationtorewardcircuitryalleviatesanhedoniainrefractorymajordepression,"neuropsychopharmacology2007,第1-10页教导的方式提高在该区域中的活性，将该文献以引用方式全部并入本文。在又一个实施方案中，用光遗传学激发刺激方法靶向左背外侧前额皮质(ldpfc)。以5-20hz起搏ldlpfc起到增强该结构的基础代谢水平的作用，这经由连接电路，用来降低cg25中的活性，从而在该过程中改善抑郁。抑制右背外侧前额皮质(rdlpfc)也是一种有效的抑郁治疗策略。这可以通过对rdlpfc的光遗传学稳定化来实现，或者还可以通过使用光遗传学激发刺激并以缓慢的速率(例如1hz或更小)产生脉冲而实现抑制，从而在该过程中改善抑郁。可以使用光遗传学方法改善迷走神经刺激(vns)。为了只刺激到大脑的迷走神经传入神经(如结状神经节和颈静脉神经节)，可以使用光遗传学激发。来自大脑的传出神经不会接收该方法的刺激，从而消除一些vns的副作用，包括咽喉不适、咳嗽、吞咽困难和声音撕哑。在一个替代实施方案中，可以对海马进行光遗传学激发，从而引起树突和轴突生长加快，以及海马的总体生长的加快。可以使用本发明治疗的与抑郁症有牵连的其他脑部区域包括杏仁核、伏隔核、眶额叶皮质和内侧眶额叶皮质、海马、嗅觉皮质以及多巴胺能投射、5-羟色胺能透射和去甲肾上腺素能投射。可以使用光遗传学方法来控制活性通过类似海马的结构扩散，从而控制抑郁症状。只要在朗格汉斯岛中存在有活力的α和β细胞，就可以通过靶向该胰岛来治疗糖尿病。例如，当血清葡萄糖高(人工测定或通过闭环葡萄糖检测系统测定)时，可以使用光遗传学激发来引起胰腺中的朗格汉斯岛的β细胞释放胰岛素，而使用光遗传学稳定化来阻止胰腺中的朗格汉斯岛的α细胞释放胰高血糖素。相反地，当血糖过低(人工测定或通过闭环葡萄糖检测系统测定)时，可以使用光遗传学稳定化来阻止β细胞分泌胰岛素，并且可以使用光遗传学激发来增强α细胞分泌胰高血糖素。对于癫痫的治疗，可使用光遗传学方法平息或阻滞致癫痫活性。大多数癫痫患者具有由致癫痫病灶产生的常规形式的活性扩散。可以使用光遗传学稳定化在其扩散之前抑制异常的活性或在其过程的早期就将其消除。或者，可以以一系列有意的不同步模式递送经由光遗传学激发刺激的兴奋性组织的活化，从而破坏出现的发作活性。另一个替代方案涉及在gaba能神经元中进行光遗传学激发刺激的活化，从而提供类似的结果。当检测到异常的eeg模式时，可以通过触发的光遗传学稳定化来靶向丘脑中继核。另一个实施方案涉及胃肠障碍的治疗。消化系统具有它自身的包含感觉神经元、运动神经元和中间神经元的半自主神经系统。这些神经元控制胃肠道的运动，以及触发肠中的特定细胞释放酸、消化酶和激素(包括胃泌素、缩胆囊素和促胰液素)。包括任何这些细胞产物分泌不足的综合征可以通过对生产细胞类型或促进其活性的神经元的光遗传学刺激来治疗。相反地，光遗传学稳定化可以用于治疗产生过多内分泌和外分泌产物的综合征。从便秘(尤其是在患有脊髓损伤的患者中)到巨结肠的肠动力低下障碍可以用肠内运动神经元的光遗传学激发来治疗。肠运动过度障碍(包括一些形式的肠易激综合征)可以用控制运动的神经元的光遗传学稳定化来治疗。神经性胃出口阻塞可以用在幽门中的神经元和肌肉的光遗传学稳定化来治疗。对于活动度不足综合征的一种替代方法是对肠壁中的牵张敏感性神经元提供光遗传学激发，从而增强肠充满且需要排空的信号。在这个相同的模型中，肠过度活动综合征的一种方法是向下胃肠道中的拉伸受体神经元提供光遗传学稳定化，从而提供肠是空的而不需要排空的“假提示”。就显性大便失禁(frankfecalincontinence)而言，获得对内部括约肌和外部括约肌改善的控制对减缓整个消化道的运动可能是优选的。在患者需要控制排便期间，对肛门内括约肌的光遗传学激发将阻止排便。向外括约肌提供光遗传学刺激可以用于提供额外的克制。当患者需要排便时，应该放松肛门内括约肌，并随后放松肛门外括约肌，这可通过中止光遗传学刺激或通过增加光遗传学稳定化来实现。传导性听力丧失可以通过使用光学耳蜗植入体来治疗。一旦耳蜗为光遗传学刺激做好准备，就可以使用发出闪光的耳蜗植入体。感觉神经性听力丧失可以通过对在听觉通路下游靶标的光学刺激来治疗。本发明的另一个实施方案涉及血压障碍(诸如高血压)的治疗。在诸如主动脉(主动脉体和主动脉旁体)和颈动脉(“颈动脉体”)的区域中的压力感受器和化学感受器通过经由迷走神经(cnx)和通往髓质和脑桥的其他途径(特别是孤束和核)发送传入信号来参与血压和呼吸调节。对颈动脉体、主动脉体、主动脉旁体的光遗传学激发可以用于向孤束与核发送“高血压”的假信息，使其报告应该降低血压。对脑干的适当部分直接进行光遗传学激发或稳定化也可用于降低血压。其相反的形式使光遗传学方法作为升高血压的物质。通过对迷走神经的光遗传学激发或通过对脊神经t1-t4内的交感神经纤维的光遗传学稳定化也可以获得类似的效果。在一个替代实施方案中，可以用心脏的光遗传学稳定化来治疗高血压，从而引起心排血量的降低和血压下降。根据另一个实施方案，对肾上腺皮质内产生醛固酮的细胞的光遗传学稳定化可以用于降低血压。在又一个替代实施方案中，高血压可以通过血管平滑肌的光遗传学稳定化来治疗。激活光可经皮传递到外周血管床。另一个示例实施方案涉及下丘脑-垂体-肾上腺轴障碍的治疗。在甲状腺机能减退的治疗中，对在旁室和下丘脑前核中的小细胞神经内分泌神经元的光遗传学激发可以用于增加促甲状腺素释放激素(trh)的分泌。trh进而刺激垂体前叶分泌tsh。相反地，甲状腺机能亢进可以用小细胞神经内分泌神经元的光遗传学稳定化来治疗。对于治疗肾上腺皮质功能不全或阿狄森氏病，对视上核和室旁核中的小细胞神经内分泌神经元的光遗传学激发可以用于增加加压素的分泌，这在促肾上腺皮质素释放激素(crh)的帮助下刺激垂体前叶分泌acth。通常由acth分泌过多引起的库欣综合症可经由与上述相同的生理连锁效应用视上核的小细胞神经内分泌神经元的光遗传学稳定化来治疗。弓状核的神经内分泌神经元产生多巴胺，其抑制垂体前叶分泌催乳素。因此，可以经由光遗传学激发来治疗高催乳激素血症，而低催乳激素血症可以用弓状核的神经内分泌细胞的光遗传学稳定化来治疗。在超自律状态(hyperautonomicstate)(例如焦虑症)的治疗中，肾上腺髓质的光遗传学稳定化可用于减少去甲肾上腺素的输出。类似地，肾上腺髓质的光遗传学刺激可用于需要肾上腺素升高的患者，例如患有严重哮喘或者表现为慢性嗜睡病症的患者。肾上腺皮质的光遗传学刺激会引起包括皮质醇、睾丸酮和醛固酮的化学物质的释放。与肾上腺髓质不同，肾上腺皮质从通过垂体和下丘脑、肺以及肾脏分泌的神经内分泌激素来接收其指令。无论如何，肾上腺皮质可接受光遗传学刺激的处理。肾上腺皮质的产皮质醇细胞的光遗传学刺激可以用于治疗阿狄森氏病。肾上腺皮质的产皮质醇细胞的光遗传学稳定化可以用于治疗库欣病。产睾丸酮细胞的光遗传学刺激可以用于治疗女性性兴趣障碍。那些相同细胞的光遗传学稳定化可以用于减少女性中的面部毛发。肾上腺皮质内的产醛固酮细胞的光遗传学稳定化可以用于降低血压。肾上腺皮质内的产醛固酮细胞的光遗传学激发可以用于升高血压。可以使用特定的受影响的脑部区域的光遗传学激发刺激来提高处理速度，并且刺激神经元的生长和互连，包括刺激神经祖细胞的成熟。这些用途对于智力迟钝的治疗是特别有用的。根据本发明的另一个实施方案，可以治疗多种肌肉疾病和损伤。与肌肉损伤、外周神经损伤和营养不良疾病相关的麻痹可以用光遗传学激发引起收缩以及光遗传学稳定化引起松弛来治疗。后面的经由光遗传学稳定化方法产生的这种松弛还可以用于防止肌肉消瘦、保持弹性并且当对抗肌肉群收缩时允许运动协调。同样，可以经由光遗传学稳定化来治疗显性痉挛(frankspasticity)。在诸如外周神经缺损、中风、创伤性脑损伤和脊髓损伤的领域中，有必要促进新的神经元的生长，并且帮助其整合到与其他神经元和与其目标组织的功能网络中。可以经由光遗传学激发来促进新神经束的再生长，光遗传学激发起到向干细胞发出使轴突和树突生长的信号并用来将自身与网络整合的作用。光遗传学技术(与电极相对)的使用防止完整的组织接收信号，并且凭借与发育的神经元建立的通信用来保证新目标组织的生长，并且不使用类似于从电极传出的电流的人工信号。对下丘脑的腹内侧、核特别是弓状核的阿黑皮素原(pomc)和可卡因-苯丙胺调节转录肽(cart)进行光遗传学激发可以治疗肥胖症。在一个替代实施方案中，可以经由下丘脑的外侧核的光遗传学稳定化来治疗肥胖症。在另一个实施方案中，对产生瘦素的细胞或下丘脑内具有瘦素受体的细胞进行光遗传学刺激可以用于降低食欲并因而治疗肥胖症。对所述区域的前囊层和类似的dbs的破坏性损伤是治疗严重的、难治性强迫性精神障碍48(ocd48)的已确立的方法。这些方法可以使用对内囊的内边缘或对一些区域诸如ba32和cg24(当ocd减轻时显示出代谢降低)的光遗传学稳定化来模拟。慢性疼痛可以使用本公开的另一个实施方案来治疗。电刺激方法包括局部外周神经刺激、局部脑神经刺激和“亚阈值”运动皮质刺激。合理的自生方法包括在局部疼痛位点的光遗传学稳定化。注意启动子的选择将保证其他感觉和运动纤维不受影响。在初级运动皮质处进行中间神经元的选择性光遗传学激发也可以提供有效的疼痛减轻。另外，在感觉丘脑(特别是内侧丘脑核)、室周灰质和腹侧中缝核进行光遗传学稳定化可以用于产生疼痛减轻。在一个替代实施方案中，对表达小清蛋白的细胞进行光遗传学稳定化的靶向策略可以通过减少p物质的产生而用于治疗疼痛。内源性阿片的释放可以通过使用光遗传学激发以提高在伏隔核中的活性来实现。在一个替代实施方案中，当内侧下丘脑的弓状核的pomc神经元被光遗传学激发时，β内啡肽升高，从而为抑郁症和慢性疼痛提供了可行的治疗方法。某些人格障碍(包括边缘性和反社会的类型)在包括“额叶功能过低”的脑部障碍中显示出局灶性缺损。预期这些区域的直接或间接的光遗传学激发可产生症状的改善。还已知杏仁核中活动的异常爆发促使突然的、自发的感想变成愤怒：一种边缘性人格障碍以及其他病症的症状，这可以受益于杏仁核的光遗传学稳定化。光遗传学方法可以改善脑部(包括杏仁核、纹状体和额皮质)的不同部分之间的通信和同步，这可有助于减少冲动并提高洞察力。创伤后应激障碍(ptsd)的以杏仁核为中心的模型(amygdalocentricmodel)认为其与杏仁核的过度警觉以及内侧前额皮层和海马的自顶向下的控制不足相关。因此，可以用扁桃体或海马的光遗传学稳定化来治疗ptsd。精神分裂症的特征在于包括幻听的异常。这些可以通过使用光遗传学稳定化抑制听觉皮层来治疗。与精神分裂症有关的额叶功能过低可以用受影响的额区的光遗传学激发来治疗。光遗传学方法可以改善脑部的不同部分之间的通信和同步，这可有助于减少将自生刺激作为外来刺激的错误认定。在内侧下丘脑的弓状核内的细胞(其含有阿黑皮素原(pomc)和可卡因-苯丙胺调节转录肽(cart)的肽产物)的光遗传学稳定化可用于减少强迫性性行为。在内侧下丘脑的弓状核内的细胞(其含有阿黑皮素原(pomc)和可卡因-苯丙胺调节转录肽(cart)的肽产物)的光遗传学激发可以在性欲障碍病例的治疗中用于提高性兴趣。在性欲减退障碍的治疗中，可以通过脑垂体的光遗传学激发来增强睾丸和肾上腺产生睾丸酮。伏隔核的光遗传学激发可用于治疗性快感缺失。视交叉上核分泌褪黑素，褪黑素用来调节睡眠/觉醒循环。对视交叉上核进行光遗传学激发可用于增强褪黑素的产生，从而诱导睡眠并因而治疗失眠。为了促进觉醒，促食欲素(下视丘分泌素)神经元强烈地激发大量的脑核。产生促食欲素的细胞群体的光遗传学激发可用于治疗发作性睡眠和慢性白天嗜睡。视上核的光遗传学刺激可用于诱导催产素的分泌，可用于促进在分娩期间的生产，并且可用于治疗社会性依附病症。类似于肌肉麻痹，因脊髓损伤而阻滞了传入神经的运动功能可以用光遗传学激发以引起收缩以及光遗传学稳定化以引起松弛来治疗。后面的经由光遗传学稳定化方法产生的这种松弛还可以用于防止肌肉消瘦、保持弹性并且当对抗肌肉群收缩时允许运动协调。同样，可以经由光遗传学稳定化来治疗显性痉挛。可以经由光遗传学激发来促进新脊髓神经束的再生长，光遗传学激发起到向干细胞发出使轴突和树突生长的信号并用来将自身与网络整合的作用。卒中后功能障碍包括人格改变、运动缺陷、感觉短缺、认知丧失和情绪不稳定。治疗卒中后功能障碍的一种策略是向已经由兴奋性连接阻滞了传入神经的脑部和身体结构提供光遗传学刺激。类似地，可以对已经由抑制性连接阻滞了传入神经的脑部和身体结构进行光遗传学稳定化。研究表明图雷特综合征的基本病理学是皮质和皮质下区域、丘脑、基底神经节以及额皮质中的多巴胺传输的阶段性功能紊乱。为了提供治疗，优选首先使用包括功能性脑成像和脑磁图描记术(meg)的技术来鉴别受影响的区域。无论是否被明确地鉴别，都可以使用候选束的光遗传学稳定化来抑制动作型抽搐。对装置参数的植入后经验性测试显示哪些光遗传学稳定化位点，以及哪些不必要继续。为了选择性地激发/抑制给定的神经元群体，例如涉及疾病病情的那些，可以使用若干策略使光遗传学蛋白/分子靶向特定的群体。对于本发明的各种实施方案，可以使用遗传靶向来表达各种光遗传学蛋白或分子。这种靶向涉及经由遗传控制元件的光遗传学蛋白/分子的靶向表达，这些遗传控制元件诸如为启动子(例如小清蛋白、促生长素抑制素、缩胆囊素、gfap)、增强子/沉默子(例如巨细胞病毒极早期增强子)和其他转录或翻译调控元件(例如土拨鼠肝炎病毒后转录调控元件)。可以使用启动子+增强子+调控元件组合的变换来限制光遗传学探针对遗传界定的群体的表达。本发明的各种实施方案可以使用空间/解剖学靶向来具体实施。这种靶向所利用的事实是：携带遗传信息(dna质粒、片段等)的神经元、病毒或其他试剂的投射模式可被集中地递送至给定神经元群体投射到的区域。遗传物质随后将被转运回神经元体以调节光遗传学探针的表达。或者，如果希望在集中的区域中标记细胞，可以将病毒或遗传物质集中地递送至所述目标区域以调节局部表达。基因递送系统多种基因递送系统可用于执行本公开的一个或多个实施方案。一种这样的递送系统为腺相关病毒(aav)。aav可用于向所关注的具体区域递送启动子+光遗传学探针(视蛋白)盒。如本文所用，“光遗传学探针”是指视蛋白，例如本公开的视蛋白或变体视蛋白。启动子的选择将驱动在特定神经元群体中的表达。例如，使用camkiiα启动子将驱动光遗传学探针的兴奋性神经元特异性表达。aav将介导至少一年或更长的光遗传学探针(视蛋白)的长期表达。为了实现更高的特异性，aav可用特定的血清型1、2、3、4、5、6、7和8假型化，其中每一血清型对于不同的细胞类型具有不同的嗜性。例如，血清型2和5已知具有良好的神经元特异性嗜性。另一种基因递送机制是使用逆转录病毒。hiv或其他基于慢病毒的逆转录病毒载体可用于向所关注的具体区域递送启动子+光遗传学探针盒。逆转录病毒也可用狂犬病病毒包膜糖蛋白假型化，以基于其轴突投射模式实现标记细胞的逆向运输。逆转录病毒整合进宿主细胞基因组，因此能够介导光遗传学探针的持久表达。非基于慢病毒的逆转录病毒载体可用于选择性标记分裂细胞。无肠腺病毒和单纯性疱疹病毒(hsv)是两种也可用于向脑的具体区域递送启动子+光遗传学探针盒的基于dna的病毒。hsv和腺病毒具有大得多的包装能力并因此可适应大得多的启动子元件且可用于递送多种光遗传学探针或与光遗传学探针一起递送其他治疗性基因。局灶性电穿孔(focalelectroporation)也可用于瞬时转染神经元。dna质粒或片段可局灶性递送到脑的具体区域。通过施加温和的电流，周围的局部细胞将接收dna物质并表达光遗传学探针。在另一种情况下，可通过以下方式使用脂质转染：将遗传物质与脂质试剂混合，随后注射进脑以介导局部细胞的转染。多种实施方案涉及使用多种控制元件。除了遗传控制元件外，还可以使用其他控制元件(尤其是其活性对化学品、磁刺激或红外线辐射敏感的启动子和增强子)来介导光遗传探针的时间控制表达。例如，其转录活性受红外线辐射影响的启动子允许使用聚焦的辐射仅在所需的时间微调光遗传学探针在局灶性区域中的表达。帕金森病可通过以下方式加以治疗：使用兴奋性特异性启动子诸如camkiiα在丘脑底核(stn)或苍白球内部(gpi)中的谷氨酸能神经元中表达光遗传学稳定化，并应用光遗传学稳定化。不同于所有细胞类型都受到影响的电调节，将仅抑制谷氨酸能stn神经元。疾病模型本公开的多个方面提供测试神经回路或疾病模型。该模型可限定回路根据输入信号的输出响应。输出响应可使用许多不同的可测量特性而评估。例如，特性可包括下游神经元的电响应和/或患者的行为响应。为了测试该模型，在模型的输出位置表达光遗传学探针。对光遗传学探针进行刺激，对输出特性进行监测并与模型预测的输出进行比较。在某些具体实施中，使用光遗传学探针允许对使用电探针限定的模型进行微调。因为电探针仅提供有限的引导刺激的能力并因此不是很适合刺激某些区域而又不直接刺激附近区域。本文所公开的光遗传学探针提供更精确地选择刺激位置的机制。例如，来自光遗传学探针的刺激可被导向非常具体类型的回路/细胞，诸如传入纤维。以下说明提供与这样的实施方案一致的示例具体实施，并且意在表明本发明的方面的可行性和广泛适用性。根据本公开的一个实施方案，本发明可用于dbs动物模型，例如在帕金森病大鼠中，以鉴定负责治疗作用的靶细胞类型(存在激烈争论并具有巨大临床重要性的领域)。该知识单独地可导致开发改进的药理学和外科手术策略以治疗人类疾病。一种这样的应用涉及两个神经元群之间的长时程增强(ltp)和/或长时程抑制(ltd)。通过使主题视蛋白的表达靶向不同的神经元群体并用不同频率的光刺激每一个神经元，可在两群之间实现ltp或ltd。每群可使用相应波长的光独立地控制。这尤其可用于两群的空间布置在用相同波长的光单独控制存在问题的应用。因此，光递送装置不易激发错误的神经元群，并且可以不太依赖于光学刺激的精确空间位置。在体内向细胞递送蛋白可使用多种不同的递送装置、方法和系统完成。一种这样的递送装置是递送核苷酸序列以在体内对细胞进行修饰的植入式装置，诸如病毒载体。植入式装置还可以包括光递送机构。光递送可使用例如发光二极管(led)、光纤和/或激光器实现。实施例提出以下实施例以便为本领域中的普通技术人员提供有关如何实施和使用本发明的完整披露和描述，并且这些实施例并非意在对发明人所认为的发明范围进行限制，亦非意指下文的实验是所执行的全部实验或仅是所执行的实验。已作出了努力以确保关于所用数值(例如，量、温度等)的准确性，但是应当考虑一些实验误差和偏差。除非另外指明，否则份数均为重量份，分子量均为重均分子量，温度单位均为摄氏度，以及压力均为大气压或接近大气压。可以使用标准缩写，例如：bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；kb，千碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸；i.m.，肌内；i.p.，腹膜内；s.c.，皮下，等等。实施例1：超极化视蛋白材料和方法所有实验均根据得到stanfordadministrativepanelonlaboratoryanimalcare批准的方案进行。分子克隆慢病毒构建体含有启动子与视蛋白之间的bamhi、视蛋白与荧光团之间的noti以及荧光团与wpre之间的ecori。使用gtggcgcgccctattacttgtacagctcgtccatg(seqidno:11)(对于所有视蛋白)、tatgctagccaccatggactatggcggcgc(seqidno:12)(对于chr2突变体)和gttatgctagcgccaccatgtcgcggaggccatggc(seqidno:13)(对于chief)对视蛋白-eyfp片段进行聚合酶链反应(pcr)扩增以添加asci和nhei，然后连接到被这些位点切割的aav-ef1α-dio主链。mac和arch作为绿色荧光蛋白(gfp)融合基因得自addgene，并转换到增强的黄色荧光蛋白(eyfp)以保持一致性。通过dna2.0合成了人源化archt。如前人所述33，将mac、arch和archt仅用内质网(er)输出元件增强到2.0版，并使用er输出基序和运输信号增强到3.0版。对所有构建体完整测序以检查准确性，并在病毒生产前对所有aav载体测试了体外表达。完整的序列信息见网站：www(dot)optogenetics(dot)org。海马神经元培养和磷酸钙转染由p0sprague-dawley大鼠幼崽(charlesriver)制备原代培养的海马神经元。分离ca1和ca3，用0.4mg/ml木瓜蛋白酶(worthington)消化，然后涂到用1:30matrigel(becktondickinsonlabware)预先包被的盖玻片上。用含有1.25％胎牛血清(fbs)(hyclone)、4％b-27补充剂(gibco)、2mmglutamax(gibco)和2mg/ml5-氟-2'-脱氧尿苷(fudr)(sigma)的neurobasal-a培养基(invitrogen)将培养物保持在5％co2的潮湿培养箱中，并在盖玻片上在24孔板中以65,000个细胞/孔的密度生长。对于每个孔，通过2μgdna(qiagen无内毒素制剂)和1.875μl2mcacl2(最终ca2+浓度250mm)在15μlh2o中制备了dna/cacl2混合物。向dna/cacl2中加入15μl2xhepes缓冲盐水(ph7.05)。在室温(rt)下20min后，将混合物逐滴加入移除了生长培养基并替换为预热的mem的每个孔中，在37℃下进行45-60分钟转染，之后，将各孔用3x1ml温热的mem洗涤，然后回到原始生长培养基。立体定位注射由universityofcarolinachapelhillvectorcore制备了腺相关病毒(aav)血清型2/5。基因组滴度对于chetaa、chetatr和chief为1.5×1012cfuml-1，对于eyfp、enphr3.0和earch3.0为4×1012cfuml-1。在+1.7前后、0.4中间外侧和2.5背腹侧(距前囱的mm数)将1μl病毒经双侧立体定位注射进3-4周龄小鼠的内侧前额叶皮质。全细胞电生理记录在转染后4-6天在以下台氏液(320mosm)中进行了培养神经元的记录：125mmnacl、2mmkcl、2mmcacl2、2mmmgcl2、30mm葡萄糖和25mmhepes(用naoh滴定至ph7.3-7.4)。以1-2mlmin-1的速率灌注台氏液，并保持在室温(20-22℃)下。细胞内液(300mosm)含有130mm葡萄糖酸钾、10mmkcl、10mmhepes、10mmegta和2mmmgcl2(用koh滴定至ph7.3)。用浴施加的河豚毒素(ttx)(1μm；sigma-aldrich)和细胞内qx-314氯化物(1mm；tocrisbioscience)进行了兴奋性视蛋白的表征。超极化视蛋白的体外膜片钳和去极化视蛋白的电流钳记录在存在突触传导阻断剂6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(cnqx；10μm；sigma-aldrich)和d(-)-2-氨基-5-膦酰基戊酸(apv；25μm,sigma-aldrich)以及用于电流钳实验的gabazine(10μm；sigma-aldrich)的情况下进行。培养神经元的所有记录均在正立leicadm-lfsa显微镜上进行。eyfp、enphr3.0和earch3.0表达锥体细胞在病毒注射后6-7周得自野生型c57bl/6小鼠的急性切片中进行。acsf含有cnqx、apv和gabazine。细胞内液(280mosm)含有135mm葡萄糖酸钾、5mmkcl、10mmhepes、0.1mmegta、2mmmgcl2、2mmmg-atp和0.2mmna2-gtp(用koh滴定到ph7.4)。锥体细胞通过形态和特征性电生理特性加以鉴定。在正立olympusbx51显微镜上进行记录。对于所有膜片钳实验，硼硅酸盐玻璃(sutterinstruments)电极电阻为3-6mω。对于细胞贴附电生理记录，在获得gω密封后，设定保持电位使得无净电流流过膜；将相同的刺激方案用于全细胞尖峰(spiking)实验。在进行细胞贴附记录后，我们向电极施加了抽吸以破入细胞，并在全细胞中重复了相同的实验以提供直接的细胞内比较。在任何制备物中均未向神经元添加外源性视黄醛辅因子。光递送所有实验均使用单光子活化而进行。对于培养的神经元，光从300wdg-4灯(sutterinstruments,novato,ca)发出，并穿过40x,0.8na水浸物镜递送。脉冲输入信号经由bnc连接从pclamp(axoninstruments)递送到dg-4。从dg-4触发信号到全光输出的延迟用放大的光电检测器(thorlabs)测得为约1ms，其中上升时间为200μs。达峰时间和潜伏期的所有测量值均针对该延迟进行校正。对于光敏度测量，光穿过470/40nm滤光片(对于蓝光敏感兴奋性视蛋白)或562/40nm滤光片(对于c1v1和所有抑制性视蛋白)，然后穿过一系列中性密度(nd)滤光片以实现约0.1至20mwmm-2范围内的功率密度。在约5mwmm-2下研究了其他性质。对于这些实验，光穿过lambda10-3滤光轮(sutterinstruments)，其具有针对不同波长的滤光片的10位轮，经nd归一化以产生密切匹配的功率密度。滤光片为：406/15、427/20、445/20、470/20、494/20、520/15、542/20、560/25、590/20。抑制谱也使用了607/45滤光片。培养中的去极化工具的功能性能使用了470/40nm滤光片(对于蓝光敏感兴奋性工具)或562/40nm滤光片(对于c1vt)，然后使用nd滤光片以实现2、6和20mwmm-2的功率密度。对于在切片中研究快速去极化工具的实验，光从相同的300wdg-4灯(sutterinstruments)发出并穿过40x,0.8na水浸物镜递送。光穿过470/40nm滤光片并进行调整以实现5.1mwmm-2的光功率密度。对于在切片中研究超极化工具的实验，使用了40x/0.8nalumplanfl/irobjective(olympus)、xcite卤素光源(expo)。光穿过589/15滤光片(enphr3.0)或560/14滤光片(earch3.0)。对于在匹配条件下比较光电流和超极化幅值的实验，将光功率密度调整到约5mwmm-2。对于其余的实验，在一系列光功率密度上对光进行调整(对于enphr3.0为5-10mwmm-2；对于earch3.0为0.25-5mwmm-2)，以便实现两种视蛋白相当的光电流范围。所有实验在扫描之间均包含至少30s的黑暗，以便允许恢复到基线。所有滤光片在这里均以波长(nm)/带宽(nm)的形式给出。所有光功率密度均在离开40x物镜后以大约样品距离进行测量。数据分析生理学结果的分析使用clampfit软件(axoninstruments)或在matlab编写的定制软件(mathworks)进行。对接触电阻(ra)和输入电阻(rin)进行连续监测，并且仅当ra<30mω而rin>90mω时才将数据包含在内。将含有逃逸尖峰(escapedspike)的任何曲线排除在峰值光电流分析或动力学分析之外，但是在可能时仍对稳态光电流进行测量。对于培养物中的电流钳记录，仅将满足那些标准并且峰值电流>-150pa(保持在-65mv)的细胞包括在分析中。对于急性切片中的电流钳记录，仅将满足那些标准并且静息电位<-55mv的细胞包括在分析中。为了确定峰值光电流，以2ms的滤光片宽度使用稳健loess法将曲线平滑化，并将峰值定义为从激光开始到激光开始后200ms的极值，小于基线电流(得自激光开始前500ms的平均值)。视觉检查确保了未出现逃逸尖峰或其他异常。从激光开始到此标记的峰值时间测量了达峰时间。通过从峰值到激光偏移时间后2ms将单指数曲线拟合到平滑化的波形而测定了稳态光电流。稳态电流从该拟合的参数获得。使用clampfit计算了τoff和τdes。首先将曲线用低通gaussian滤光片(在1,000hz具有-3db截止值)平滑化，然后将单指数曲线拟合到平滑化波形。视觉检查所有曲线的拟合优度。使用慢病毒和腺相关病毒(aav)两种构建体在体外表征了去极化工具chr2、chetaa和chief。对于取决于单分子性质(稳态：峰比率、作用谱、光敏度和动力学)的参数，在确认数据集无统计差异后对实验的数据汇总。在两轮单独的实验中评估了超极化工具的光电流性质。enphr3.0光电流幅值在两个数据集之间存在统计差异，因此我们仅在确认enphr3.0在各数据集中表现相似后在考虑归一化值或固有单分子性质(作用谱、光敏度和动力学)时才合并数据集。将全细胞尖峰定义为升至高阈值(对于在切片中比较快速去极化视蛋白为-20mv；对于所有其他比较为0mv)以上，然后降低到低阈值(-30mv)以下。将在之前峰2ms内出现的后续尖峰忽略。为了检测光引起的尖峰，限定了脉冲开始后1-50ms的时间窗口。在20hz以上，将该窗口截短到当前脉冲开始后1ms到后续脉冲开始后1ms。将最后光脉冲附近的窗口截短到相同的长度。使用clampfit中的阈值功能鉴定了细胞贴附尖峰。非常小的宽事件不作为尖峰包括在内。如果尖峰数据含糊不清，则对曲线进行人工检查。对于各全细胞脉冲群，我们计算了引起≥1个尖峰(脉冲效率)的光脉冲和引起>1个尖峰(多尖峰可能性)的光脉冲的比例。将平台期电位定义为尖峰波形从基线的偏移。对于体外去极化工具，将发出≥1个尖峰的所有细胞均包括在分析中。对于切片中的快速成峰细胞，仅将脉冲效率为100％的曲线包括在分析中。通过将光脉冲分成四分位数并计算每个四分位数的脉冲效率而计算了时间平稳性(尖峰随着时间的推移以相同的可靠性持续的程度)。潜伏期以及在脉冲群中的潜伏期传播如下确定：对于各光脉冲，我们测量了从光脉冲开始到尖峰时间的时间差(delta)。潜伏期是这些时间差的平均值，而潜伏期传播是这些时间差的标准偏差。注意，潜伏期传播因此是潜伏期在各细胞内如何变化的度量，而潜伏期上的误差条是细胞中平均潜伏期的标准误差。将细胞发出<5个动作电位的曲线排除在分析之外。统计分析所有统计分析均使用graphpadprismwindows5.04版(graphpadsoftware,www(dot)graphpad(dot)com)进行。对于单变量(诸如切片中chetaa与chief的动力学)的双样品比较，首先检验了数据是否遵循高斯分布(shapiro-wilk正态性检验)。如果数据可检测地为非高斯分布，则进行非参数mann-whitney检验。如果数据非常逼近高斯分布，则进行独立的双样本t检验(等方差)。就不等方差(通过f检验确定)而言，应用welch’s校正。所有检验均为双尾的，置信度为95％。对于单变量(诸如培养物中的所有去极化视蛋白的动力学)的多因素比较，首先检验了数据是否遵循高斯分布(shapiro-wilk正态性检验)。在分布可检测地为非高斯分布的情况下，将平方根变换用于稳定方差并使得数据接近正态；然后使用dunnett's检验对族系误差(family-wiseerror)进行校正而针对一个指定的“对照”对所有数据进行比较。如果变换数据仍为非高斯分布，我们则使用了非参数dunn’s检验。在所有情况下，维持了α＝0.05(95％置信区间)的总体显著性水平。在更大量的视蛋白之间的比较因此将具有更保守的α(更严格的显著性要求)。这还可导致赋予相同比较的不同显著性值，具体取决于平行地进行了多少个比较。具体地讲，由于将一些相同的chr2和chetaa数据包括在两个比较中，因此在所报告的显著性值中的差异可归因于包括在每组比较中的视蛋白的总数。对于在多变量中的比较(诸如在不同频率中的尖峰性能)，进行了双因素方差分析，然后在各对之间或针对指定的“对照”进行了事后检验。将保守bonferroni’s校正用于控制假阳性率。为了检验两种视蛋白性质(诸如τoff与epd50)之间的关系，进行了置信度为95％的非参数、双尾spearman校正。为了估计斜率，进行了使相对距离平方(1/y2)最小化的最小二乘回归法(线性或在双对数变化数据上线性)。为了检验视蛋白性质对实验条件(例如，光电流与光功率密度)的依赖性，如下进行了回归。首先，对于达峰时间与光功率密度的分析，我们对双对数变换数据进行了线性回归；并比较了对于每种视蛋白而言最佳拟合斜率是否明显区别于0。其次，对于从减敏恢复的分析，将非线性回归用于通过约束y0＝0和平台期＝1的两阶段关联曲线来拟合平均光电流恢复数据。将该拟合用于生成曲线和r平方值。在单独的分析中，我们拟合了各个细胞的数据，以计算50％恢复所需的时间。第三，对于光敏度分析，将原始群体平均值用单位点特异性结合曲线拟合：y＝bmax*x/(kd+x)。在单独的分析中，对各细胞的光电流归一化；并对各视蛋白的群体平均值和标准误差作图。将该群体数据以相同的方式拟合以生成曲线和r平方值。对于各个细胞，获得了kd(平衡结合常数)值，我们将其称为epd50(50％有效光功率密度)。对于整个比较族，将群体显著性阈值始终设为p<0.05(*)、p<0.01(**)和p<0.001(***)。所有图线均显示为平均值±平均值标准误差(s.e.m.)。免疫组织化学在注射后6或4周，将小鼠经心脏灌注pbs，然后灌注4％多聚甲醛(pfa)。在pfa中过夜后固定之后，将脑在30％蔗糖的pbs溶液中平衡至少24小时。使用冷冻切片机获得了40μm切片，进行dapi染色(1:50,000)，然后盖上pva-dabco(sigma-aldrich)盖玻片。将转染的原代海马培养物用4％pfa固定15min。对于用kdel(seqidno:14)染色，然后将培养物用2％正常驴血清(nds)中的0.4％皂草苷透化30min。在4℃下使用标记含有kdel(seqidno:14)滞留信号的内源性er驻留蛋白的单克隆抗体(抗kdel1:200，abcam)进行了过夜原代抗体温育。在室温下将二抗(jacksonlaboratories)在2％nds中应用1小时。设备和设置所有图像均在leica共聚焦显微镜(dm600b)上以1024×1024分辨率(像素尺寸＝3.03μm2)获得。使用以下物镜采集图像：10x/0.40na(空气)、40x/1.25na(油)和63x/1.4na(油)。激发和发射波长如下：图1b中的eyfp，514nm/512-600nm；所有其他图的eyfp，488nm/500-545nm；gfp，488nm/500-600nm；cy5，633nm/650-750nm。以下图使用了线平均法：图3e,h(2)、图1b(4)、图2a(3)。将一致的设置用于各给定图组中的所有图像。图1b的所有eyfp图像的亮度和对比度均在photoshop(adobe)中均匀且相同地修改。所有其他图像在采集后未处理。转染细胞中荧光水平的定量从进行了膜片钳实验的相同细胞采集荧光图像，以使得能够对表达水平和光电流/荧光关系进行定量。图像通过保持恒定设置的metamorph采集，并使用imagej离线处理。手绘roi涵盖了胞体和近端树突。结果超极化工具和性质对多种超极化光遗传学工具进行了头对头比较。虽然各实验对于超极化光电流性质将具有其自身的一套独特的要求，但是一些共同的指导原则最初是显而易见的。首先，在大多数实验应用中，超极化光电流将需要足够大以稳健且安全地抑制尖峰，甚至在存在兴奋性输入的情况下。其次，更高的光敏度将可能使得能够调节更大体积的组织、使用更低的光功率和/或侵入性较低的光递送。第三，精确的时间锁定抑制将可能需要具有快速开始和偏移的光电流，而更长期的抑制则将需要稳定、具有最低减感的光电流。最后，作用谱的性质将决定在同一制备物中与其他光活化试剂合并的可行性32,33。在神经元中证实有效的第一款超极化工具为盐碱古菌(n.pharaonis)盐细菌视紫红质(nphr)，它是一种黄光活化氯离子泵，现已用于横跨哺乳动物脑切片32、自由移动蠕虫32、培养的神经元32,34和行为性哺乳动物35-38的制备物。已经报道了为在哺乳动物神经元中增强的膜靶向而修饰的两种版本，称为enphr2.039和enphr3.033。外向质子泵arch40(得自苏打嗜盐菌)、archt41(得自嗜盐菌属(halorubrum)菌株tp009)、ebr33(得自盐杆菌属(halobacterium))和mac40(得自斑点小球腔菌)最近已证实实现了成功的神经元抑制。enphr3.0具有比enphr2.0更大的光电流，并且arch具有比enphr2.0更大的光电流40，但是尚未报道enphr3.0与arch或任何质子泵之间的直接比较。下面展示了最强效的超极化视蛋白的直接比较(图1a)，包括还描述了导致更高表达水平和抑制性光电流的质子泵的新型膜运输增强版本。在体外对性质进行了表征；然后测试了急性切片中两个最具前景的候选物的功能性能。将各超极化工具与增强的黄色荧光蛋白(eyfp)进行框内融合，将视蛋白克隆进具有兴奋性camkiiα启动子的相同慢病毒主链(图1a)；并使视蛋白在培养的神经元中表达(图1b)。enphr3.0很好地靶向膜，但是arch、archt和mac均显示出胞内蓄积，使人想起通过nphr1.0观察到的内质网(er)聚集39。在构建体的gfp版本中也观察到了相同的蓄积；gfp和yfp1.0版本具有相似的光电流。er聚集通过用er标记物kdel(seqidno:14)共染色而确认(图1b)。将应用于enphr3.0的运输修饰也应用于arch、archt和mac。这些称为earch3.0、earcht3.0和emac3.0(与nphr版本演变类似)的新型运输增强版本具有明显降低的胞内标记以及通过细胞过程标记而改善的膜定位(图1b)。中间“2.0”版本是强效的，但是不如3.0版本成功。由于只有在膜上表达的那些蛋白才可有助于测得的光电流，因此预计，该改善的视蛋白运输应当增加光电流大小。实际上，所有三种增强的质子泵均大大增加了光电流(p<0.001；图1c)。虽然质子泵的1.0版本具有比enphr3.0明显更小的光电流，但是earch3.0和earcht3.0光电流明显更大(各比较的p<0.001；图1c)。在这些工具之中，enphr3.0表达细胞具有最暗的荧光，但是每荧光具有最大的光电流。虽然最大的emac3.0光电流在增强的视蛋白之中最小(并且明显小于enphr3.0；p<0.05)，但是已报道，mac具有明显蓝移的活化谱，以允许与enphr3.064相结合的双重抑制。在确认膜运输不改变谱后，对增强的泵的谱进行了比较，并与用于参考的chr2一起作图(图1d)。enphr3.0相对于三种质子泵(峰值位于520-560nm)红移(峰值位于560-590nm)，从而表现出与chr2的最少重叠；在质子泵之中未见在功能上相关的差异。通过在1s光脉冲的开始和结束时对开启动力学(τon)和关断动力学(τoff)定量而研究了超极化光电流的时间精度。所有泵均快速活化，其中质子泵的活化明显快于enphr3.0(所有的都在1.5-3ms的范围内，图1e)。两mac变体均具有比其他泵慢得多的关断动力学(p<0.001；图1e)。通过测量约0.05至约20mwmm-2范围内的一系列光功率密度中的光电流而评估了超极化泵的光敏度(图1f)；由于小光电流，将mac1.0从该分析及后续分析中排除。正如预期，3.0泵具有比1.0对应物大得多的可操作光敏度(即，通过绝对电流幅值)，但运输增强未影响群体敏感度(归一化电流幅值或epd50)。emac3.0是最敏感的(epd50＝1.9±0.4mwmm-2相比于enphr3.0的5.4±0.2mwmm-2；p<0.001)。关断动力学和群体光敏度因此对于超极化工具而言为逆相关的，使人想起去极化工具观察到的模式。鉴于许多行为神经科学实验可能需要大约数分钟的延长抑制，对超极化光电流的稳定性进行了研究。虽然所有泵光电流在60s的连续光中衰减，但是enphr3.0电流最持久，并且大3.0质子泵电流(earch3.0和earcht3.0)在体外具有最大的急速下降。所有泵均在这些培养的神经元条件下以相似的效率恢复光电流。图1：超极化工具的性质，(a)nphr是内向氯离子泵(盐细菌视紫红质型；hr)，而arch、archt和mac是外向质子泵(细菌视紫红质型；br)。3.0版本包含视蛋白与荧光团之间的运输序列(ts)和荧光团之后的2.0型内质网输出序列(er)。(b)在培养物中表达的并用er标记物(抗kdel(seqidno:14)；红色)进行免疫标记的1.0和3.0版本(绿色)的共聚焦图像。水平标尺表示25μm。(c)arch(n＝15-19)、archt(n＝14-16)和mac(n＝8-12)的1.0(打开的竖条)与3.0版(闭合的竖条)响应于1s光的代表性曲线和原始光电流。垂直和水平标尺分别表示500pa和500ms。将光电流归一化到得自相同实验内的enphr3.0值，以使得能够在视蛋白中进行直接比较(n＝8-35)。(d)在chr2(黑色)旁边的3.0版本(n＝7-20)的作用谱，(e)τon和τoff(n＝7-35)。垂直和水平条分别表示200pa和5ms，(f)所有超极化视蛋白的epd50(n＝5-14)。在实验内enphr3.0旁边作图的原始光电流与光功率密度(n＝5-14)。所有群体数据均以平均值±s.e.m.作图。星号表示显著性水平：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。除非另外指明，否则将enphr3.0用590nm光活化，而所有其他工具用560nm光活化，两种情况均在约5mwmm-2下。超极化工具：抑制急性切片中的尖峰为了进一步研究在与体内实验更相关的条件下延长的光电流的特性，并测试超极化稳定地抑制尖峰的功能能力，使用了急性切片标本。对于该分析，对超极化工具的每大类之一(即，氯离子泵enphr3.0针对质子泵之一)进行了比较。使用了迄今研究最透彻的质子泵(arch1.0)的增强对应物，即earch3.0。为了在体内表达enphr3.0和earch3.0，立体定位注射具有受camkiiα启动子控制的视蛋白-eyfp融合基因的腺相关病毒载体(aav血清型2/5)。在匹配的条件下，基于荧光，earch3.0在注射部位和诸如基底外侧杏仁核(bla；图2a)的下游靶标处的轴突中的表达均强得多。与eyfp转导的对照相比，表达两种视蛋白的细胞具有相似的基线输入电阻(图2b)和静息电位，但具有略高的膜电容，如之前已在表达视蛋白的hek细胞中观察到42。通过体外研究工作也可预期(图1)，在匹配的光功率密度(5mwmm-2)下，earch3.0具有明显更大的光电流(p＝0.01)，平均为1680±360pa，相比之下enphr3.0为450±70pa(图2c)。在电流钳下，earch3.0介导的超极化也明显更大(-94±12mv与-41±4mv，p＝0.005；图2d)；与光电流相比超极化的差异较小可能是由于在质子泵中光循环转换的电压依赖性减缓。因为光电流稳定性和细胞对超极化的响应可依赖于光电流幅值，因此使用不匹配的光功率密度(对于enphr3.0为5-10mwmm-2；对于earch3.0为0.25-5mwmm-2)进行了一组实验，以得到两个工具相似的光电流范围。将细胞在电压钳下照射60s，然后测量各细胞的开始和结束光电流。这些数据通过线性回归良好拟合(enphr3.0r2＝0.68、earch3.0r2＝0.88)，其中earch3.0具有明显更高的斜率(f1,36＝22.2,p<0.001)，从而反映了以下事实：对于具有相似起始光电流的细胞而言，表达earch3.0的细胞在这些切片条件下在光脉冲结束时剩余更多的光电流，如在示例性曲线中所见并与在体外观察到的稳定性模式对比。评估了earch3.0和enphr3.0抑制电流钳中的尖峰的能力。尖峰通过5hz下适当超阈值的电流注射而引起，其中基线30s(光照前)、光照60s以及光照后30s。两种泵均在延长的光刺激持续过程中成功地阻断了尖峰(图2e)。我们观察到，在两个组中，一些细胞在延长的超极化后变得不稳定，尤其是通过>50mv，从而未能针对电流注射产生尖峰，或在光偏移后反弹到更去极化的静息电位。将这些因素对各细胞定量，并将每一者针对超极化程度作图(图2f)。在更温和(>50mv)的超极化下，未观察到对兴奋性或膜电阻一致或持久的作用。图2：超极化工具的性能，(a)在内侧前额叶皮质(mpfc)中的注射部位和下游基底外侧杏仁核(bla)处enphr3.0和earch3.0表达的共聚焦图像。标尺表示250μm和25μm。dapi染色(白色)描绘细胞体。(b)表达视蛋白的细胞和eyfp对照的平均输入电阻(n＝10-22)。(c)响应于60s5mwmm-2光脉冲的earch3.0和enphr3.0的代表性曲线和平均起始光电流(n＝8-10)。垂直和水平标尺分别表示400pa和10s。(d)在60s5mwmm-2光脉冲下通过earch3.0和enphr3.0生成的平均峰值超极化(n＝6-10)。(e)在表达enphr3.0或earch3.0的细胞中通过60s连续光而抑制在可靠放电(firing)细胞中因电流注射而诱发的尖峰。将细胞通过设置成为了实现大致匹配的超极化的光功率密度进行照射。垂直和水平标尺分别表示40mv和20s。(f)超极化幅值与细胞稳定性之间的关系。针对光诱发的超极化而作图的诱发尖峰的光照后恢复(相对于光照前的性能)以及静息电位的变化。所有群体数据均以平均值±s.e.m.作图。星号表示显著性水平：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。enphr3.0通过590nm光活化，而earch3.0通过560nm光活化。实施例2：盐生杜氏藻视蛋白的克隆和表征通常存在于高盐环境诸如蒸发盐田中，单细胞(具有两根鞭毛的卵形)绿藻盐生杜氏藻是耐盐的。尽管与绿藻莱茵衣藻(chlamydomonasreinhardtii)和团藻(volvoxcarteri)属于相同的目，但是杜氏藻可因蓄积高水平的类胡萝卜素分子而表现为略带红色(图3a)。我们假设杜氏藻chr可能具有不寻常的性质，并致力于从该生有鞭毛的藻种中克隆chr。尽管与其他已知chr的高度同源性，但是dchr1序列含有若干值得注意的特征(图3b)。首先，据认为有助于如上所述的chr2中的rsb的复杂抗衡离子e123的其中一个残基在dchr1tm3中被ala替代(图3b、c)；通过结构建模(图3c)，预计抗衡离子功能通过dchr1中的e309呈现，该位置在br(d212)或鱼腥藻(anabaena)感官视紫红质(asr)中仅发挥微弱的作用(vogeley等人,2004)。甚至更值得注意的是，dchr1光电流仅由质子携带，而不同于任何其他已知的chr，并且完全不受胞外阳离子组成的变化的影响(图3d)。因此，光电流对ph环境的变化高度敏感并在高ph下完全消失(图3e)。完整了解结构-功能关系将需要多种光循环状态中的高分辨率晶体结构。然而，此处的定点诱变研究证实了dchr1具有与其他已知的chr相比不同的抗衡离子布置和离子选择性。dchr1的严格h+选择性不由质子化视黄醛席夫碱(rsbh)抗衡离子介导，因为a178被存在于chr2中的更典型的推定抗衡离子glu取代只是使活化谱发生了红移(图3f，从475到510nm)，而对电流幅值或动力学的影响甚微。相似地，用asp替代e309导致了轻微的谱偏移和轻微的电流增加，而通过ala替代带电的e309使蛋白几乎完全失活(图3f)。鉴于典型的电化学质子梯度，dchr1h+电流方向与通过细菌视紫红质(br)泵活性产生的h+电流的方向相反；因此，dchr1和br可以使得能够进行干预，诸如对细胞ph的双向控制，例如在操纵细胞内区室(线粒体和突触囊泡)的ph中。dchr1因此限定一类新的微生物视蛋白：光活化的质子通道，其不同于任何其他微生物视蛋白(包括chr1和chr2)。这些发现表明了可能存在于大量微生物视蛋白基因组中的功能的多样性。图3.得自盐生杜氏藻的紫红质通道蛋白的表征。a.嗜盐单细胞藻盐生杜氏藻。b.藻紫红质通道蛋白与br在第三跨膜螺旋内的序列同源性。通常保守的e123位置在dchr1中被ala替代(并在黄色背景上显示)，保守的残基在蓝色背景上显示，并且可能与发色团相互作用的氨基酸以红色显示。c.与br和南极冰藻chr2(cchr2)相比，在dchr1中缺乏质子受体。asr(鱼腥藻感官视紫红质)已通过视为覆盖物的全反式视黄醛的混合物结晶(vogeley等人,2004)。d.dchr1光电流不受细胞外阳离子组成(在类别x轴上显示的各条件中存在的唯一阳离子)的变化的影响。在5mmmops-nmg、0.1mmmgcl2与100mmlicl、kcl、nacl、氯化胍或nmg氯化物(ph7.5)中进行了阳离子交换。我们使用了人类密码子适应dchr序列(氨基酸残基1-339)作为通过t7rna聚合酶(mmessagemmachine,ambion)合成加帽rna的模板。如前人所述(berthold等人,2008)进行了卵母细胞制备、加帽rna注射，并通过turbotec-05(npielectronic)或geneclamp500(moleculardevices)放大器在注射加帽rna3-7天后对卵母细胞进行了双电极电压钳。连续光由75-w氙灯(jenainstruments)提供，并经由3-mm光导递送到卵母细胞。光以46mw/cm2的强度通过50025-nm宽带滤光片(balzers)。e.相比之下，dchr1光电流对ph环境的变化高度敏感。溶液含有100mmnmg-氯化物、0.1mmmgcl2、0.1mmcacl2与5mm甘氨酸(ph9.0)、5mmmops-nmg(ph7.5)、5mm柠檬酸盐(ph6,5.5,5.0,4.6,4.2)。f.将质子受体(a178e或e309d)引入dchr1视黄醛结合口袋或改变质子受体导致吸收光谱的明显红移。我们如前人所述(berthold等人2008)施加了10-ns激光闪光；用于记录作用谱的溶液含有100mmnacl、0.1mmmgcl2、0.1mmcacl2和5mm柠檬酸盐(ph4.2)。编码盐生杜氏藻dchr1的核苷酸序列在图4中示出。对dchr1编码核苷酸序列针对哺乳动物表达进行了密码子优化；该密码子优化的核苷酸序列在图5中示出。图6提供了盐生杜氏藻dchr1的氨基酸序列。本发明涉及以下实施方式：1.一种分离的多肽，包含与图6所示的氨基酸序列具有至少约85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。2.一种分离的多核苷酸，包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与图6所示的氨基酸序列具有至少约85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。3.一种重组载体，包含根据实施方式2所述的多核苷酸。4.一种经遗传修饰的细胞，包含根据实施方式3所述的重组载体。5.一种分离的变体视蛋白多肽，以从氨基末端到羧基末端的顺序包含：a)与图8a所示的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；和b)内质网(er)输出信号。6.根据实施方式5所述的多肽，其中所述er输出信号包含氨基酸序列vxxsl，其中x为任何氨基酸；或fxyene(seqidno:4)，其中x为任何氨基酸。7.根据实施方式5所述的多肽，其中所述多肽还包含设置在(a)与(b)之间的荧光蛋白。8.根据实施方式5所述的多肽，其中所述多肽还包含运输序列，所述运输序列包含与选自以下的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：mdyggalsavgrellfvtnpvvvngs(seqidno:6)、maghsnsmalfsfsllwlcsgvlgtef(seqidno:7)、mglralmlwllaaaglvreslqg(seqidno:8)、mrgtplllvvslfsllqd(seqidno:9)和ksritsegeyipldqidinv(seqidno:10)；其中所述运输序列设置在(a)与(b)之间。9.根据实施方式5所述的多肽，其中所述多肽包含与图7a或7b所示的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。10.一种分离的变体视蛋白多肽，以从氨基末端到羧基末端的顺序包含：a)与图9a所示的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；和b)内质网(er)输出信号。11.根据实施方式10所述的多肽，其中所述er输出信号包含氨基酸序列vxxsl，其中x为任何氨基酸；或fxyene(seqidno:4)，其中x为任何氨基酸。12.根据实施方式10所述的多肽，其中所述多肽还包含设置在(a)与(b)之间的荧光蛋白。13.根据实施方式10所述的多肽，其中所述多肽还包含与选自以下的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：mdyggalsavgrellfvtnpvvvngs(seqidno:6)、maghsnsmalfsfsllwlcsgvlgtef(seqidno:7)、mglralmlwllaaaglvreslqg(seqidno:8)、mrgtplllvvslfsllqd(seqidno:9)和ksritsegeyipldqidinv(seqidno:10)；其中所述运输序列设置在(a)与(b)之间。14.根据实施方式10所述的多肽，其中所述多肽包含与图7c所示的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。15.一种分离的变体视蛋白多肽，以从氨基末端到羧基末端的顺序包含：a)与图10a所示的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；和b)内质网(er)输出信号。16.根据实施方式15所述的多肽，其中所述er输出信号包含氨基酸序列vxxsl，其中x为任何氨基酸；或fxyene(seqidno:4)，其中x为任何氨基酸。17.根据实施方式15所述的多肽，其中所述多肽还包含设置在(a)与(b)之间的荧光蛋白。18.根据实施方式15所述的多肽，其中所述多肽还包含与选自以下的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：mdyggalsavgrellfvtnpvvvngs(seqidno:6)、maghsnsmalfsfsllwlcsgvlgtef(seqidno:7)、mglralmlwllaaaglvreslqg(seqidno:8)、mrgtplllvvslfsllqd(seqidno:9)和ksritsegeyipldqidinv(seqidno:10)；其中所述运输序列设置在(a)与(b)之间。19.根据实施方式15所述的多肽，其中所述多肽包含与图7d或图7e所示的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。20.一种分离的多核苷酸，包含编码根据实施方式5、实施方式10或实施方式15所述的多肽的变体视蛋白的核苷酸序列。21.根据实施方式20所述的多核苷酸，其中所述变体视蛋白编码核苷酸可操作地连接到允许神经元选择性表达的启动子。22.一种重组表达载体，包含根据实施方式20所述的分离的多核苷酸。23.一种哺乳动物细胞，包含在细胞膜上表达的光激活多肽，其中所述蛋白对光有响应，其中所述蛋白能够在细胞受到光照时介导所述细胞中的超极化电流，并且其中所述光激活多肽以从氨基末端到羧基末端的顺序包含：a)与图8a所示的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；和b)内质网(er)输出信号。24.根据实施方式23所述的哺乳动物细胞，其中所述细胞为神经元细胞。25.根据实施方式23所述的哺乳动物细胞，其中所述er输出信号包含氨基酸序列vxxsl，其中x为任何氨基酸；或fxyene(seqidno:4)，其中x为任何氨基酸。26.根据实施方式23所述的哺乳动物细胞，其中所述多肽还包含设置在(a)与(b)之间的荧光蛋白。27.根据实施方式23所述的哺乳动物细胞，其中所述多肽还包含与选自以下的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：mdyggalsavgrellfvtnpvvvngs(seqidno:6)、maghsnsmalfsfsllwlcsgvlgtef(seqidno:7)、mglralmlwllaaaglvreslqg(seqidno:8)、mrgtplllvvslfsllqd(seqidno:9)和ksritsegeyipldqidinv(seqidno:10)；其中所述运输序列设置在(a)与(b)之间。28.根据实施方式23所述的哺乳动物细胞，其中所述多肽包含与图7a或7b所示的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。29.一种哺乳动物细胞，包含在细胞膜上表达的光激活多肽，其中所述蛋白对光有响应，其中所述蛋白能够在细胞受到光照时介导所述细胞中的超极化电流，并且其中所述光激活多肽以从氨基末端到羧基末端的顺序包含：a)与图9a所示的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；和b)内质网(er)输出信号。30.根据实施方式29所述的哺乳动物细胞，其中所述细胞为神经元。31.根据实施方式29所述的哺乳动物细胞，其中所述er输出信号包含氨基酸序列vxxsl，其中x为任何氨基酸；或fxyene(seqidno:4)，其中x为任何氨基酸。32.根据实施方式29所述的哺乳动物细胞，其中所述多肽还包含设置在(a)与(b)之间的荧光蛋白。33.根据实施方式29所述的哺乳动物细胞，其中所述多肽还包含与选自以下的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：mdyggalsavgrellfvtnpvvvngs(seqidno:6)、maghsnsmalfsfsllwlcsgvlgtef(seqidno:7)、mglralmlwllaaaglvreslqg(seqidno:8)、mrgtplllvvslfsllqd(seqidno:9)和ksritsegeyipldqidinv(seqidno:10)；其中所述运输序列设置在(a)与(b)之间。34.根据实施方式29所述的哺乳动物细胞，其中所述多肽包含与图7c所示的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。35.一种哺乳动物细胞，包含在细胞膜上表达的光激活多肽，其中所述蛋白对光有响应，其中所述蛋白能够在细胞受到光照时介导所述细胞中的超极化电流，并且其中所述光激活多肽以从氨基末端到羧基末端的顺序包含：a)与图10a所示的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；和b)内质网(er)输出信号。36.根据实施方式35所述的哺乳动物细胞，其中所述细胞为神经元。37.根据实施方式35所述的哺乳动物细胞，其中所述er输出信号包含氨基酸序列vxxsl，其中x为任何氨基酸；或fxyene(seqidno:4)，其中x为任何氨基酸。38.根据实施方式35所述的哺乳动物细胞，其中所述多肽还包含设置在(a)与(b)之间的荧光蛋白。39.根据实施方式35所述的哺乳动物细胞，其中所述多肽还包含与选自以下的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：mdyggalsavgrellfvtnpvvvngs(seqidno:6)、maghsnsmalfsfsllwlcsgvlgtef(seqidno:7)、mglralmlwllaaaglvreslqg(seqidno:8)、mrgtplllvvslfsllqd(seqidno:9)和ksritsegeyipldqidinv(seqidno:10)；其中所述运输序列设置在(a)与(b)之间。40.根据实施方式35所述的哺乳动物细胞，其中所述多肽包含与图7d或图7e所示的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。41.一种响应于光刺激调节细胞电压电位的方法，所述方法包括暴露用根据实施方式22所述的重组表达载体进行了遗传修饰的细胞，其中编码的变体视蛋白在所述细胞中表达，并且其中对暴露于光刺激作出响应，所述细胞的电压电位得以调节。42.根据实施方式41所述的方法，其中所述细胞为神经元细胞。43.根据实施方式41所述的方法，其中所述细胞在体外。44.根据实施方式41所述的方法，其中所述细胞在体内的。参考文献1.deisseroth,k.optogenetics.natmethods8,26-29(2011).2.deisseroth,k.controllingthebrainwithlight.sciam303,48-55(2010).3.fenno,l.,yizhar,o.&deisseroth,k.thedevelopmentandapplicationofoptogenetics.annurevneurosci34,389-412(2011).4.yizhar,o.,fenno,l.e.,davidson,t.j.,mogri,m.&deisseroth,k.optogeneticsinneuralsystems.neuron71,9-34(2011).5.wang,c.,kane,m.a.&napoli,j.l.multipleretinolandretinaldehydrogenasescatalyzeall-trans-retinoicacidbiosynthesisinastrocytes.jbiolchem286,6542-6553(2011).6.boyden,e.s.,zhang,f.,bamberg,e.,nagel,g.&deisseroth,k.millisecond-timescale,geneticallytargetedopticalcontrolofneuralactivity.natneurosci8,1263-1268(2005).7.li,x.etal.fastnoninvasiveactivationandinhibitionofneuralandnetworkactivitybyvertebraterhodopsinandgreenalgaechannelrhodopsin.procnatlacadsciusa102,17816-17821(2005).8.bi,a.etal.ectopicexpressionofamicrobial-typerhodopsinrestoresvisualresponsesinmicewithphotoreceptordegeneration.neuron50,23-33(2006).9.ishizuka,t.,kakuda,m.,araki,r.&yawo,h.kineticevaluationofphotosensitivityingeneticallyengineeredneuronsexpressinggreenalgaelight-gatedchannels.neuroscires54,85-94(2006).10.nagel,g.etal.lightactivationofchannelrhodopsin-2inexcitablecellsofcaenorhabditiseleganstriggersrapidbehavioralresponses.currbiol15,2279-2284(2005).11.yizhar,o.etal.neocorticalexcitation/inhibitionbalanceininformationprocessingandsocialdysfunction.nature(2011).12.gradinaru,v.etal.targetingandreadoutstrategiesforfastopticalneuralcontrolinvitroandinvivo.jneurosci27,14231-14238(2007).13.gunaydin,l.a.etal.ultrafastoptogeneticcontrol.natneurosci13,387-392(2010).14.berndt,a.etal.high-efficiencychannelrhodopsinsforfastneuronalstimulationatlowlightlevels.procnatlacadsciusa(2011).15.berndt,a.,yizhar,o.,gunaydin,l.a.,hegemann,p.&deisseroth,k.bistableneuralstateswitches.natneurosci12,229-234(2009).16.kleinlogel,s.etal.ultralight-sensitiveandfastneuronalactivationwiththeca(2+)-permeablechannelrhodopsincatch.natneurosci14,513-518(2011).17.zhang,f.etal.red-shiftedoptogeneticexcitation:atoolforfastneuralcontrolderivedfromvolvoxcarteri.natneurosci11,631-633(2008).18.govorunova,e.g.,spudich,e.n.,lane,c.e.,sineshchekov,o.a.&spudich,j.l.newchannelrhodopsinwithared-shiftedspectrumandrapidkineticsfrommesostigmaviride.mbio2,e00115-00111(2011).19.lin,j.y.,lin,m.z.,steinbach,p.&tsien,r.y.characterizationofengineeredchannelrhodopsinvariantswithimprovedpropertiesandkinetics.biophysj96,1803-1814(2009).20.wang,h.etal.moleculardeterminantsdifferentiatingphotocurrentpropertiesoftwochannelrhodopsinsfromchlamydomonas.jbiolchem284,5685-5696(2009).21.wen,l.etal.opto-current-clampactuationofcorticalneuronsusingastrategicallydesignedchannelrhodopsin.plosone5,e12893(2010).22.stehfest,k.&hegemann,p.evolutionofthechannelrhodopsinphotocyclemodel.chemphyschem11,1120-1126.23.bamann,c.,kirsch,t.,nagel,g.&bamberg,e.spectralcharacteristicsofthephotocycleofchannelrhodopsin-2anditsimplicationforchannelfunction.jmolbiol375,686-694(2008).24.sugiyama,y.etal.photocurrentattenuationbyasinglepolar-to-nonpolarpointmutationofchannelrhodopsin-2.photochemphotobiolsci8,328-336(2009).25.hedrick,t.&waters,t.h.spikingpatternsofneocorticall5pyramidalneuronsinvitrochangewithtemperature.frontcellneurosci5,1(2011).26.lin,j.y.auser'sguidetochannelrhodopsinvariants:features,limitationsandfuturedevelopments.expphysiol(2010).27.cardin,j.a.etal.drivingfast-spikingcellsinducesgammarhythmandcontrolssensoryresponses.nature459,663-667(2009).28.sohal,v.s.,zhang,f.,yizhar,o.&deisseroth,k.parvalbuminneuronsandgammarhythmsenhancecorticalcircuitperformance.nature459,698-702(2009).29.tsai,h.c.etal.phasicfiringindopaminergicneuronsissufficientforbehavioralconditioning.science324,1080-1084(2009).30.atasoy,d.,aponte,y.,su,h.h.&sternson,s.m.aflexswitchtargetschannelrhodopsin-2tomultiplecelltypesforimagingandlong-rangecircuitmapping.jneurosci28,7025-7030(2008).31.chater,t.e.,henley,j.m.,brown,j.t.&randall,a.d.voltage-andtemperature-dependentgatingofheterologouslyexpressedchannelrhodopsin-2.jneuroscimethods193,7-13(2010).32.zhang,f.etal.multimodalfastopticalinterrogationofneuralcircuitry.nature446,633-639(2007).33.gradinaru,v.etal.molecularandcellularapproachesfordiversifyingandextendingoptogenetics.cell141,154-165(2010).34.han,x.&boyden,e.s.multiple-coloropticalactivation,silencing,anddesynchronizationofneuralactivity,withsingle-spiketemporalresolution.plosone2,e299(2007).35.witten,i.b.etal.cholinergicinterneuronscontrollocalcircuitactivityandcocaineconditioning.science330,1677-1681(2010).36.stuber,g.d.etal.excitatorytransmissionfromtheamygdalatonucleusaccumbensfacilitatesrewardseeking.nature475,377-380(2011).37.tye,k.m.etal.amygdalacircuitrymediatingreversibleandbidirectionalcontrolofanxiety.nature471,358-362(2011).38.goshen,i.,brodsky,m.,prakash,r.&deisseroth,k.cell(2011).39.gradinaru,v.,thompson,k.r.&deisseroth,k.enphr:anatronomonashalorhodopsinenhancedforoptogeneticapplications.braincellbiol36,129-139(2008).40.chow,b.y.etal.high-performancegeneticallytargetableopticalneuralsilencingbylight-drivenprotonpumps.nature463,98-102(2010).41.han,x.etal.ahigh-lightsensitivityopticalneuralsilencer:developmentandapplicationtooptogeneticcontrolofnon-humanprimatecortex.front.syst.neurosci.5(2011).42.zimmermann,d.etal.effectsoncapacitancebyoverexpressionofmembraneproteins.biochembiophysrescommun369,1022-1026(2008).43.zhao,y.etal.anexpandedpaletteofgeneticallyencodedca(2)indicators.science333,1888-1891(2011).44.goto,y.&o'donnell,p.networksynchronyinthenucleusaccumbensinvivo.jneurosci21,4498-4504(2001).45.sanchez-vives,m.v.&mccormick,d.a.cellularandnetworkmechanismsofrhythmicrecurrentactivityinneocortex.natneurosci3,1027-1034(2000).46.nagel,g.etal.channelrhodopsin-2,adirectlylight-gatedcation-selectivemembranechannel.procnatlacadsciusa100,13940-13945(2003).47.goold,c.p.&nicoll,r.a.single-celloptogeneticexcitationdriveshomeostaticsynapticdepression.neuron68,512-528(2010).48.lindsay,t.h.,thiele,t.r.&lockery,s.r.optogeneticanalysisofsynaptictransmissioninthecentralnervoussystemofthenematodecaenorhabditiselegans.natcommun2,306(2011).49.taylor,c.p.&dudek,f.e.synchronousneuralafterdischargesinrathippocampalsliceswithoutactivechemicalsynapses.science218,810-812(1982).50.ren,j.etal.habenula"cholinergic"neuronsco-releaseglutamateandacetylcholineandactivatepostsynapticneuronsviadistincttransmissionmodes.neuron69,445-452(2011).虽然已参照本发明的具体实施方案对本发明进行了描述，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明的实质和范围的情况下可作出多种变化并可替代等同形式。此外，可作出许多修改以使特定的情形、材料、物质组合物、工艺、一个或多个工艺步骤或目标适应本发明的目标、精神和范围。所有此类修改均旨在落在所附权利要求书的范围内。序列表<110>deisseroth,karla.zhang,feng<120>视蛋白多肽及其使用方法<130>stan-896wo<150>61/576,858<151>2011-12-16<160>35<170>patentin3.5版<210>1<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>合成序列<400>1vallysgluserleu15<210>2<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>合成序列<400>2valleuglyserleu15<210>3<211>16<212>prt<213>人工序列<220><223>合成序列<400>3asnalaasnserphecystyrgluasngluvalalaleuthrserlys151015<210>4<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>合成序列<220><221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>xaa可以为任何天然存在的氨基酸<400>4phexaatyrgluasnglu15<210>5<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>合成序列<400>5phecystyrgluasngluval15<210>6<211>26<212>prt<213>人工序列<220><223>合成序列<400>6metasptyrglyglyalaleuseralavalglyarggluleuleuphe151015valthrasnprovalvalvalasnglyser2025<210>7<211>27<212>prt<213>人工序列<220><223>合成序列<400>7metalaglyhisserasnsermetalaleupheserpheserleuleu151015trpleucysserglyvalleuglythrgluphe2025<210>8<211>23<212>prt<213>人工序列<220><223>合成序列<400>8metglyleuargalaleumetleutrpleuleualaalaalaglyleu151015valarggluserleuglngly20<210>9<211>18<212>prt<213>人工序列<220><223>合成序列<400>9metargglythrproleuleuleuvalvalserleupheserleuleu151015glnasp<210>10<211>20<212>prt<213>人工序列<220><223>合成序列<400>10lysserargilethrsergluglyglutyrileproleuaspglnile151015aspileasnval20<210>11<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>合成序列<400>11gtggcgcgccctattacttgtacagctcgtccatg35<210>12<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223>合成序列<400>12tatgctagccaccatggactatggcggcgc3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